Область техники, к которой относится изобретение
Настоящая заявка относится к области биомедицины, в частности к мутанту рекомбинантного иммуномодулирующего белка Ganoderma lucidum (мутант rLZ-8) и его применению при лечении опухоли.
Уровень техники
Иммуномодулирующий белок Ganoderma lucidum (LZ-8) был выделен и очищен из экстракта мицелия Ganoderma lucidum Kino с соавт. в 1989 году. Выделенный LZ-8 включает 1,3% полисахарида, обладающего митогенной активностью in vitro и иммуномодулирующей активностью in vivo. В то же время LZ-8 оказывает агглютинирующее действие на эритроциты овец, но не на человеческие эритроциты (групп A, B, AB и O). В исследованиях in vivo было обнаружено, что LZ-8 предотвращал возникновение системной аллергической реакции у мышей при повторном введении.
Рекомбинантный иммуномодулирующий белок Ganoderma lucidum (rLZ-8) получен с помощью технологии рекомбинации генов. По сравнению с природным иммуномодулирующим белком Ganoderma lucidum он имеет такую же аминокислотную последовательность и аналогичную активность, но не содержит полисахарид. Исследования показали, что rLZ-8 может не только быстро и эффективно вызвать апоптоз множества опухолевых клеток, но также может эффективно убивать опухолевые клетки с сохранением или повышением уровня лейкоцитов в модели опухоли на мышах in vivo. Кроме того, применение rLZ-8 для лечения фиброза ткани, очаговой ишемии головного мозга, тромбоцитопении, остеопороза и сердечной недостаточности и т.п. также было опубликовано и запатентовано.
Мутант рекомбинантного иммуномодулирующего белка Ganoderma lucidum (мутант rLZ-8) получен в результате мутации одной или больше аминокислот rLZ-8. Исследования механизма показали, что мутант rLZ-8 может связываться с рецептором эпидермального фактора роста (EGFR) на поверхности клеток человека для интернализации в клетку и сохраняться в клетке из-за неспособности к деградации. Затем он блокирует циркуляцию клеточной мембраны в результате высокоинтенсивной интернализации и, наконец, приводит к сморщиванию, разрыву и гибели клетки. Результаты анализа цитотоксичности для опухолевых клеток показали, что мутант rLZ-8 обладает более высокой цитотоксичностью для опухолевых клеток, чем rLZ-8. Результаты исследования BiaCore показали, что мутант rLZ-8 обладает более высокой аффинностью к EGFR; и результаты эксперимента с моделями ортотопической трансплантации опухолей на мышах с использованием множества человеческих раковых клеток показали, что мутант rLZ-8 превосходит rLZ-8 в отношении увеличения продожительности выживания и ингибирования роста опухоли у мышей.
Впрочем, несмотря на то, что rLZ-8 и мутант rLZ-8 демонстрируют противоопухолевое действие, они оба связаны с проблемой низкого уровня экспрессии белка и сложности промышленного производства. С другой стороны, при разработке лекарственных средств также немаловажно учитывать, являются ли молекулы белка безопасными для человека.
Сущность изобретения
В настоящей заявке предложен рекомбинантный белок, включающий спейсерный пептид и мутант рекомбинантного иммуномодулирующего белка Ganoderma lucidum (мутант rLZ-8), где по сравнению с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 10, аминокислотная последовательность мутанта rLZ-8 включает мутацию по меньшей мере одной аминокислоты. Рекомбинантный белок согласно настоящей заявке имеет по меньшей мере одну характеристику, выбранную из группы, состоящей из: (1) высокого уровня экспрессии и/или уровня секреции (например, в дрожжевой системе экспрессии); (2) высокой безопасности, соответствующей требованиям безопасности готовых лекарственных средств, например, прохождение доклинической оценки безопасности и/или получение лицензии на клиническое исследование; (3) легкости проникновения в клетку путем интернализации; и (4) ингибирования роста опухоли и высокой способности убивать опухолевые клетки.
В одном из аспектов настоящей заявки предложен рекомбинантный белок, включающий спейсерный пептид и мутант рекомбинантного иммуномодулирующего белка Ganoderma lucidum (мутант rLZ-8), где по сравнению с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 10, указанная аминокислотная последовательность указанного мутанта rLZ-8 включает мутацию по меньшей мере одной аминокислоты.
В некоторых вариантах осуществления указанный мутант rLZ-8 включает аминокислотную последовательность, как показано в любой из SEQ ID NO: 13 и 16-21.
В некоторых вариантах осуществления указанный мутант rLZ-8 включает аминокислотную последовательность, как показано в SEQ ID NO: 13.
В некоторых вариантах осуществления указанный спейсерный пептид включает 1-5 EA.
В некоторых вариантах осуществления указанный спейсерный пептид включает 2 EA.
В некоторых вариантах осуществления указанный спейсерный пептид включает аминокислотную последовательность, как показано в любой из SEQ ID NO: 8-9.
В некоторых вариантах осуществления указанный спейсерный пептид включает аминокислотную последовательность, как показано в SEQ ID NO:8.
В некоторых вариантах осуществления указанный спейсерный пептид расположен на N-конце указанного rLZ-8 или его мутанта.
В некоторых вариантах осуществления указанный рекомбинантный белок включает аминокислотную последовательность, как показано в любой из SEQ ID NO: 14, 15 и 22-33.
В некоторых вариантах осуществления указанный рекомбинантный белок включает аминокислотную последовательность, как показано в SEQ ID NO: 14.
В другом аспекте настоящей заявки предложена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая указанный рекомбинантный белок.
В другом аспекте настоящей заявки предложен вектор, включающий указанную выделенную молекулу нуклеиновой кислоты.
В другом аспекте настоящей заявки предложена клетка, включающая указанную выделенную молекулу нуклеиновой кислоты и/или указанный вектор.
В некоторых вариантах осуществления указанная клетка является эукариоцитом.
В некоторых вариантах осуществления указанная клетка является дрожжевой клеткой.
В другом аспекте настоящей заявки предложен полипептид, включающий указанный рекомбинантный белок.
В другом аспекте настоящей заявки предложен способ получения указанного рекомбинантного белка, включающий культивирование указанной клетки при условиях, которые обеспечивают экспрессию указанного рекомбинантного белка.
В другом аспекте настоящей заявки предложена фармацевтическая композиция, включающая указанный рекомбинантный белок, указанную выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, указанный вектор, указанный полипептид и/или клетку и, необязательно, фармацевтически приемлемый носитель.
В другом аспекте настоящей заявки предложен набор, включающий указанный рекомбинантный белок, указанный выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, указанный вектор, указанную клетку, указанный полипептид и/или указанную фармацевтическую композицию.
В другом аспекте настоящей заявки предложено устройство для доставки лекарственного средства, включающее указанный рекомбинантный белок, указанную выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, указанный вектор, указанную клетку, указанный полипептид и/или указанную фармацевтическую композицию.
В другом аспекте настоящей заявки предложен способ предотвращения, уменьшения или лечения опухоли, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту указанного рекомбинантного белка, указанной выделенной молекулы нуклеиновой кислоты, указанного вектора, указанной клетки, указанного полипептида и/или указанной фармацевтической композиции.
В другом аспекте настоящей заявки предложено применение указанного рекомбинантного белка, указанной выделенной молекулы нуклеиновой кислоты, указанного вектора, указанной клетки, указанного полипептида и/или указанной фармацевтической композиции в производстве лекарственного средства для лечения, уменьшения или лечения опухоли.
В другом аспекте настоящей заявки предложен указанный рекомбинантный белок, указанная выделенная молекула нуклеиновой кислоты, указанный вектор, указанная клетка, указанный полипептид и/или указанная фармацевтическая композиция для предотвращения, уменьшения или лечения опухоли.
В некоторых вариантах осуществления указанная опухоль включает несолидную опухоль.
В некоторых вариантах осуществления указанная опухоль включает солидную опухоль.
В некоторых вариантах осуществления указанная опухоль включает опухоль, имеющую экспрессию EGFR и/или аномальную экспрессию EGFR.
В некоторых вариантах осуществления указанная опухоль включает опухоль, связанную с мутацией EGFR. В некоторых вариантах осуществления указанная опухоль включает опухоль, связанную с мутацией BRAF. В некоторых вариантах осуществления указанная опухоль включает опухоль, связанную с мутацией KRAS. В некоторых вариантах осуществления указанная опухоль включает опухоль, связанную с мутацией HER2.
В некоторых вариантах осуществления указанная опухоль включает рак толстой и прямой кишки, рак легкого, рак печени, рак молочной железы, рак желудка, рак почки, рак мочевого пузыря, нейробластому, рак яичника, эпителиальную плоскоклеточную карциному и/или рак поджелудочной железы. Специалисты в данной области смогут с легкостью понять другие аспекты и преимущества настоящей заявки из подробного описания ниже. Следующее подробное описание только демонстрирует и описывает примеры осуществления настоящей заявки. Как будет очевидно для специалистов в данной области, настоящая заявка позволит специалистам в данной области внести модификации в раскрытые варианты осуществления без отступления из сущности и объема изобретения, включенного в настоящую заявку. Соответственно, сопровождающие чертежи и описание в настоящей заявке являются лишь иллюстративными, а не ограничивающими.
Краткое описание чертежей
Конкретные признаки изобретения, включенные в настоящую заявку, показаны в прилагаемой формуле изобретения. Обращаясь к иллюстративным вариантам осуществления, подробно описанным ниже, и к сопровождающим чертежам можно лучше понять признаки и преимущества изобретения, включенного в настоящую заявку. Сопровождающие чертежи кратко описаны ниже:
На ФИГ. 1 показаны результаты множества штаммов дрожжей, экспрессирующих rLZ-8 (SEQ ID NO: 10), где М: маркер; S: рабочий стандарт (1 мг/мл) EAEA+rLZ-8 мутанта (SEQ ID NO: 14); 1-11: rLZ-8 (SEQ ID NO: 10) - Штаммы 1-11.
На ФИГ. 2 показаны результаты множества штаммов дрожжей, экспрессирующих мутант rLZ-8 (SEQ ID NO: 13), где М: маркер; S: рабочий стандарт (1 мг/мл) EAEA+rLZ-8 мутанта (SEQ ID NO: 14); 1-11: мутант rLZ-8 (SEQ ID NO: 13) - Штаммы 1-11.
На ФИГ. 3 показаны результаты множества штаммов дрожжей, экспрессирующих рекомбинантный белок EAEA+rLZ-8 (SEQ ID NO: 11), где М: маркер; S: рабочий стандарт (0,5 мг/мл) rLZ-8 (SEQ ID NO: 10); 1-6: EAEA+rLZ-8 (SEQ ID NO: 11) - Штаммы 1-6.
На ФИГ. 4 показаны результаты множества штаммов дрожжей, экспрессирующих рекомбинантный белок EAEA+rLZ-8 мутанта (SEQ ID NO: 14), где М: маркер; S: стандарт (250 мг/л) rLZ-8 (SEQ ID NO: 10); 1-6: мутант EAEA+rLZ-8 (SEQ ID NO: 14) - Штаммы 1-6.
На ФИГ. 5 показаны результаты множества штаммов дрожжей, экспрессирующих рекомбинантный белок EEAEAEAEPK+rLZ-8 (SEQ ID NO: 12), где М: маркер; S: рабочий стандарт (1 мг/мл) EAEA+rLZ-8 мутанта (SEQ ID NO: 14),; 1-11: EEAEAEAEPK+rLZ-8 (SEQ ID NO: 12) - Штаммы 1-11.
На ФИГ. 6 показаны результаты множества штаммов дрожжей, экспрессирующих рекомбинантный белок мутанта EEAEAEAEPK+rLZ-8 (SEQ ID NO: 15), где М: маркер; S: рабочий стандарт (1 мг/мл) EAEA+rLZ-8 мутанта (SEQ ID NO: 14); 1-11: мутант rLZ-8 (SEQ ID NO: 15) - Штаммы 1-11.
На ФИГ. 7 показано сравнение результатов экспрессии рекомбинантных белков rLZ-8 или его мутанта, соединенных различными спейсерными пептидами, где М: маркер; S: рабочий стандарт (1 мг/мл) EAEA+rLZ-8 мутанта (SEQ ID NO: 14); 1: мутант rLZ-8 (SEQ ID NO: 13); 2: EAEA+ rLZ-8 мутант (SEQ ID NO: 14); 3: EEAEAEAEPK+ rLZ-8 мутант (SEQ ID NO: 15); 4: rLZ-8 (SEQ ID NO: 10); 5: EAEA+ rLZ-8 (SEQ ID NO: 11); 6: EEAEAEAEPK+ rLZ-8 (SEQ ID NO: 12).
На ФИГ. 8 показана кривая доза-эффект рекомбинантного белка, показанного в SEQ ID NO: 14, действующего на органоидную систему CR20035B.
На ФИГ. 9 показана кривая доза-эффект рекомбинантного белка, показанного в SEQ ID NO: 14, действующего на органоидную систему CR5043B.
На ФИГ. 10 показана кривая доза-эффект рекомбинантного белка, показанного в SEQ ID NO: 14, действующего на органоидную систему CR5082B.
На ФИГ. 11 показана кривая доза-эффект рекомбинантного белка, показанного в SEQ ID NO: 14, действующего на органоидную систему CR3099B.
На ФИГ. 12 показана кривая доза-эффект рекомбинантного белка, показанного в SEQ ID NO: 14, действующего на органоидную систему LU5162B.
На ФИГ. 13 показана кривая доза-эффект рекомбинантного белка, показанного в SEQ ID NO: 14, действующего на органоидную систему LU11624B.
На ФИГ. 14 показана кривая доза-эффект рекомбинантного белка, показанного в SEQ ID NO: 14, действующего на органоидную систему LU1235B.
На ФИГ. 15 показана кривая доза-эффект рекомбинантного белка, показанного в SEQ ID NO: 14, действующего на органоидную систему LI6677B.
На ФИГ. 16 показана кривая доза-эффект рекомбинантного белка, показанного в SEQ ID NO: 14, действующего на органоидную систему LI6669B.
На ФИГ. 17 показана кривая доза-эффект рекомбинантного белка, показанного в SEQ ID NO: 14, действующего на органоидную систему BR9457B.
На ФИГ. 18 показана кривая доза-эффект рекомбинантного белка, показанного в SEQ ID NO: 14, действующего на органоидную систему BR9466B.
На ФИГ. 19 показана кривая доза-эффект рекомбинантного белка, показанного в SEQ ID NO: 14, действующего на органоидную систему GA6833B.
На ФИГ. 20 показана кривая доза-эффект рекомбинантного белка, показанного в SEQ ID NO: 14, действующего на органоидную систему GA2434B.
На ФИГ. 21 показана кривая доза-эффект рекомбинантного белка, показанного в SEQ ID NO: 14, действующего на органоидную систему PA20078B.
На ФИГ. 22 показана кривая доза-эффект рекомбинантного белка, показанного в SEQ ID NO: 14, действующего на органоидную систему PA0787B.
На ФИГ. 23 показаны изменения выживаемости мышей в различных группах лечения и контрольной группе в модели с ортотопической трансплантацией опухоли печени человека LI6669.
На ФИГ. 24 показано цитотоксическое действие рекомбинантного белка мутанта rLZ-8 на линию клеток рака легкого А549.
На ФИГ. 25 показано сравнение результатов экспрессии рекомбинантных белков rLZ-8 или его мутанта, соединенных различными спейсерными пептидами, где М: маркер; 1: rLZ-8 мутант 4; 2: EAEA+ rLZ-8 мутант 4 (SEQ ID NO: 25); 3: EEAEAEAEPK+ rLZ-8 мутант 4 (SEQ ID NO: 31); 4: rLZ-8 мутант 5; 5: EAEA+ rLZ-8 мутант 5 (SEQ ID NO: 26); 6: EEAEAEAEPK+ rLZ-8 мутант 5 (SEQ ID NO: 32); 7: rLZ-8 6 мутант; 8: EAEA+ rLZ-8 мутант 6 (SEQ ID NO: 27); 9: EEAEAEAEPK+ rLZ-8 мутант 6 (SEQ ID NO: 33).
Подробное описание вариантов осуществления
Далее варианты осуществления изобретения в настоящей заявке описаны конкретными примерами. Специалисты в данной области смогут легко понять другие преимущества и эффекты изобретения, описанного в настоящей заявке, из раскрытия в описании.
Определения терминов
В настоящей заявке термин "рекомбинантный белок" обычно относится к белку, полученному с помощью технологии рекомбинации. Рекомбинантный белок может включать: (1) полусинтетический или синтетический полипептид, получаемый при комбинированной экспрессии молекул ДНК из разных источников, соединенных с помощью технологии рекомбинантных ДНК; (2) полипептид полусинтетического или синтетического происхождения, который не связан с молекулой, с которой полипептид связан в природном состоянии; (3) полипептид полусинтетического или синтетического происхождения, который соединен с другим полипептидом, отличающимся от тех, с которыми такой полипептид соединен в природном состоянии; или (4) полипептид полусинтетического или синтетического происхождения, который не существует в природном состоянии. Например, рекомбинантный белок может относиться к полипептиду, полученному при соединении спейсерного пептида настоящей заявки с мутантом рекомбинантного иммуномодулирующего белка Ganoderma lucidum (мутант rLZ-8).
В настоящей заявке термин "спейсерный пептид" обычно относится к любому олигопептиду или полипептиду, функция которого заключается в связывании любого домена. В настоящей заявке спейсерный пептид расположен на N-конце рекомбинантного иммуномодулирующего белка Ganoderma lucidum (rLZ-8). Например, спейсерный пептид может быть расположен между лидерным пептидом и рекомбинантным иммуномодулирующим белком Ganoderma lucidum (rLZ-8). Например, спейсерный пептид может быть частью сигнального пептида. Например, спейсерный пептид может способствовать секреции белка, соединенного с ним.
В настоящей заявке термин "иммуномодулирующий белок Ganoderma lucidum", также известный как LZ-8, LZ8, Ling Zhi-8 или белок 8 Ganoderma lucidum, в целом относится к иммуномодулирующему белку из Ganoderma lucidum. LZ-8 также включает аллельные варианты, варианты сплайсинга, производные варианты, варианты замещения, варианты делеции и/или варианты вставки (включающие добавление метионина на N-конец), слитые полипептиды и их межвидовые гомологи. В настоящей заявке LZ-8 может относиться к иммуномодулирующему белку из Ganoderma lucidum. В настоящей заявке термин "рекомбинантный иммуномодулирующий белок Ganoderma lucidum (rLZ-8)" обычно относится к LZ-8, полученному рекомбинантным способом. Например, аминокислотные последовательности LZ-8 и rLZ-8 можно найти в UniProtKB под номером доступа P14945. В настоящей заявке LZ-8 и rLZ-8 могут включать аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:10.
В настоящей заявке термин "мутант" в целом относится к последовательности, которая отличается от референсной последовательности в результате включения одного или более отличий. Референсная последовательность может быть аминокислотной последовательностью рекомбинантного иммуномодулирующего белка Ganoderma lucidum. Различия могут заключаться в делеции, вставке или, предпочтительно, замене аминокислоты (аминокислот). Мутант может иметь такие же или разные функции с референсной последовательностью.
В настоящей заявке термин "мутация аминокислоты" обычно охватывает замену, делецию, вставку и модификацию одной или больше аминокислот.
В настоящей заявке термин "ЕА" в целом относится к пептидному фрагменту, образованному в результате соединения глутаминовой кислоты (Е) с аланином (А) пептидной связью.
В настоящей заявке термин "выделенный" в целом относится к биоматериалу (например, вирусу, нуклеиновой кислоте или белку), по существу не содержащему какого-либо компонента, который обычно сопровождает его или взаимодействует с ним в природной среде.
В настоящей заявке термин "выделенная молекула нуклеиновой кислоты" в целом относится к геному, мРНК, кДНК или ДНК или РНК синтетического происхождения, или их комбинации, которые не связаны ни с одним или не связаны с частью полинуклеотидов, существующих в природе, или связаны с полинуклеотидом, с которым они не соединены в природе.
В настоящей заявке термин "вектор" в целом относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной к саморепликации в соответствующей клетке-хозяине, которая переносит встроенную молекулу нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина и/или между клетками-хозяевами. Вектор может включать вектор, используемый в основном для встраивания ДНК или РНК в клетку, вектор, используемый в основном для репликации ДНК или РНК, а также вектор, используемый в основном для экспрессии транскрипции и/или трансляции ДНК или РНК. Вектор также включает вектор, имеющий множество функций, перечисленных выше. Вектор может быть полинуклеотидом, который может транскрибироваться и транслироваться в полипептид при введении в соответствующую клетку-хозяина. Как правило, при культивировании соответствующей клетки-хозяина, включающей вектор, вектор может обеспечивать продукцию требуемого продукта экспрессии.
В настоящей заявке термин "клетка" в целом относится к отдельной клетке, линии клеток или культуре клеток, которая может включать или включала плазмиду или вектор, включающий молекулу нуклеиновой кислоты по настоящей заявке, или может экспрессировать антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящей заявке. Клетка может включать потомство отдельной клетки. Вследствие природной, случайной или преднамеренной мутации дочерние клетки не должны обязательно совпадать с исходными родительскими клетками по морфологии или геному, при условии, что они могут экспрессировать антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящей заявке. Клетка может быть получена путем трансфекции клетки in vitro вектором по настоящей заявке. Клетка может быть прокариотической клеткой (например, Escherichia coli), а также может быть эукариотической клеткой (например, дрожжевой клеткой, такой как клетка COS, клетка яичника китайского хомячка (CHO), клетка HeLa, клетка HEK293, клетка COS-1, клетка NS0 или миеломная клетка). В некоторых случаях клетка может быть клеткой млекопитающего. Например, клетка млекопитающего может быть клеткой CHO-K1. В настоящей заявке термин "рекомбинантная клетка" в целом относится к клетке, в которую введен рекомбинантный вектор экспрессии. Рекомбинантная клетка-хозяин включает не только конкретную клетку, но также включает потомство такой клетки.
В настоящей заявке термин "набор" в целом относится к упакованному продукту, включающему компоненты для введения рекомбинантного белка по настоящей заявке для лечения нарушений с экспрессией EGFR и/или аномальной экспрессией EGFR. Компоненты набора включены в отдельные флаконы (то есть набор содержит отдельные компоненты) или представлены в одном флаконе. Набор может включать такое вещество, как буфер, стабилизированное белком средство, систему генерации сигнала (например, систему генерации флуоресцентного сигнала), антитело, контрольный белок и тестовый сосуд. Набор может дополнительно включать инструкцию по выполнению способа.
В настоящей заявке термин "устройство для доставки лекарственного средства" включает: (i) инфузионный модуль для введения субъекту фармацевтической композиции, включающей активный ингредиент; (ii) фармацевтическую композицию для инфузии, включающую активный ингредиент, выбранный из группы, состоящей из: рекомбинантного белка, молекулы нуклеиновой кислоты, клетки, вектора или их комбинации; и (iii) необязательно, модуль для мониторинга эффективности лекарственного средства.
В настоящей заявке термин "опухоль" в целом относится к любому росту и пролиферации неопластических клеток (как злокачественных, так и доброкачественных), а также к любым предраковым и раковым клеткам и тканям. Опухоль может включать солидную опухоль и/или несолидную опухоль (например, гематологическую опухоль или лимфому).
В настоящей заявке термин "фармацевтически приемлемый носитель" в целом включает фармацевтически приемлемый вектор, вспомогательное вещество или стабилизатор, которые нетоксичны для клеток или млекопитающих, подвергшихся их воздействию в используемой дозе и концентрации. Как правило, физиологически приемлемый вектор представляет собой водный pH-буферный раствор. Примеры физиологически приемлемого вектора могут включать буферы, антиоксиданты, полипептиды с более низкой молекулярной массой (меньше чем приблизительно 10 остатков), белки, гидрофильные полимеры, аминокислоты, моносахариды, дисахариды и другие углеводы, хелатообразователи, сахароспирты, солеобразующие противоионы, такие как натрий; и/или неионогенные поверхностно-активные вещества.
В настоящей заявке термин "лечить/лечение" обычно относится к клиническому вмешательству, которое, предположительно, сможет изменить естественное течение заболевания у лица, подлежащего лечению, и может использоваться для предупреждения или может выполняться во время клинического патологического процесса. Требуемые терапевтические эффекты включают, без ограничения, предотвращение возникновения или повторного возникновения заболевания, облегчение симптомов, ослабление любых прямых или непрямых патологических последствий заболевания, предотвращение метастаза, снижение скорости прогрессирования заболевания, уменьшение или облегчение патологических состояний, а также смягчение или улучшение прогноза. В некоторых случаях рекомбинантный вектор по настоящей заявке может применяться для задержки развития заболевания или облегчения прогрессирования заболевания.
В настоящей заявке термин "вводить/введение" в целом относится к способу введения некоторой дозы соединения (например, противоопухолевого терапевтического средства) или фармацевтической композиции (например, фармацевтической композиции, включающей противоопухолевое терапевтическое средство) субъекту (например, пациенту). Введение могут производить любым подходящим способом, включая парентеральное, внутрилегочное, интраназальное и (если необходимо при местном лечении) внутриочаговое введение. Парентеральная инфузия включает, например, внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное или подкожное введение.
Помимо конкретных белков и нуклеотидов, указанных в настоящем документе, настоящая заявка может дополнительно включать их функциональные варианты, производные, аналоги, гомологи или фрагменты.
Термин "функциональный вариант" относится к полипептиду, который имеет аминокислотную последовательность, которая по существу гомологична природной последовательности или кодируется нуклеотидной последовательностью, которая по существу гомологична природной последовательности, и обладает одной или больше активностями природной последовательности. В контексте настоящей заявки вариант любой конкретной последовательности относится к последовательности, в которой конкретная последовательность остатков (аминокислотных остатков или нуклеотидных остатков) была модифицирована таким образом, что полипептид или полинуклеотид по существу сохраняют по меньшей мере одну эндогенную функция. Вариантная последовательность может быть получена в результате добавления, делеции, замены, модификации, замещения и/или изменения по меньшей мере одного аминокислотного остатка и/или нуклеотидного остатка, присутствующего в природном белке и/или полинуклеотиде, при условии, что может сохраняться исходная Функциональная активность.
В настоящей заявке термин "производное" в целом относится к любой замене, вариации, модификации, замещению, делеции и/или добавлению одного (или больше) аминокислотного(ых) остатка(ов) или нуклеотидного(ых) остатка(ов) в полипептид или полинуклеотид по настоящей заявке, при условии, что полученный полипептид или полинуклеотид по существу сохраняет по меньшей мере одну эндогенную функцию. В настоящей заявке, в отношении полипептида или полинуклеотида, термин "аналог" обычно включает любой миметик полипептида или полинуклеотида, то есть химическое соединение, имеющее по меньшей мере одну эндогенную функцию полипептида или полинуклеотида, имитируемую миметиком. Как правило, аминокислотная замена, например, по меньшей мере 1 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20 или больше) аминокислотная замена, может быть сделана при условии, что модифицированная последовательность по существу сохраняет нужную активность или способность. Аминокислотная замена может включать использование миметика, который не существует в природе.
Белок и полипептид для применения в настоящей заявке также могут иметь делецию, вставку или замену аминокислотного остатка, что приводит к молчащему изменению и образованию функционально эквивалентного белка. Преднамеренная аминокислотная замена может быть сделана в соответствии с подобием полярности, заряда, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатичности остатков, при условии, что может сохраняться эндогенная функция(и). Например, отрицательно заряженные аминокислоты включают аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту; положительно заряженные аминокислоты включают лизин и аргинин, а аминокислоты, которые обладают сходными гидрофильными свойствами, но не имеют каких-либо электрополярных концевых групп, включают аспарагин, глутамин, серин, треонин и тирозин.
В настоящей заявке термин "гомолог" обычно относится к аминокислотной последовательности или нуклеотидной последовательности, имеющей некоторую гомологию с аминокислотной последовательностью дикого типа или нуклеотидной последовательностью дикого типа. Термин "гомология" может быть приравнен к "идентичности" последовательностей. Гомогенная последовательность может включать аминокислотную последовательность, содержащую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8% или 99,9% рассматриваемой последовательности. Как правило, гомологи будут включать те же активные сайты, что и рассматриваемая аминокислотная последовательность. Гомология может рассматриваться в соответствии с подобием (то есть аминокислотными остатками с подобными химическими свойствами/функциями) или гомология может быть выражена через гомологию последовательностей. В настоящей заявке указанная последовательность с процентом гомологии с любой из аминокислотных последовательностей или нуклеотидных последовательностей в SEQ ID NO относится к последовательности с процентом гомологии по всей длине SEQ ID NO, как указано.
Выравнивание последовательностей может быть выполнено для определения гомологии последовательностей, которое может быть выполнено различными методами, известными специалистам в данной области, например, при использовании программ BLAST, BLAST-2, ALIGN, NEEDLE или Megalign (DNASTAR) и т.п. Специалисты в данной области техники могут определить подходящие параметры для выравнивания, включая любые алгоритмы, требуемые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей.
В настоящей заявке термин "и/или" можно понимать как означающий один или оба варианта.
В настоящей заявке термин "включает/включать/включающий" обычно относится к включению прямо указанных признаков, но не к исключению других элементов.
В настоящей заявке термин "приблизительно" обычно относится к отклонению в пределах 0,5%-10% от указанного значения, например, отклонению в пределах 0,5%, 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3%, 3,5. %, 4%, 4,5%, 5%, 5,5%, 6%, 6,5%, 7%, 7,5%, 8%, 8,5%, 9%, 9,5% или 10% от указанного значения.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Рекомбинантный белок
В одном из аспектов настоящей заявки предложен рекомбинантный белок, включающий спейсерный пептид и мутант рекомбинантного иммуномодулирующего белка Ganoderma lucidum (rLZ-8), где rLZ-8 может включать аминокислотную последовательность, как показано в SEQ ID NO: 10. В настоящей заявке rLZ-8 может включать аминокислотную последовательность, обладащую по меньшей мере 80% (например, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или более) гомологией с аминокислотной последовательностью, как показано в SEQ ID NO: 10.
В одном аспекте настоящая заявка относится к рекомбинантному белку, включающему спейсерный пептид и мутант рекомбинантного иммуномодулирующего белка Ganoderma lucidum (мутант rLZ-8), где по сравнению с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 10, аминокислотная последовательность мутанта rLZ-8 может включать по меньшей мере одну аминокислотную мутацию.
В настоящей заявке рекомбинантный белок содержит спейсерный пептид и мутант рекомбинантного иммуномодулирующего белка Ganoderma lucidum (мутант rLZ-8), где по сравнению с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 10, аминокислотная последовательность мутанта rLZ-8 может включать одну аминокислотную мутацию.
В настоящей заявке рекомбинантный белок включает спейсерный пептид и мутант рекомбинантного иммуномодулирующего белка Ganoderma lucidum (мутант rLZ-8), где по сравнению с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 10, аминокислотная последовательность мутанта rLZ-8 может включать две аминокислотных мутации.
В настоящей заявке рекомбинантный белок включает спейсерный пептид и мутант рекомбинантного иммуномодулирующего белка Ganoderma lucidum (мутант rLZ-8), где по сравнению с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 10, аминокислотная последовательность мутанта rLZ-8 может включать одну аминокислотную мутацию, расположенную в положении аминокислоты, выбранном из группы, состоящей из: R9, L17, D20, D70, K46 и K74. Например, одна аминокислотная мутация может быть расположена в положении аминокислоты, выбранном из группы, состоящей из: D70, L17, K74 и K46.
В настоящей заявке аминокислотной мутацией в положении L17 может быть L17K.
В настоящей заявке аминокислотной мутацией в положении D70 может быть D70K.
В настоящей заявке аминокислотной мутацией в положении K46 может быть K46E.
В настоящей заявке аминокислотной мутацией в положении K74 может быть K74E.
В настоящей заявке аминокислотной мутацией в положении D20 может быть D20H.
В настоящей заявке аминокислотной мутацией в положении R9 может быть R9A.
В настоящей заявке рекомбинантный белок включает спейсерный пептид и мутант рекомбинантного иммуномодулирующего белка Ganoderma lucidum (мутант rLZ-8), где по сравнению с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 10, аминокислотная последовательность мутанта rLZ-8 может включать одну аминокислотную мутацию, выбранную из группы, состоящей из: R9A, L17K, D20H, K46E, D70K и K74E. В альтернативе, например, одна аминокислотная мутация может быть выбрана из группы, состоящей из: L17K, K46E, D70K и K74E.
В настоящей заявке рекомбинантный белок включает спейсерный пептид и мутант рекомбинантного иммуномодулирующего белка Ganoderma lucidum (мутант rLZ-8), где по сравнению с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 10, аминокислотная последовательность мутанта rLZ-8 может включать одну аминокислотную мутацию, выбранную из группы, состоящей из: L17K, D70K и K46E.
В настоящей заявке рекомбинантный белок включает спейсерный пептид и мутант рекомбинантного иммуномодулирующего белка Ganoderma lucidum (мутант rLZ-8), где по сравнению с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 10, аминокислотная последовательность мутанта rLZ-8 может включать одну аминокислотную мутацию, выбранную из группы, состоящей из: K46E и K74E. Также, например, две аминокислотных мутации могут быть выбраны из группы, состоящей из: L17K и D70K.
Например, мутант rLZ-8 может включать аминокислотную последовательность, показанную в любой из SEQ ID NO: 13 и 16-21. Например, мутант rLZ-8 может включать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 80% (например, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или больше) гомологией с аминокислотной последовательностью, показанной в любой из SEQ ID NO: 13 и 16-21.
В настоящей заявке мутант rLZ-8 может включать аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 13. Например, мутант rLZ-8 может включать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 80% (например, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или больше) гомологией с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO 13. В настоящей заявке аминокислотная последовательность мутанта rLZ-8 может быть такой, как показано в SEQ ID NO: 13.
В настоящей заявке рекомбинантный белок может включать спейсерный пептид и rLZ-8, где rLZ-8 может включать аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 10, и спейсерный пептид может включать 1-5 EA. Например, спейсерный пептид может включать 2 EA.
В настоящей заявке рекомбинантный белок может включать спейсерный пептид и мутант rLZ-8, где мутант rLZ-8 может включать аминокислотную последовательность, показанную в любой из SEQ ID NO: 13 и 16-21, спейсерный пептид может включать 1-5 EA. Например, спейсерный пептид может включать 2 EA.
В настоящей заявке рекомбинантный белок может включать спейсерный пептид и мутант rLZ-8, где мутант rLZ-8 может включать аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 13, и спейсерный пептид может включать аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:8. Например, рекомбинантный белок может включать аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 14.
В настоящей заявке рекомбинантный белок может включать спейсерный пептид и мутант rLZ-8, где мутант rLZ-8 может включать аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 16, и спейсерный пептид может включать аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:8. Например, рекомбинантный белок может включать аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 22.
В настоящей заявке рекомбинантный белок может включать спейсерный пептид и мутант rLZ-8, где мутант rLZ-8 может включать аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 17, и спейсерный пептид может включать аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:8. Например, рекомбинантный белок может включать аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 23.
В настоящей заявке рекомбинантный белок может включать спейсерный пептид и мутант rLZ-8, где мутант rLZ-8 может включать аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 18, и спейсерный пептид может включать аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:8. Например, рекомбинантный белок может включать аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 24.
В настоящей заявке рекомбинантный белок может включать спейсерный пептид и мутант rLZ-8, где мутант rLZ-8 может включать аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 19, и спейсерный пептид может включать аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:8. Например, рекомбинантный белок может включать аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 25.
В настоящей заявке рекомбинантный белок может включать спейсерный пептид и мутант rLZ-8, где мутант rLZ-8 может включать аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 20, и спейсерный пептид может включать аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:8. Например, рекомбинантный белок может включать аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 26.
В настоящей заявке рекомбинантный белок может включать спейсерный пептид и мутант rLZ-8, где мутант rLZ-8 может включать аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 21, и спейсерный пептид может включать аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:8. Например, рекомбинантный белок может включать аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 27.
В настоящей заявке рекомбинантный белок может включать спейсерный пептид и мутант rLZ-8, где мутант rLZ-8 может включать аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 13, и спейсерный пептид может включать аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:9. Например, рекомбинантный белок может включать аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 15.
В настоящей заявке рекомбинантный белок может включать спейсерный пептид и мутант rLZ-8, где мутант rLZ-8 может включать аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 16, и спейсерный пептид может включать аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:9. Например, рекомбинантный белок может включать аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 28.
В настоящей заявке рекомбинантный белок может включать спейсерный пептид и мутант rLZ-8, где мутант rLZ-8 может включать аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 17, и спейсерный пептид может включать аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:9. Например, рекомбинантный белок может включать аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 29.
В настоящей заявке рекомбинантный белок может включать спейсерный пептид и мутант rLZ-8, где мутант rLZ-8 может включать аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 18, и спейсерный пептид может включать аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:9. Например, рекомбинантный белок может включать аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 30.
В настоящей заявке рекомбинантный белок может включать спейсерный пептид и мутант rLZ-8, где мутант rLZ-8 может включать аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 19, и спейсерный пептид может включать аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:9. Например, рекомбинантный белок может включать аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 31.
В настоящей заявке рекомбинантный белок может включать спейсерный пептид и мутант rLZ-8, где мутант rLZ-8 может включать аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 20, и спейсерный пептид может включать аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:9. Например, рекомбинантный белок может включать аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 32.
В настоящей заявке рекомбинантный белок может включать спейсерный пептид и мутант rLZ-8, где мутант rLZ-8 может включать аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 21, и спейсерный пептид может включать аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:9. Например, рекомбинантный белок может включать аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 33.
В настоящей заявке спейсерный пептид может быть расположен на N-конце rLZ-8 или его мутанта. В настоящей заявке рекомбинантный белок может включать, в свою очередь, спейсерный пептид и мутант rLZ-8 от N-конца к C-концу.
В настоящей заявке рекомбинантный белок может включать спейсерный пептид и rLZ-8, где мутант rLZ-8 может включать аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 10, и спейсерный пептид может включать аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:8.
В настоящей заявке рекомбинантный белок может включать спейсерный пептид и rLZ-8, где мутант rLZ-8 может включать аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 10, и спейсерный пептид может включать аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:9.
В настоящей заявке спейсерный пептид может быть расположен на N-конце rLZ-8. В настоящей заявке рекомбинантный белок может включать спейсерный пептид и rLZ-8, в свою очередь, от N-конца к C-концу.
В настоящей заявке рекомбинантный белок может включать аминокислотную последовательность, показанную в любой из SEQ ID NO: 14, 15 и 22-33. В настоящей заявке рекомбинантный белок может включать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 80% (например, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или больше) гомологией с аминокислотной последовательностью, показанной в любой из SEQ ID NO: 14, 15 и 22-33.
Например, рекомбинантный белок может включать аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 14. Например, рекомбинантный белок может включать аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 80% (например, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или больше) гомологией с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 14.
Нуклеиновая кислота, вектор и клетка
В другом аспекте настоящей заявки предложен полипептид, включающий рекомбинантный белок. В полипептиде рекомбинантный белок может быть ковалентно или нековалентно связан с другими белками или полипептидами.
В другом аспекте настоящей заявки предложена одна или больше молекул нуклеиновой кислоты, которые могут кодировать рекомбинантный белок и/или полипептид по настоящей заявке. Молекула нуклеиновой кислоты по настоящей заявке может быть выделена. Например, она может быть получена или синтезирована: (i) путем амплификации in vitro, например, амплификации с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), (ii) путем клональной рекомбинации, (iii) с помощью очистки, например, ферментативного расщепления и фракционирования с помощью гель-электрофореза, или (iv) с помощью синтеза, например, химического синтеза. В некоторых вариантах осуществления выделенная нуклеиновая кислота является молекулой нуклеиновой кислоты, полученной с помощью технологии рекомбинантных ДНК.
В другом аспекте настоящей заявки предложен вектор, который может включать молекулу нуклеиновой кислоты по настоящей заявке. Кроме того, вектор может дополнительно включать другие гены, такой как, маркерный ген, который позволяет отбирать вектор в подходящей клетке-хозяине в подходящих условиях. Более того, вектор может дополнительно включать элемент контроля экспрессии, который позволяет правильно экспрессировать кодирующую область в подходящем хозяине. Такие элементы контроля могут быть хорошо известны специалистам в данной области, например, они могут включать промоторы, участки связывания рибосомы, энхансеры и другие элементы контроля, регулирующие транскрипцию генов или трансляцию мРНК и т.д. Вектор может включать, например, плазмиды, космиды, вирусы, фаги или другие векторы, обычно используемые в генной инженерии и т.д. Например, вектор представляет собой вектор экспрессии. Например, вектор представляет собой вектор, подходящий для экспрессии в эукариоците (например, дрожжевой клетке).
В другом аспекте настоящей заявки предложена клетка, которая может включать молекулу нуклеиновой кислоты по настоящей заявке или вектор по настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления каждая клетка может включать одну молекулу нуклеиновой кислоты или вектор по настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления каждая клетка может включать больше одной (например, 2 или больше) молекулы нуклеиновой кислоты или вектора по настоящей заявке. Например, вектор по настоящей заявке может быть введен в клетку-хозяина, такую как дрожжевая клетка, например, клетка из растения, клетка гриба или дрожжевая клетка и т.д. Вектор по настоящей заявке может быть введен в клетку-хозяина способом, известным в уровне техники, например, электропорацией, трансфекцией с липофектином, трансфекцией с липофектамином и т.д.
В другом аспекте настоящей заявки предложен способ получения рекомбинантного белка, включающий культивирование клетки в условиях, которые позволяют экспрессировать рекомбинантный белок. Например, это может быть сделано при использовании подходящей среды, подходящей температуры и времени культивирования и т.д.
Фармацевтическая композиция, набор и устройство для доставки лекарственного средства
В другом аспекте настоящей заявки предложена фармацевтическая композиция, включающая рекомбинантный белок, выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, вектор, полипептид и/или клетку и, необязательно, фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтически приемлемый вектор нетоксичен при приеме в использованной дозе и концентрации и может включать буферы, антиоксиданты, консерванты, низкомолекулярные (меньше чем приблизительно 10 остатков) полипептиды, белки, гидрофильные полимеры, аминокислоты, углеводы, солеобразующие противоионы, комплексы металлов и/или неионогенные поверхностно-активные вещества. Фармацевтическая композиция по настоящей заявке может дополнительно включать больше одного активного соединения, как правило, такие активные соединения, которые обладают дополняющими активностями и не оказывают нежелательного воздействия друг на друга. Тип и эффективное количество таких лекарственных средств зависят, например, от количества и типа антагониста(ов), присутствующего в составе, а также клинических показателей субъекта. Фармацевтическая композиция по настоящей заявке может включать профилактически и/или терапевтически эффективное количество рекомбинантного белка и/или полипептида. Профилактически и/или терапевтически эффективное количество представляет собой дозу, требуемую для предупреждения и/или лечения (по меньшей мере, частичного лечения) заболевания или нарушения, и/или их любого осложнения у субъекта, страдающего ими или подвергающегося риску их развития.
В другом аспекте настоящей заявки предложен набор, включающий рекомбинантный белок, выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, вектор, клетку, полипептид и/или фармацевтическую композицию. Вполне вероятно, что антигенсвязывающий белок, вектор, молекула нуклеиновой кислоты, клетка, иммуноконъюгат и/или фармацевтическая композиция по настоящей заявке могут содержаться в одном общем контейнере, или их также могут необязательно комбинировать с одним или больше терапевтическими средствами и, необязательно, вместе включать в состав в наборе.
В другом аспекте настоящей заявки предложено устройство для доставки лекарственного средства, включающее рекомбинантный белок, выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, вектор, клетку, полипептид и/или фармацевтическую композицию.
Способ лечения
В другом аспекте настоящей заявки предложен способ предупреждения, уменьшения или лечения опухоли, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, рекомбинантного белка, выделенной молекулы нуклеиновой кислоты, вектора, клетки, полипептида и/или фармацевтической композиции.
В другом аспекте настоящей заявки предложено применение рекомбинантного белка, выделенной молекулы нуклеиновой кислоты, вектора, клетки, полипептида и/или фармацевтической композиции в производстве лекарственного средства для лечения, уменьшения или лечения опухоли.
В другом аспекте настоящей заявки предложен рекомбинантный белок, выделенная молекула нуклеиновой кислоты, вектор, клетка, полипептид и/или фармацевтическая композиция для предупреждения, уменьшения или лечения опухоли.
Например, опухоль может включать солидную опухоль и/или несолидную опухоль (например, гематологическую опухоль).
Например, опухоль может быть опухолью с экспрессией EGFR. Например, опухоль может быть опухолью, связанной с аномальной экспрессией EGFR. Например, опухоль может быть опухолью с оверэкспрессией EGFR.
Например, опухоль может включать опухоль, связанную с мутацией EGFR. Например, опухоль может включать опухоль, связанную с мутацией BRAF. Например, опухоль может включать опухоль, связанную с мутацией KRAS. Например, опухоль может включать опухоль, связанную с мутацией HER2.
Например, опухоль может включать одну или больше опухолей, выбранных из группы, состоящей из: рака толстой и прямой кишки, рака легкого, рака печени, рака молочной железы, рака желудка, рака почки, рака мочевого пузыря, нейробластомы, рака яичника, эпителиальной плоскоклеточной карциномы и рака поджелудочной железы.
Не желая ограничения какой-либо теорией, следующие примеры предназначены лишь для иллюстрации различных технических решений изобретения по настоящей заявке и не предназначены для ограничения объема изобретения в заявке.
ПРИМЕРЫ
Пример 1: Конструирование вектора экспрессии rLZ-8 и мутанта rLZ-8
(1) ДНК rLZ-8 (с аминокислотной последовательностью, как показано в SEQ ID NO: 10) и ДНК мутанта rLZ-8 (с аминокислотной последовательностью, как показано в SEQ ID NO: 13) использовали в качестве матрицы, и прямой праймер F и обратный праймер R использовали для ПЦР-амплификации фрагментов генов rLZ-8 и мутанта rLZ-8. Полученные фрагменты генов не включали ДНК последовательность EAEA, но содержали сайты расщепления Xho I и Xba I на 5'-конце и 3'-конце соответственно.
Информация по прямому праймеру F и обратному праймеру R является следующей:
Прямой праймер F: CCGCTCGAGAAAAGAATGTCTGATACTGCTTTGATCTTCA (SEQ ID NO: 1)
Обратный праймер R: GCTCTAGACTAGTTCCATTGAGCGATA (SEQ ID NO: 2)
(2) Фрагменты генов rLZ-8 (с аминокислотной последовательностью, как показано в SEQ ID NO: 10) и мутанта rLZ-8 (с аминокислотной последовательностью, как показано в SEQ ID NO: 13) расщепляли по Xho I/Xba I и лигировали в пустой вектор экспрессии при использовании ДНК-лигазы T4 с получением рекомбинантного вектора экспрессии.
Пример 2: Конструирование вектора экспрессии rLZ-8 и мутанта rLZ-8 с последовательностью EAEA
(1) В соответствии с предпочтительными кодонами Pichia pastoris, с общим рассмотрением влияний, таких как индекс адаптации кодонов и анализ вторичной структуры РНК и т.п., EAEA+rLZ-8 (с аминокислотной последовательностью, как показано в SEQ ID NO: 11) и EAEA+rLZ-8 мутант (с аминокислотной последовательностью, как показано в SEQ ID NO: 14), подвергали оптимизации кодонов. Для упрощения конструирования вектора экспрессии, сайты рестрикции Xho I и Xba I добавляли на 5' и 3'-концы оптимизированной последовательности ДНК соответственно, и последовательность ДНК встраивали в клональный вектор pUC57 после искусственного синтеза, то есть с получением pUC57-EAEA+rLZ-8 и puc57-EAEA+rLZ-8 мутанта.
(2) ДНК EAEA+rLZ-8 (с аминокислотной последовательностью, как показано в SEQ ID NO: 11) использовали в качестве матрицы, и прямой праймер F3 и обратный праймер R3 использовали для ПЦР-амплификации фрагментов гена rLZ-8. Полученные фрагменты гена включили последовательность ДНК с EAEA и содержали сайты расщепления Xho I и Xba I на 5'-конце и 3'-конце соответственно.
Информация по прямому праймеру F3 и обратному праймеру R3 является следующей:
Прямой праймер F3: CCGCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCT (SEQ ID NO: 3)
Обратный праймер R3: GCTCTAGATCACTAGTTCCATTG (SEQ ID NO: 4)
(3) ДНК EAEA+rLZ-8 мутанта (с аминокислотной последовательностью, как показано в SEQ ID NO: 14) использовали в качестве матрицы, и прямой праймер M13F и обратный праймер M13R использовали для ПЦР-амплификации фрагментов гена мутанта rLZ-8. Полученные фрагменты гена включали ДНК-последовательность с EAEA и содержали сайты расщепления Xho I и Xba I на 5'-конце и 3'-конце соответственно.
Информация по прямому праймеру M13F и обратному праймеру M13R является следующей:
Прямой праймер M13F: CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG (SEQ ID NO: 5)
Обратный праймер M13R: AGCGGATAACAATTTCACACAGG (SEQ ID NO: 6)
(4) Фрагменты генов EAEA+rLZ-8 и EAEA+rLZ-8 мутанта расщепляли по Xho I/Xba I и лигировали в пустой вектор экспрессии при использовании ДНК-лигазы T4 с получением рекомбинантного вектора экспрессии.
При использовании такого же способа были сконструированы рекомбинантные белки, включающие rLZ-8 мутант 1 (с аминокислотной последовательностью, как показано в SEQ ID NO: 16), rLZ-8 мутант 2 (с аминокислотной последовательностью, как показано в SEQ ID NO: 17), rLZ-8 мутант 3 (с аминокислотной последовательностью, как показано в SEQ ID NO: 18), rLZ-8 мутант 4 (с аминокислотной последовательностью, как показано в SEQ ID NO: 19), rLZ-8 мутант 5 (с аминокислотной последовательностью, как показано в SEQ ID NO: 20), rLZ-8 мутант 6 (с аминокислотной последовательностью, как показано в SEQ ID NO: 21), соединенные с аминокислотной последовательностью "EAEA" на N-конце, соответственно.
Пример 3: Конструирование вектора экспрессии rLZ-8 и rLZ-8 мутанта с последовательностью EEAEAEAEPK
(1) ДНК EEAEAEAEPK+rLZ-8 (с аминокислотной последовательностью, как показано в SEQ ID NO: 12) и ДНК EEAEAEAEPK+rLZ-8 мутанта (с аминокислотной последовательностью, как показано в SEQ ID NO: 15) использовали в качестве матрицы, и прямой праймер F2 и обратный праймер R использовали для ПЦР-амплификации фрагментов генов EEAEAEAEPK+rLZ-8 и EEAEAEAEPK+rLZ-8 мутанта. Полученные фрагменты генов включали ДНК-последовательность EEAEAEAEPK и имели сайты расщепления Xho I и Xba I на 5'-конце и 3'-конце соответственно.
Информация по прямому праймеру F2 и обратному праймеру R является следующей:
Прямой праймер F2:
CCGCTCGAGAAAAGAGAAGAGGCCGAAGCCGAAGCAGAACCTAAAATGTCTGATACTGCTTTGATCTTCA (SEQ ID NO: 7)
Обратный праймер R: GCTCTAGACTAGTTCCATTGAGCGATA (SEQ ID NO: 2)
(2) Фрагменты генов EEAEAEAEPK+rLZ-8 (с аминокислотной последовательностью, как показано в SEQ ID NO: 12) и EEAEAEAEPK+rLZ-8 мутанта (с аминокислотной последовательностью, как показано в SEQ ID NO: 15) расщепляли по Xho I/Xba I и лигировали в пустой вектор экспрессии при использовании ДНК-лигазы T4 с получением рекомбинантного вектора экспрессии.
При использовании такого же способа были сконструированы рекомбинантные белки, включающие rLZ-8 мутант 1 (с аминокислотной последовательностью, как показано в SEQ ID NO: 16), rLZ-8 мутант 2 (с аминокислотной последовательностью, как показано в SEQ ID NO: 17), rLZ-8 мутант 3 (с аминокислотной последовательностью, как показано в SEQ ID NO: 18), rLZ-8 мутант 4 (с аминокислотной последовательностью, как показано в SEQ ID NO: 19), rLZ-8 мутант 5 (с аминокислотной последовательностью, как показано в SEQ ID NO: 20), rLZ-8 мутант 6 (с аминокислотной последовательностью, как показано в SEQ ID NO: 21), связанный с аминокислотной последовательностью "EEAEAEAEPK" на N-конце, соответственно.
Пример 4: Конструирование экспрессионного штамма Pichia pastoris
(1) Получение компетентной клетки:
Пустые штаммы Pichia pastoris инокулировали в жидкую среду YPD и культивировали при 28,5°C в течение 16-18 ч до OD600=1,3-1,5 с получением компетентных клеток. Раствор штамма помещали в ледяную баню на 30 мин и распределяли в четыре центрифужные пробирки объемом 50 мл, каждая из которых содержала по 40 мл. Центрифугирование проводили при 1500 g и 4°C в течение 5 мин. Супернатант удаляли. Клетки собирали, тщательно ресуспендировали в 160 мл предварительно охлажденной стерильной бидистиллированной воды и центрифугировали при 1500 g и 4°C в течение 5 мин. Супернатант снова удаляли. Клетки собирали, тщательно ресуспендировали в 80 мл предварительно охлажденной стерильной бидистиллированной воды и центрифугировали при 1500 g и 4°C в течение 5 минут. Клетки собирали, тщательно ресуспендировали в 10 мл 1 М предварительно охлажденного стерильного раствора сорбита и центрифугировали при 1500 g и 4°C в течение 5 мин. Осадок клеток собирали и ресуспендировали в 500 мкл 1 М предварительно охлажденного стерильного раствора сорбита для последующего использования.
(2) Линеаризация рекомбинантной плазмиды
Рекомбинантную плазмиду линеаризовали Bsp HI для облегчения трансформации дрожжевых клеток.
(3) Электротрансформация
80 мкл компетентных дрожжевых клеток добавляли в 2 мм кювету для электротрансформации. Добавляли 5-10 мкг линеаризованных рекомбинантных плазмид, тщательно перемешивали и оставляли во льду на 5 мин. Параметры электротрансформации устанавливали следующим образом: V=1,5 кВ, u=25 мкФ, R=200 Ом и время разряда от 4,5 мс до 4,9 мс. После электротрансформации немедленно добавляли 1 мл 1 М сорбита и инкубировали при постоянной температуре 28,5°C в течение 1 ч. По 50-200 мкл раствора штамма наносили на чашку с твердой средой YPDS, содержащей 100 мкг/мл Зеоцина. Еее инкубировали в термостатируемом инкубаторе при 28,5°C в течение 2-3 дней.
Пример 5: Скрининг штаммов с высокой экспрессией
Зеоцин-положительную клональную колонию инокулировали в 10 мл жидкой среды YPD для культивирования. Значение Оптической плотности (OD) измеряли на спектрофотометре при 600 нм до значения OD ≈6. 40 мкл раствора активированного штамма инокулировали в 25 мл новой жидкой среды YPD и культивировали при 28,5°C и 225 об/мин в течение 72 ч. 1 мл раствора штамма центрифугировали при 13000 g и низкой температуре 4°C, и супернатант детектировали с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ для анализа экспрессии различных клонов целевого белка в 6 векторах экспрессии, сконструированных в Примерах 1-3.
Результаты скрининга штаммов дрожжей с высокой экспрессией показаны на Фиг. 1-6. Что касается rLZ-8 (SEQ ID NO: 10), Клон 3 имеет относительно высокую экспрессию (ФИГ. 1); что касается мутанта rLZ-8 (SEQ ID NO: 13), Клон 10 имеет относительно высокую экспрессию (ФИГ. 2); что касается EAEA+rLZ-8 (SEQ ID NO: 11), Клон 6 имеет относительно высокую экспрессию (ФИГ. 3); что касается EAEA+rLZ-8 мутанта (SEQ ID NO: 14), Клон 7 имеет относительно высокую экспрессию (ФИГ. 4); что касается EEAEAEAEPK+rLZ-8 (SEQ ID NO: 12), Клон 7 имеет относительно высокую экспрессию (ФИГ. 5); и что касается EEAEAEAEPK+rLZ-8 мутанта (SEQ ID NO: 15), Клон 2 имеет относительно высокую экспрессию (ФИГ. 6).
Пример 6: Влияние разных спейсеров на экспрессию белка rLZ-8 и мутанта rLZ-8
(1)
Экспрессию целевых белков в различных векторах экспрессии, сконструированных в Примерах 1-3, сравнивали в соответствии со способом Примера 5. Результаты показаны на ФИГ. 7.
EAEA способствует экспрессии и секреции как rLZ-8 (SEQ ID NO: 10), так и мутанта rLZ-8 (SEQ ID NO: 13), причем стимулирующее действие в отношении мутанта rLZ-8 (SEQ ID NO: 13) лучше, чем в отношении rLZ-8 (SEQ ID NO: 10) (Дорожки 1, 2, 4 и 5 на ФИГ. 7).
EEAEAEAEPK способствует экспрессии и секреции как rLZ-8 (SEQ ID NO: 10), так и мутанта rLZ-8 (SEQ ID NO: 13), причем стимулирующее действие в отношении rLZ-8 (SEQ ID NO: 10) лучше, чем в отношении мутанта rLZ-8 (SEQ ID NO: 13) (Дорожки 1, 3, 4 и 6 на ФИГ. 7).
EAEA и EEAEAEAEPK вызывают повышение экспрессии и секреции белка, и их стимулирующее действие на экспрессию и секрецию различных белков отличается, причем EAEA имеет оптимальное стимулирующее действие в отношении мутанта rLZ-8 (SEQ ID NO: 13) (Дорожки 1, 2 и 3 на ФИГ. 7), а EEAEAEAEPK имеет оптимальное стимулирующее действие в отношении rLZ-8 (SEQ ID NO: 10) (Дорожки 4, 5 и 6 на ФИГ. 7).
(2)
Экспрессия целевых белков (на основе rLZ-8 мутанта 4 - rLz-8 мутанта 6) в 9 векторах экспрессии, сконструированных в Примерах 1-3, сравнивали в соответствии со способом Примера 5. Результаты показаны на ФИГ. 25.
Результаты показывают, что EAEA вызывает повышение экспрессии и секреции белка, и проявляет оптимальные эффекты в отношении rLZ-8 мутанта 4 (SEQ ID NO: 19), rLZ-8 мутанта 5 (SEQ ID NO: 20) и rLZ-8 мутанта 6 (SEQ ID NO: 21).
Пример 7. Идентификация структуры рекомбинантного белка
В данном примере определяли N-концевые аминокислотные последовательности белков EAEA+rLZ-8 (SEQ ID NO: 11), EAEA+rLZ-8 мутанта (SEQ ID NO: 14), EEAEAEAEPK+ rLZ-8 (SEQ ID NO: 12), EEAEAEAEPK+ rLZ-8 мутанта (SEQ ID NO: 15), rLZ-8 (SEQ ID NO: 10) и мутанта rLZ-8 (SEQ ID NO: 13). Рекомбинантный белок гидролизовали трипсином, а затем выделяли с помощью обращенной хроматографии с получением пептидных сегментов, полученных в результате гидролиза, каждый из которых измеряли с помощью масс-спектрометрии, с получением N-концевой аминокислотной последовательности. Конкретные этапы являлись следующими:
(1) Подготовка раствора образца
250 мкг рекомбинантного белка добавляли в 200 мкл 10 М раствора мочевины и разбавляли водой до 250 мкл. После тщательного перемешивания его инкубировали в термостатируемом шейкере при 65°C в течение 30 мин. После инкубирования образец охлаждали до комнатной температуры. Буферный раствор заменяли 0,1 М раствором бикарбоната аммония на SEC колонке. Конечную концентрацию белка измеряли с помощью микроспектрофотометра.
(2) Энзимолиз
50 мкг белков, подлежащих анализу, разбавляли 0,1M раствором бикарбоната аммония до 0, мкг/мкл. Добавляли 0,5 мкг трипсина и тщательно перемешивали, после чего инкубировали при 37°C в течение 20 ч. После инкубирования реакцию энзимолиза останавливали путем добавления эквивалентного объема 0,1% раствора муравьиной кислоты или выдерживания при 4°C. Раствор центрифугировали при 4°C на 12000 об/мин в течение 2 мин и отбирали супернатант для анализа.
(3) Условия хроматографии и процедуры элюирования
3.1 Условия хроматографии
3.2 Процедуры элюирования
Результаты показывают, что все N-концевые аминокислотные последовательности рекомбинантных белков согласуются с теоретическими последовательностями.
Пример 8. Обнаружение цитотоксических эффектов EAEA+rLZ-8 мутанта и EEAEAEAEPK+rLZ-8 мутанта в отношении опухолевых клеток
Набор реагентов для анализа жизнеспособности клеток CellTiterTM-Flour использовали для обнаружения цтотоксических эффектов EAEA+ rLZ-8 мутанта (SEQ ID NO: 14) и EEAEAEAEPK+rLZ-8 мутанта (SEQ ID NO: 15) в отношении опухолевых клеток (линия клеток мелкоклеточного рака легкого человека А549) in vitro. Рекомбинантный белок разводили культуральной средой с 2% фетальной бычьей сыворотки с получением тестируемых растворов с концентрациями 100 мкг/мл, 50 мкг/мл, 25 мкг/мл, 12,5 мкг/мл, 6,25 мкг/мл, 3,125 мкг/мл, 1,5625 мкг/мл, 0,78125 мкг/мл, 0,390625 мкг/мл, 0,1953125 мкг/мл и 0,09765625 мкг/мл, в общей сложности 11 концентраций.
Разведения добавляли в 96-луночный планшет, содержащий клетки А549, по 100 мкл/лунка. Для каждой группы концентраций использовали и маркировали по 3 параллельных лунки. Контрольную группу клеток (т.е. только клетки) использовали в концентрации 100 мкл/лунка с 6 параллельными лунками. Планшеты культивировали в CO2-инкубаторе при 5% CO2 и температуре 37°C в течение 48 ч.
В каждую лунку добавляли по 100 мкл подготовленного реагента для анализа жизнеспособности клеток CellTiterTM-Flour (1 мл буфера для анализа; 1 мкл субстрата GF-AFC). Планшеты встряхивали для хорошего перемешивания и инкубировали в CO2-инкубаторе при 5% CO2 и 37°C не меньше 30 мин. Значение флуоресценции регистрировали на микропланшетном ридере при длине волны 400EX/505EM и вычисляли значение IC50.
Результаты показаны на ФИГ. 24 (где Группа 1 и Группа 2 соответствуют результатам EAEA+rLZ-8 мутанта (SEQ ID NO: 14) и EEAEAEAEPK+rLZ-8 мутанта (SEQ ID NO: 15) соответственно). IC50 EAEA+rLZ-8 мутанта (SEQ ID NO: 14) составляет 1,21 мкг/мл; и IC50 EEAEAEAEPK+rLZ-8 мутанта (SEQ ID NO: 15) составляет 1,91 мкг/мл. Результаты показывают, что как EAEA+rLZ-8 мутант (SEQ ID NO: 14), так и EEAEAEAEPK+rLZ-8 мутант (SEQ ID NO: 15) оказывают цитотоксическое действие на линию клеток рака легкого A549, причем цитотоксическое действие EAEA+rLZ-8 мутанта (SEQ ID NO: 14) выше, чем у EEAEAEAEPK+rLZ-8 мутанта (SEQ ID NO: 15).
Пример 9. Ингибирование роста опухоли рекомбинантным белком in vitro (модель PDXO)
За день до исследования (день -1) 50% матригель использовали для обработки нужного количества органоидов в соотношении 1:1, чтобы определить правильный размер органоида для скрининга.
День 0: Инокуляция органоидов
a) 20 мкл 100× раствора Диспазы добавляли в 6-луночный планшет (содержащий 2 мл среды культивирования организма) и из каждой лунки собирали органоид. b) 6-луночный планшет снова помещали в инкубатор и культивировали при 37°С в течение 30 мин. c) Органоид собирали из 6-луночного планшета и переносили с помощью предварительно смоченного 100 мкм фильтра в пластиковую пробирку объемом 50 мл. d) После того, как все лунки были отфильтрованы через фильтр с порами 100 мкм, поток фильтровали при использовании предварительного смоченного фильтра с порами 20 мкм. e) Фильтр 20 мкм переворачивали и собирали органоид в новую пробирку объемом 50 мл. f) Органоид собирали и ресуспендировали в соответствующей культуральной среде. Вычисляли концентрации органоида. g) Концентрацию клеток доводили средой до нужной концентрации. h) Добавляли Матригель до конечной концентрации 5% об/об и суспендировали органоид на льду. i) 40 мкл клеточной суспензии добавляли в 384-луночный планшет с помощью дозатора Multidrop. Плотность инокуляции перечислена в Таблице 1 ниже, что связано с морфологией и условиями роста органоида. j) После добавления рекомбинантного белка планшеты для скрининга снова помещали в инкубатор. Через 2-4 часа после инокуляции добавляли раствор рекомбинантного белка для обработки органоида. Аминокислотная последовательность спейсера рекомбинантного белка, используемого в примере, показана в SEQ ID NO:8, аминокислотная последовательность мутанта rLZ-8 показана в SEQ ID NO:13, и аминокислотная последовательность рекомбинантного белка показана в SEQ ID NO:14.
Таблица 1. Прививочная плотность органеллы
День 5: Световой сигнал CTG детектируемого планшета регистрировали в конце детектирования: по 40 мкл CTG 3D добавляли в каждую лунку с помощью дозатора Multidrop; содержимое перемешивали на планшетном шейкере в течение 5 мин; а затем место инкубировали при комнатной температуре в темноте в течение 30 мин. Световой сигнал считывали на планшетном ридере Envision.
Анализ данных:
Данные будут графически отображаться с использованием GraphPad Prism 5.0. Формула расчета выживаемости является следующей.
Выживаемость (%)=(LumТестируемый препарат - LumКонтроль со средой)/( LumБез обработки - LumКонтроль со средой)×100%. Контроль со средой такой же, как и положительный контроль (стауроспорин, 5 мкМ), поскольку положительный контроль (стауроспорин, 5 мкМ) предназначен для уничтожения всех или почти всех органоидов.
(1) Рак толстой и прямой кишки
Таблица 2. Ингибирование роста рака толстой и прямой кишки рекомбинантным белком
(рекомбинантный белок, как показано в SEQ ID NO: 14)
(рекомбинант-ный белок, как показано в SEQ ID NO: 14)
(Цетуксимаб)
(Стауроспорин)
(Стауроспорин)
Результаты показаны в Таблице 2 и на ФИГ. 8 - ФИГ. 11: Рекомбинантный белок, как показано в SEQ ID NO: 14, оказывает ингибирующее действие на клетки рака толстой и прямой кишки с EGFR дикого типа (CR20035B, ФИГ. 8), мутацией KRAS (CR5043B, ФИГ. 9), мутацией BRAF (CR5082B, ФИГ. 10), а также одновременной мутацией EGFR и KRAS (CR3099B, ФИГ. 11).
(2) Рак легкого
Таблица 3. Ингибирование роста рака легкого рекомбинантным белком
(рекомбинантный белок, как показано в SEQ ID NO: 14)
(Стауроспорин)
Результаты показаны в Таблице 3 и на ФИГ. 12 - ФИГ. 14: Рекомбинантный белок, как показано в SEQ ID NO: 14, оказывает ингибирующее действие на клетки рака легкого с EGFR дикого типа (LU1235B, ФИГ. 14), мутацией KRAS (LU5162B, ФИГ. 12) и мутацией BRAF (LU11624B, ФИГ. 13).
(3) Рак печени
Таблица 4. Ингибирование роста рака печени рекомбинантным белком
(рекомбинантный белок, как показано в SEQ ID NO: 14)
(Стауроспорин)
Результаты показаны в Таблице 4 и на ФИГ. 15 - ФИГ. 16: рекомбинантный белок, как показано в SEQ ID NO: 14, оказывает ингибирующее действие на клетки печени с EGFR дикого типа (LI6677B, ФИГ. 15; LI6669B, ФИГ. 16).
(4) Рак молочной железы
Таблица 5. Ингибирование роста рака молочной железы рекомбинантным белком
(рекомбинантный белок, как показано в SEQ ID NO: 14)
Результаты показаны в Таблице 5 и на ФИГ. 17 - ФИГ. 18: Рекомбинантный белок, как показано в SEQ ID NO: 14, оказывает ингибирующее действие на клетки рака молочной железы с мутацией HER2 (BR9457B, ФИГ. 17; BR9466B, ФИГ. 18).
(5) Рак желудка
Таблица 6. Ингибирование роста рака желудка рекомбинантным белком
(рекомбинантный белок, как показано в SEQ ID NO: 14)
(Стауроспорин)
Результаты показаны в Таблице 6 и на ФИГ. 19 - ФИГ. 20: Рекомбинантный белок, как показано в SEQ ID NO: 14, оказывает ингибирующее действие на клетки рака желудка с EGFR дикого типа (GA6833B, ФИГ. 19) и мутацией BRAF (GA2434B, ФИГ. 20).
(6) Рак поджелудочной железы
Таблица 7. Ингибирование роста рака поджелудочной железы рекомбинантным белком
(рекомбинантный белок, как показано в SEQ ID NO: 14)
(Стауроспорин)
Результаты показаны в Таблице 7 и на ФИГ. 21 - ФИГ. 22: Рекомбинантный белок, как показано в SEQ ID NO: 14, оказывает ингибирующее действие на клетки рака поджелудочной железы с EGFR дикого типа (PA20078B, ФИГ. 21) и клетки рака поджелудочной железы с одновременной мутацией KRAS и BRAF (PA0787B, ФИГ. 22).
Пример 10. Ингибирование роста опухоли рекомбинантным белком in vivo (модель PDX)
В данном примере проводили фармакодинамическую оценку исследуемого препарата, рекомбинтного белка, как показано в SEQ ID NO: 14, в модели ортотопической трансплантации рака печени LI6669 на самцах голых мышей BALB/c.
Схема эксперимента:
Число животных в каждой группе, а также конкретный путь доставки, доза и схема введения лекарственных средств перечислены в Таблице 8 ниже.
Таблица 8. Путь доставки, доза и схема введения лекарственных средств в модели LI6669 Amina
(мг/кг)
(мг/мл)
(мкл/г)
В таблице в/б обозначает внутрибрюшинную инъекцию, в/в обозначает инъекцию в хвостовую вену; и п/о обозначает пероральное внутрижелудочное введение.
Основными показателями наблюдения в этом эксперименте являются:
Относительная скорость пролиферации опухоли, T/C(%), т.е. процент относительного объема опухоли или массы опухоли в группе лечения по отношению к контрольной группе в некоторой точке времени. Формула расчета является следующей:
T/C%=TRTV/CRTV×100% (TRTV: среднее RTV в группе лечения; CRTV: среднее RTV в контрольной группе; RTV=Vt/V0, где V0 - объем опухоли у животного на момент распределения в группу, Vt - объем опухоли у животного после лечения);
или T/C%=TTW/CTW×100% (TTW: средний вес опухоли в конце эксперимента в группе лечения; и CTW: средний вес опухоли в конце эксперимента в контрольной группы).
Формула расчета относительного ингибирования опухоли, TGI (%), является следующей:
TGI%=(1-T/C)×100% (T и C - относительный объем опухоли (RTV) или вес опухоли (TW) в группе лечения и контрольной группе в определенной точке времени соответственно).
Экспериментальные животные:
Окружающие условия в помещении для кормления животных:
Способ проведения эксперимента:
LI6669 представляет собой модель ортотопической трансплантации HuPrime®, полученная на основе рака печени пациента из Азии. Эта модель имеет некоторую тенденцию к распаду опухоли.
Опухолевую ткань собирали у мыши, несущей опухоль LI6669, модель ортотопической трансплантации печени HuPrime®, и разрезали на фрагменты опухоли диаметром 2-3 мм, которые инокулировали в верхнюю левую долю печени голой мыши Balb/c.
Когда средний объем опухоли у мышей-опухоленосителей достиг примерно 50-150 мм3, мышей случайным образом распределяли в группы по весу в соответствии с Таблицей 3 в "3. Схема эксперимента". День распределения в группы был установлен как День 0, и введение начинали в День 1. День распределения в группы был обозначен датой День 0.
Мышей группировали по весу с использованием StudyDirectorTM (версии 3.1.399.19, поставщик: Studylog System, Inc., S. San Francisco, CA, USA).
Для распределения по группам был выбран метод случайного "Парного распределения" по группам. Этот алгоритм сравнивает индивидуальный вес всех выбранных животных со средним значением веса всех выбранных животных. Сначала отбирали пары животных со средним значением, близким к среднему значению всех выбранных животных, и распределяли в группы так, чтобы среднее значение группы совпадало со средним значением (или было как можно ближе к нему) всех выбранных животных. Окончательное среднее значение измерения в каждой группе должно быть как можно ближе к окончательному среднему значению измерения в других группах.
Наблюдение и сбор данных в ходе эксперимента:
После инокуляции опухолевых клеток процесс мониторинга включает рост опухоли и влияние лечения на нормальное поведение животных, в частности, на активность, потребление пищи и воды, увеличение или потерю веса, состояние глаз, шерсти экспериментальных животных, а также возникновение других патологических состояний. Все клинические симптомы, наблюдавшиеся в ходе экспериментов, были зафиксированы в исходных данных. После введения лекарственного средства мышам измеряли вес два раза в неделю. Наблюдение проводили для регистрации мыши, требующей усыпления, и соответствующего времени выживания.
Объем опухоли измеряют после вскрытия мыши в конце эксперимента. Формула расчета объема опухоли: Объем опухоли (мм3) =1/2×(a×b2) (где a представляет собой длинный диаметр, а b представляет собой короткий диаметр). В экспериментах использовали программу StudyDirectorTM (версии 3.1.399.19, поставщик: Studylog System, Inc.) для сбора данных, включая измерение длинного и короткого диаметров опухоли и веса животного. Исходные данные вводили непосредственно в программу после измерения с использованием весов и штангенциркуля. Любое изменение данных будет записано в этой программе. Все процессы, включая введение, измерение опухоли и взвешивание, проводили в боксе биологической безопасности или ламинарном шкафу.
Статистический анализ:
Для сравнения объемов опухолей в разных группах лечения в определенный день, сначала использовали критерий Бартлетта для проверки гипотезы об однородности дисперсии во всех группах. Когда p-значение критерия Бартлетта было не меньше 0,05, однофакторный дисперсионный анализ использовали для проверки, равны ли средние значения во всех группах. Если p-значение однофакторного дисперсионного анализа было меньше 0,05, следовало использовать HSD критерий Тьюки для парного сравнения всех групп или t-критерий Даннетта для парного сравнения каждой группы лечения и контрольной группы. Если p-значение критерия Бартлетта было меньше 0,05, следовало использовать критерий Краскела-Уоллиса для проверки, равны ли медианные значения во всех группах. Если p-значение критерия Крускела-Уоллиса было меньше 0,05, следовало использовать критерий Коновера для парного сравнения всех групп или попарного сравнения каждой группы лечения и контрольной группы, и соответствующую коррекцию p-значения выполняют в соответствии с количеством групп в нескольких тестах.
Более того, с целью эксплоративного анализа данных проводили парное сравнение всех групп в любой точке времени. Поскольку при таком сравнении использовали только данные по объему опухолей в двух группах, подлежащих сравнению в определенной точке времени, не было необходимости в коррекции при множественном сравнении тестов. Во-первых, критерий Бартлетта использовали для проверки гипотезы однородности дисперсии между двумя группами. Когда p-значение критерия Бартлетта было не меньше 0,05, использовали t-критерий Уэлча для сравнения, равны ли средние значения в двух группах. Когда p-значение критерия Бартлетта было меньше 0,05, использовали U-критерий Манна-Уитни для сравнения, равны ли медианные значения в двух группах.
Все статистические анализы и построение графиков выполняли в прграммной среде R (версии 3.3.1). Если не указано иное, все критерии являются двусторонними, и считаются статистически значимыми, если p-значение меньше 0,05.
Результаты эксперимента:
Результаты показаны в Таблице 9 и на ФИГ. 23: группа с 5 мг/кг рекомбинантного белка, как показано в SEQ ID NO: 14 (в/в Q3D), имеет более длительную медианную выживаемость (больше 28 дней) по сравнению с контрольной группой (17 дней), что является статистически значимым (р<0,05). При этом ни одна из групп с рекомбинантным белком, как показано в SEQ ID NO: 14, не демонстрировала выраженной токсичности для мышей. Это указывает на то, что рекомбинантный белок по настоящей заявке может эффективно продлевать выживаемость у мышей с раком печени.
Таблица 9. Медианная выживаемость и P-значения у мышей в различных группах лечения и контрольных группах в модели опухоли с ортотопической трансплантацией рака печени человека LI6669
Пример 11. фармакодинамическое исследование рекомбинантного белка in vitro
В данном эксперименте ингибирующее действие Эрбитукса на пролиферацию линии клеток А431 использовали в качестве положительного контроля для исследования ингибирующего действия рекомбинантного белка, как показано в SEQ ID NO: 14, на различные линии раковых клеток. В этом эксперименте использовали набор Promega Cell Titer-Glokit для определения жизнеспособности клеток. Этот реагент включает рекомбинантную люциферазу и флуоресцеин, причем люцифераза катализирует окисление субстрата и генерирует люминесцентный сигнал. Окисление зависит от АТФ, высвобождаемого при лизисе живых клеток, и сигнал люминесценции может косвенно отражать количество живых клеток.
Конкретные этапы являлись следующими:
1) Клетки-мишени собирали и подсчитывали, и затем инокулировали в 96-луночный планшет;
2) 96-луночный планшет помещали в клеточный инкубатор при 37°C и инкубировали приблизительно 16-20 часов;
3) Предварительно приготовленный рабочий раствор образца и рабочий раствор положительного контроля добавляли в соответствующие лунки;
4) Клетки культивировали в клеточном инкубаторе при 37°C еще в течение 72 часов;
5) После инкубирования рабочий раствор тестирующего реагента Cell TiterGlo добавляли в соответствующую лунку и выдерживали при комнатной температуре для стабилизации сигнала;
6) Для считывания планшета использовали PHERAStar FSX.
Результаты показаны в Таблице 10 и указывают, что рекомбинантный белок, как показано в SEQ ID NO: 14, в концентрации 0,1 мг/мл оказывает некоторое ингибирующее действие на рост 5637, HCI-H292, Calu-1, ACHN, AsPC-1, OVCAR8, SK-N-AS, Bel-7402, SK-HEP-1, MDA-MB-468, A431, HEP G2, MDA-MB-453, HLE, A549 и SNU-398.
Таблица 10. Ингибирующее действие рекомбинантного белка, как показано в SEQ ID NO: 14, на пролиферацию линий опухолевых клеток
(измеренная на проточном цитометре)
Пример 12. Доклиническая оценка безопасности рекомбинантного белка
(1) Эксперимент по гемолизу человеческих эритроцитов in vitro.
В данном примере исследовали, вызывает ли рекомбинантный белок, как показано в SEQ ID NO: 14, лизис или агрегацию человеческих эритроцитов.
Используя пробирочный метод in vitro, влияние тестируемого продукта (т.е. рекомбинантного белка, как показано в SEQ ID NO: 14) на лизис и агрегацию эритроцитов человека. Используемая концентрация препарата составляла 2,5 мг/мл.
Эритроциты, собранные у здорового лица, подготавливали в виде 2% (об/об) суспензии с раствором хлорида натрия для инъекций. Разные объемы (2,5-2,9 мл) раствора хлорида натрия для инъекций и разные объемы (0,5-0,1 мл) тестируемых препаратов добавляли в стеклянные пробирки, содержащие 2,0 мл 2% суспензии человеческих эритроцитов соответственно. Одновременно в стеклянные пробирки, содержащие 2,0 мл 2% суспензии человеческих эритроцитов, добавляли 3,0 мл раствора хлорида натрия для инъекций и 3,0 мл стерильной воды для инъекций и использовали в качестве отрицательного и положительного контроля соответственно. Общий объем каждой пробирки составлял 5,0 мл. Пробирки инкубировали в электротермическом инкубаторе в течение 3 часов и наблюдали за растворением и агрегацией эритроцитов.
Результаты показывают, что в пробирке, содержащей образец, и пробирке, содержащей отрицательный контроль, раствор хлорида натрия для инъекций, эритроциты оседали на дно пробирки, а верхний раствор был бесцветным и прозрачным. После встряхивания эритроциты на дне пробирки равномерно диспергировались без гемолиза и коагуляции. В пробирке, содержащей положительный контроль, стерильную воду для инъекций, раствор имел прозрачный красный цвет, разделения слоев не наблюдалось, на дне пробирки не наблюдалось остатков клеток, и полный гемолиз наблюдали в пробирке, содержащей положительный контроль, стерильную воду, для инъекций.
Можно видеть, что тестируемый препарат в концентрации 2,5 мг/мл не вызывает гемолиз и агрегацию человеческих эритроцитов in vitro.
(2) Токсикологическое исследование на миниатюрных свиньях Бама
В этом примере изучаются токсическая реакция и метаболизм in vivo у миниатюрных свиней Бама после внутривенной инфузии рекомбинантного белка, как показано в SEQ ID NO: 14, и восстановление токсической реакции через 4 недели после периода введения.
40 миниатюрных свиней породы Бама (20 свиней/пол) случайным образом разделяли на 4 группы, по 5 свиней/пол в каждой группе. Группа 1 получала плацебо в качестве адъювантного контроля, а Группы 2, 3 и 4 получали по 0,5 мг/кг, 1,5 мг/кг, 5,0 мг/кг тестируемого продукта (т.е. рекомбинантного белка, как показано в SEQ ID NO: 14). Введение производили путем внутривенной инфузии один раз в сутки в течение 28 дней. Вводимый объем составлял 2 мл/кг, скорость инфузии - 30 мл/кг/ч. Первых 3 животных/пол/группа умерщвляли через 4 недели введения (т.е. D29), а остальных 2 животных/пол/группа умерщвляли через 4 недели восстановления после последнего введения (D57).
В ходе эксперимента животных подвергали клиническому наблюдению, измерению массы, температуры, электрокардиограммы, офтальмологическому осмотру, общему анализу крови, исследованию функции свертывания крови, биохимии крови, исследованию мочи, анализу подгрупп T-лимфоцитов, обнаружению антител, исследованию токсикокинетики, массы органов, макроскопическому исследованию и патогистологическому исследованию.
Результаты показывают, что когда миниатюрным свиньям Бама многократно внутривенно вводили 0,5 мг/кг, 1,5 мг/кг и 5 мг/кг тестируемого препарата один раз в день в течение 28 дней, в каждой группе у животных не было обнаружено ни смерти, ни предсмертного состояния; серьезных клинических токсических и побочных эффектов не было обнаружено; не было обнаружено токсикологических изменений веса и прироста веса, при офтальмологическом обследовании, анализе мочи и анализе подгрупп T-лимфоцитов у животных в каждой дозовой группе; не было обнаружено статистически значимых изменений массы органов, соотношении массы органов/мозга в D29 или D57 в каждой дозовой группе; и не было обнаружено никаких патологических изменений, связанных с тестируемым продуктом, при макроскопическом и микроскопическом исследовании в конце периода введения (D29) и в конце периода восстановления (D57).
(3) Исследование фармакологической безопасности влияния на функцию дыхательной системы
В этом примере изучали влияние внутривенной инъекции рекомбинантного белка, показанного в SEQ ID NO: 14, на функцию дыхательной системы у крыс.
40 крыс линии SD (20 крыс/пол, категории SPF) случайным образом распределяли в 4 группы по 10 крыс в каждой группе (5 крыс/пол), которым вводили адъювантный контроль и 0,5, 2, 8 мг/кг тестируемого препарата (т.е. рекомбинантного белка, как показано в SEQ ID NO: 14), однократно путем внутривенной инъекции. Вводимый объем составлял 10 мл/кг. За день до введения, через 10 мин после введения и через 24 часа после введения животных помещали в бокс для наблюдения с целью определения показателей дыхательной функции животных.
Результаты показывают, что по сравнению с контрольной группой, получавшей адъювант, не было обнаружено статистических различий (P>0,05) и тенденции к изменению дыхательного объема, объема легочной вентиляции в минуту и частоты дыхательных движений у животных в исследуемой группе за день до введения, через 10 мин после введения и через 24 ч после введения.
Таким образом, однократное введение исследуемого препарата в дозе 0,5, 2, 8 мг/кг путем внутривенной инъекции не оказывало значимого влияния на функцию дыхательной системы у крыс SD.
(4) Исследование фармакологической безопасности влияния на функцию центральной нервной системы
В данном примере изучали влияние внутривенной инъекции рекомбинантного белка, показанного в SEQ ID NO: 14, на функцию центральной нервной системы у крыс.
40 крыс линии SD (20 крыс/пол, категории SPF) случайным образом распределяли в 4 группы по 10 крыс в каждой группе (5 крыс/пол), которым вводили адъювантный контроль и 0,5, 2, 8 мг/кг тестируемого препарата (т.е. рекомбинантного белка, как показано в SEQ ID NO: 14), однократно путем внутривенной инъекции. Объем введения составлял 10 мл/кг. Тест проводили слепым методом, и наблюдатель-исследователь не имел доступа к информации о введении. За день до введения, через 10 минут после введения и через 24 часа после введения животных наблюдали в одном и том же эксперименте с использованием метода комбинации функциональных наблюдательных тестов (FOB) и регистрировали результаты. FOB включает наблюдение в клетке, наблюдение цепкости-тяги конечностей, наблюдение в открытом поле и наблюдение реакций на стимул, а также измерение силы захвата передних конечностей, диапазона разгибания задних конечностей и температуры. Статистический анализ проводили путем вычитания значения до применения лекарственного препарата из данных после применения лекарственного препарата.
Результаты показывают, что по сравнению с контрольной группой, получавшей адъювант, не было обнаружено никаких отклонений от нормы при наблюдении в клетке, наблюдении цепкости-тяги конечностей, наблюдении в открытом поле и наблюдении реакций на стимул, а также при измерении силы захвата передних конечностей, диапазона разгибания задних конечностей и температуры у животных в различных исследуемых группах через 10 минут и 24 часа после введения.
Можно видеть, что однократное введение исследуемого препарата в дозе 0,5, 2, 8 мг/кг путем внутривенной инъекции не оказывало существенного влияния на функцию центральной нервной системы у крыс SD.
(5) Исследование фармакологической безопасности влияния на функцию сердечно-сосудистой системы
В этом примере изучали влияние внутривенной инъекции рекомбинантного белка, как показано в SEQ ID NO: 14, на функцию сердечно-сосудистой системы у бодрствующих миниатюрных свиней породы Бама.
Использовали 8 миниатюрных свиней Бама (4 свиньи/пол, обычной категории) и применяли перекрестную схему исследования. По 0,5 мг/кг и 3 мг/кг тестируемого продукта (т.е. рекомбинантного белка, как показано в SEQ ID NO: 14) и адъювантного контроля вводили внутривенно (дозы 0,5 мг/кг и 3 мг/кг тестируемого препарата превышали эффективную дозу приблизительно в 8,4 и 50,6 раза соответственно), вводимый объем составлял 2 мл/кг, и скорость введения составляла 30 мл/кг/ч. Собирали данные по различным показателям, включая ЭКГ, артериальное давление и температуру у животных, от по меньшей мере 2 часов до введения до по меньшей мере 48 часов после введения, и проводили статистический анализ и оценку различных показателей ЭКГ, артериального давления и температуры в точке времени в пределах 1,5 часов до введения, а также в точках времени 0,25 часа (±5 мин), 0,5 часа (±5 мин), 1 час (±10 мин), 1,5 часа (±10 мин), 2 часа (±10 мин), 3 часа (±15 мин), 4 часа (±20 мин), 6 часов (±30 мин), 8 часов (±45 мин), 12 часов (±45 мин), 24 часа (±1 час), 48 часов (±1 ч) после введения.
Результаты показывают, что по сравнению с адъювантным контролем введение 3 мг/кг тестируемого препарата приводит к увеличению частоты сердечных сокращений в течение 0,5-6 часов после введения. Интервал QTcB сокращался в течение 2-4 часов. Амплитуда Т-зубца повышалась в течение 0,5-6 часов.
По сравнению с адъювантным контролем, изменение, связанное с частотой сердечных сокращений, наблюдали в интервале RR, интервале PR и интервале QT после введения 3 мг/кг тестируемого препарата.
Статистического различия (P>0,05) по другим показателям ЭКГ (продолжительность QRS, амплитуда QRS, амплитуда сегмента ST, интервал Tp-e, ширина P-зубца), показателям артериального давления (различия систолического артериального давления, диастолического артериального давления, среднего артериального давления, пульсового артериального давления) и температуры у животных с разными дозами тестируемого препарата не было обнаружено, и не было обнаружено тенденции к изменению.
Можно видеть, что внутривенное введение тестируемого препарата в диапазоне фармакодинамических доз не оказывало значимого влияния на сердечно-сосудистую функцию и температуру у бодрствующих миниатюрных свиней Бама.
Таким образом, что касается тестируемого препарата, в диапазоне фармакодинамической дозы не было обнаружено поражений ни одного потенциального органа-мишени; не было обнаружено необратимой токсичности; не было обнаружено значимого воздействия на функции центральной нервной системы, органов дыхания и сердечно-сосудистой системы.
Вышеизложенное подробное описание представлено в иллюстративной и примерной форме и не предназначено для ограничения объема прилагаемой формулы изобретения. Различные модификации вариантов осуществления, перечисленные на текущий момент в настоящей заявке очевидны для специалистов в данной области и включены в объем прилагаемой формулы изобретения и ее эквивалентов.
--->
<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3"
fileName="0195-PA-004RU_Sequence Listing.xml" softwareName="WIPO
Sequence" softwareVersion="2.1.0" productionDate="2022-11-25">
<ApplicantFileReference>0195-PA-004RU</ApplicantFileReference>
<EarliestPriorityApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>CN</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText>CN2021109086972</ApplicationNumberText>
<FilingDate>2021-08-09</FilingDate>
</EarliestPriorityApplicationIdentification>
<ApplicantName languageCode="en">Changchun Intellicrown
Pharmaceutical Co., Ltd.</ApplicantName>
<InventionTitle languageCode="en">НОВЫЙ МУТАНТ РЕКОМБИНАНТНОГО
ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕГО БЕЛКА GANODERMA LUCIDUM И ЕГО
ПРИМЕНЕНИЕ</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>33</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>40</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>ДНК</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>прочие_признаки</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..40</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier id="q1">
<INSDQualifier_name>примечание</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Прямой праймер F</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..40</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>тип_молекулы</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>другая ДНК</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q67">
<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>синтетическая конструкция</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ccgctcgagaaaagaatgtctgatactgctttgatcttca</INSDSeq_se
quence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>27</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>ДНК</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>прочие_признаки</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..27</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier id="q68">
<INSDQualifier_name>примечание</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Обратный праймер R</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..27</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>тип_молекулы</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>другая ДНК</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q69">
<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>синтетическая конструкция</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gctctagactagttccattgagcgata</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="3">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>27</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>ДНК</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>прочие_признаки</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..27</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier id="q70">
<INSDQualifier_name>примечание</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Прямой праймер F3</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..27</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>тип_молекулы</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>другая ДНК</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q71">
<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>синтетическая конструкция</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ccgctcgagaaaagagaggctgaagct</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="4">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>ДНК</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>прочие_признаки</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier id="q72">
<INSDQualifier_name>примечание</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Обратный праймер R3</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>тип_молекулы</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>другая ДНК</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q73">
<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>синтетическая конструкция</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gctctagatcactagttccattg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="5">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>ДНК</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>прочие_признаки</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier id="q74">
<INSDQualifier_name>примечание</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Прямой праймер M13F</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>тип_молекулы</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>другая ДНК</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q75">
<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>синтетическая конструкция</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cccagtcacgacgttgtaaaacg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="6">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>ДНК</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>прочие_признаки</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier id="q76">
<INSDQualifier_name>примечание</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Обратный праймер M13R</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>тип_молекулы</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>другая ДНК</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q77">
<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>синтетическая конструкция</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>agcggataacaatttcacacagg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="7">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>70</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>ДНК</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>прочие_признаки</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..70</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier id="q78">
<INSDQualifier_name>примечание</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Прямой праймер F2</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..70</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>тип_молекулы</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>другая ДНК</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q79">
<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>синтетическая конструкция</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ccgctcgagaaaagagaagaggccgaagccgaagcagaacctaaaatgtctg
atactgctttgatcttca</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="8">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>4</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>АК</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>ОБЛАСТЬ</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..4</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier id="q80">
<INSDQualifier_name>примечание</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>последовательность спейсерного пептида
1</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..4</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>тип_молекулы</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>белок</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q81">
<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>синтетическая конструкция</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>EAEA</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="9">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>10</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>АК</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>ОБЛАСТЬ</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..10</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier id="q82">
<INSDQualifier_name>примечание</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>последовательность спейсерного пептида
2</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..10</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>тип_молекулы</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>белок</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q83">
<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>синтетическая конструкция</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>EEAEAEAEPK</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="10">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>111</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>АК</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>ОБЛАСТЬ</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..111</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier id="q84">
<INSDQualifier_name>примечание</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>rLZ-8</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..111</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>тип_молекулы</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>белок</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q85">
<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>синтетическая конструкция</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>MSDTALIFRLAWDVKKLSFDYTPNWGRGNPNNFIDTVTFPKVLTDKAYTYRV
AVSGRNLGVKPSYAVESDGSQKVNFLEYNSGYGIADTNTIQVFVVDPDTNNDFIIAQWN</INSDSeq_s
equence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="11">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>115</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>АК</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>ОБЛАСТЬ</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..115</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier id="q86">
<INSDQualifier_name>примечание</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>EAEA-rLZ-8</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..115</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>тип_молекулы</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>белок</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q87">
<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>синтетическая конструкция</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>EAEAMSDTALIFRLAWDVKKLSFDYTPNWGRGNPNNFIDTVTFPKVLTDKAY
TYRVAVSGRNLGVKPSYAVESDGSQKVNFLEYNSGYGIADTNTIQVFVVDPDTNNDFIIAQWN</INSDS
eq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="12">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>121</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>АК</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>ОБЛАСТЬ</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..121</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier id="q88">
<INSDQualifier_name>примечание</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>EEAEAEAEPK-rLZ-8</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..121</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>тип_молекулы</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>белок</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q89">
<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>синтетическая конструкция</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>EEAEAEAEPKMSDTALIFRLAWDVKKLSFDYTPNWGRGNPNNFIDTVTFPKV
LTDKAYTYRVAVSGRNLGVKPSYAVESDGSQKVNFLEYNSGYGIADTNTIQVFVVDPDTNNDFIIAQWN<
/INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="13">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>111</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>АК</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>ОБЛАСТЬ</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..111</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier id="q90">
<INSDQualifier_name>примечание</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>rLZ-8 мутант (D70K)</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..111</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>тип_молекулы</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>белок</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q91">
<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>синтетическая конструкция</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>MSDTALIFRLAWDVKKLSFDYTPNWGRGNPNNFIDTVTFPKVLTDKAYTYRV
AVSGRNLGVKPSYAVESKGSQKVNFLEYNSGYGIADTNTIQVFVVDPDTNNDFIIAQWN</INSDSeq_s
equence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="14">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>115</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>АК</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>ОБЛАСТЬ</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..115</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier id="q92">
<INSDQualifier_name>примечание</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>EAEA-rLZ-8 мутант (D70K)</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..115</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>тип_молекулы</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>белок</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q93">
<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>синтетическая конструкция</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>EAEAMSDTALIFRLAWDVKKLSFDYTPNWGRGNPNNFIDTVTFPKVLTDKAY
TYRVAVSGRNLGVKPSYAVESKGSQKVNFLEYNSGYGIADTNTIQVFVVDPDTNNDFIIAQWN</INSDS
eq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="15">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>121</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>АК</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>ОБЛАСТЬ</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..121</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier id="q94">
<INSDQualifier_name>примечание</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>EEAEAEAEPK-rLZ-8 мутант
(D70K)</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..121</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>тип_молекулы</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>белок</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q95">
<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>синтетическая конструкция</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>EEAEAEAEPKMSDTALIFRLAWDVKKLSFDYTPNWGRGNPNNFIDTVTFPKV
LTDKAYTYRVAVSGRNLGVKPSYAVESKGSQKVNFLEYNSGYGIADTNTIQVFVVDPDTNNDFIIAQWN<
/INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="16">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>111</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>АК</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>ОБЛАСТЬ</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..111</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier id="q96">
<INSDQualifier_name>примечание</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>rLZ-8 мутант 1 (R9A)</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..111</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>тип_молекулы</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>белок</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q97">
<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>синтетическая конструкция</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>MSDTALIFALAWDVKKLSFDYTPNWGRGNPNNFIDTVTFPKVLTDKAYTYRV
AVSGRNLGVKPSYAVESDGSQKVNFLEYNSGYGIADTNTIQVFVVDPDTNNDFIIAQWN</INSDSeq_s
equence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="17">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>111</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>АК</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>ОБЛАСТЬ</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..111</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier id="q98">
<INSDQualifier_name>примечание</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>rLZ-8 мутант 2 (L17K/D70K)</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..111</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>тип_молекулы</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>белок</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q99">
<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>синтетическая конструкция</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>MSDTALIFRLAWDVKKKSFDYTPNWGRGNPNNFIDTVTFPKVLTDKAYTYRV
AVSGRNLGVKPSYAVESKGSQKVNFLEYNSGYGIADTNTIQVFVVDPDTNNDFIIAQWN</INSDSeq_s
equence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="18">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>111</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>АК</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>ОБЛАСТЬ</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..111</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier id="q100">
<INSDQualifier_name>примечание</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>rLZ-8 мутант 3 (D20H)</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..111</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>тип_молекулы</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>белок</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q101">
<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>синтетическая конструкция</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>MSDTALIFRLAWDVKKLSFHYTPNWGRGNPNNFIDTVTFPKVLTDKAYTYRV
AVSGRNLGVKPSYAVESDGSQKVNFLEYNSGYGIADTNTIQVFVVDPDTNNDFIIAQWN</INSDSeq_s
equence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="19">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>111</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>АК</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>ОБЛАСТЬ</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..111</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier id="q102">
<INSDQualifier_name>примечание</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>rLZ-8 мутант 4 (L17K)</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..111</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>тип_молекулы</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>белок</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q103">
<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>синтетическая конструкция</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>MSDTALIFRLAWDVKKKSFDYTPNWGRGNPNNFIDTVTFPKVLTDKAYTYRV
AVSGRNLGVKPSYAVESDGSQKVNFLEYNSGYGIADTNTIQVFVVDPDTNNDFIIAQWN</INSDSeq_s
equence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="20">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>111</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>АК</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>ОБЛАСТЬ</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..111</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier id="q104">
<INSDQualifier_name>примечание</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>rLZ-8 мутант 5 (K46E/K74E)</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..111</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>тип_молекулы</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>белок</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q105">
<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>синтетическая конструкция</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>MSDTALIFRLAWDVKKLSFDYTPNWGRGNPNNFIDTVTFPKVLTDEAYTYRV
AVSGRNLGVKPSYAVESDGSQEVNFLEYNSGYGIADTNTIQVFVVDPDTNNDFIIAQWN</INSDSeq_s
equence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="21">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>111</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>АК</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>ОБЛАСТЬ</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..111</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier id="q106">
<INSDQualifier_name>примечание</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>rLZ-8 мутант 6 (K46E)</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..111</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>тип_молекулы</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>белок</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q107">
<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>синтетическая конструкция</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>MSDTALIFRLAWDVKKLSFDYTPNWGRGNPNNFIDTVTFPKVLTDEAYTYRV
AVSGRNLGVKPSYAVESDGSQKVNFLEYNSGYGIADTNTIQVFVVDPDTNNDFIIAQWN</INSDSeq_s
equence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="22">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>115</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>АК</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>ОБЛАСТЬ</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..115</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier id="q108">
<INSDQualifier_name>примечание</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>EAEA+мутант 1 (R9A)</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..115</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>тип_молекулы</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>белок</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q109">
<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>синтетическая конструкция</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>EAEAMSDTALIFALAWDVKKLSFDYTPNWGRGNPNNFIDTVTFPKVLTDKAY
TYRVAVSGRNLGVKPSYAVESDGSQKVNFLEYNSGYGIADTNTIQVFVVDPDTNNDFIIAQWN</INSDS
eq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="23">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>115</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>АК</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>ОБЛАСТЬ</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..115</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier id="q110">
<INSDQualifier_name>примечание</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>EAEA+мутант 2 (L17K/D70K)</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..115</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>тип_молекулы</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>белок</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q111">
<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>синтетическая конструкция</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>EAEAMSDTALIFRLAWDVKKKSFDYTPNWGRGNPNNFIDTVTFPKVLTDKAY
TYRVAVSGRNLGVKPSYAVESKGSQKVNFLEYNSGYGIADTNTIQVFVVDPDTNNDFIIAQWN</INSDS
eq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="24">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>115</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>АК</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>ОБЛАСТЬ</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..115</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier id="q112">
<INSDQualifier_name>примечание</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>EAEA+мутант 3 (D20H)</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..115</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>тип_молекулы</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>белок</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q113">
<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>синтетическая конструкция</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>EAEAMSDTALIFRLAWDVKKLSFHYTPNWGRGNPNNFIDTVTFPKVLTDKAY
TYRVAVSGRNLGVKPSYAVESDGSQKVNFLEYNSGYGIADTNTIQVFVVDPDTNNDFIIAQWN</INSDS
eq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="25">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>115</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>АК</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>ОБЛАСТЬ</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..115</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier id="q114">
<INSDQualifier_name>примечание</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>EAEA+мутант 4 (L17K)</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..115</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>тип_молекулы</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>белок</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q115">
<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>синтетическая конструкция</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>EAEAMSDTALIFRLAWDVKKKSFDYTPNWGRGNPNNFIDTVTFPKVLTDKAY
TYRVAVSGRNLGVKPSYAVESDGSQKVNFLEYNSGYGIADTNTIQVFVVDPDTNNDFIIAQWN</INSDS
eq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="26">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>115</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>АК</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>ОБЛАСТЬ</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..115</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier id="q116">
<INSDQualifier_name>примечание</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>EAEA+мутант 5 (K46E/K74E)</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..115</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>тип_молекулы</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>белок</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q117">
<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>синтетическая конструкция</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>EAEAMSDTALIFRLAWDVKKLSFDYTPNWGRGNPNNFIDTVTFPKVLTDEAY
TYRVAVSGRNLGVKPSYAVESDGSQEVNFLEYNSGYGIADTNTIQVFVVDPDTNNDFIIAQWN</INSDS
eq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="27">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>115</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>АК</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>ОБЛАСТЬ</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..115</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier id="q118">
<INSDQualifier_name>примечание</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>EAEA+мутант 6 (K46E)</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..115</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>тип_молекулы</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>белок</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q119">
<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>синтетическая конструкция</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>EAEAMSDTALIFRLAWDVKKLSFDYTPNWGRGNPNNFIDTVTFPKVLTDEAY
TYRVAVSGRNLGVKPSYAVESDGSQKVNFLEYNSGYGIADTNTIQVFVVDPDTNNDFIIAQWN</INSDS
eq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="28">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>121</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>АК</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>ОБЛАСТЬ</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..121</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier id="q120">
<INSDQualifier_name>примечание</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>EEAEAEAEPK+мутант 1 (R9A)</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..121</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>тип_молекулы</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>белок</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q121">
<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>синтетическая конструкция</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>EEAEAEAEPKMSDTALIFALAWDVKKLSFDYTPNWGRGNPNNFIDTVTFPKV
LTDKAYTYRVAVSGRNLGVKPSYAVESDGSQKVNFLEYNSGYGIADTNTIQVFVVDPDTNNDFIIAQWN<
/INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="29">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>121</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>АК</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>ОБЛАСТЬ</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..121</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier id="q122">
<INSDQualifier_name>примечание</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>EEAEAEAEPK+мутант 2
(L17K/D70K)</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..121</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>тип_молекулы</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>белок</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q123">
<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>синтетическая конструкция</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>EEAEAEAEPKMSDTALIFRLAWDVKKKSFDYTPNWGRGNPNNFIDTVTFPKV
LTDKAYTYRVAVSGRNLGVKPSYAVESKGSQKVNFLEYNSGYGIADTNTIQVFVVDPDTNNDFIIAQWN<
/INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="30">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>121</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>АК</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>ОБЛАСТЬ</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..121</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier id="q124">
<INSDQualifier_name>примечание</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>EEAEAEAEPK+мутант 3 (D20H)</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..121</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>тип_молекулы</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>белок</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q125">
<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>синтетическая конструкция</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>EEAEAEAEPKMSDTALIFRLAWDVKKLSFHYTPNWGRGNPNNFIDTVTFPKV
LTDKAYTYRVAVSGRNLGVKPSYAVESDGSQKVNFLEYNSGYGIADTNTIQVFVVDPDTNNDFIIAQWN<
/INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="31">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>121</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>АК</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>ОБЛАСТЬ</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..121</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier id="q126">
<INSDQualifier_name>примечание</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>EEAEAEAEPK+мутант 4 (L17K)</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..121</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>тип_молекулы</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>белок</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q127">
<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>синтетическая конструкция</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>EEAEAEAEPKMSDTALIFRLAWDVKKKSFDYTPNWGRGNPNNFIDTVTFPKV
LTDKAYTYRVAVSGRNLGVKPSYAVESDGSQKVNFLEYNSGYGIADTNTIQVFVVDPDTNNDFIIAQWN<
/INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="32">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>121</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>АК</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>ОБЛАСТЬ</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..121</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier id="q128">
<INSDQualifier_name>примечание</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>EEAEAEAEPK+мутант 5
(K46E/K74E)</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..121</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>тип_молекулы</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>белок</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q129">
<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>синтетическая конструкция</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>EEAEAEAEPKMSDTALIFRLAWDVKKLSFDYTPNWGRGNPNNFIDTVTFPKV
LTDEAYTYRVAVSGRNLGVKPSYAVESDGSQEVNFLEYNSGYGIADTNTIQVFVVDPDTNNDFIIAQWN<
/INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="33">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>121</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>АК</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>ОБЛАСТЬ</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..121</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier id="q130">
<INSDQualifier_name>примечание</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>EEAEAEAEPK+мутант 6 (K46E)</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>источник</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..121</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>тип_молекулы</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>белок</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q131">
<INSDQualifier_name>организм</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>синтетическая конструкция</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>EEAEAEAEPKMSDTALIFRLAWDVKKLSFDYTPNWGRGNPNNFIDTVTFPKV
LTDEAYTYRVAVSGRNLGVKPSYAVESDGSQKVNFLEYNSGYGIADTNTIQVFVVDPDTNNDFIIAQWN<
/INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
</ST26SequenceListing>
<---
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| БИСПЕЦИФИЧЕСКОЕ АНТИТЕЛО И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ | 2021 |
|
RU2839153C2 |
| БЕЛОК СЛИЯНИЯ НАЦЕЛЕННОГО НА GPC3 АНТИТЕЛА И ИНТЕРФЕРОНА α И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ | 2022 |
|
RU2836245C2 |
| АНТИТЕЛО ПРОТИВ ЛИГАНДА 1 ЗАПРОГРАММИРОВАННОЙ ГИБЕЛИ КЛЕТОК (PD-L1), ЕГО АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЙ ФРАГМЕНТ И ИХ МЕДИЦИНСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ | 2016 |
|
RU2727914C2 |
| ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, ОБЛАДАЮЩАЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫМ ЭФФЕКТОМ, И СПОСОБ СНИЖЕНИЯ ИНГИБИРУЮЩЕГО ЭФФЕКТА PD-L1 НА Т-КЛЕТКИ ЧЕЛОВЕКА | 2016 |
|
RU2688692C2 |
| АНТИТЕЛА ПРОТИВ ЛИГАНДА ПРОГРАММИРУЕМОЙ СМЕРТИ (PD-L1) И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ | 2019 |
|
RU2761638C1 |
| БИСПЕЦИФИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ | 2022 |
|
RU2821577C2 |
| АНТИТЕЛО MICA С СОЗРЕВАНИЕМ АФФИННОСТИ И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ | 2024 |
|
RU2838565C1 |
| АНТИТЕЛО К PD-L1, ЕГО АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЙ ФРАГМЕНТ И ИХ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ | 2019 |
|
RU2778085C2 |
| ПЕПТИДЫ, СПОСОБНЫЕ РЕАКТИВИРОВАТЬ МУТАНТЫ Р53 | 2014 |
|
RU2693487C2 |
| СЛИТЫЙ БЕЛОК И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ | 2020 |
|
RU2811120C2 |
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантным противоопухолевым белкам, и может быть использовано в медицине в лечении опухоли. Предложены белок, состоящий из спейсерного пептида и мутанта рекомбинантного иммуномодулирующего белка Ganoderma lucidum (мутант rLZ-8), а также средства для его рекомбинантного получения, содержащие его средства и способ использования в противоопухолевой терапии. Изобретение обеспечивает лечение опухоли посредством цитотоксической активности за счет использования предложенного белка, обладающего высокой способностью убивать опухолевые клетки. 7 н. и 6 з.п. ф-лы, 25 ил., 10 табл., 12 пр.
1. Рекомбинантный белок для лечения опухоли посредством цитотоксической активности, состоящий из спейсерного пептида и мутанта рекомбинантного иммуномодулирующего белка Ganoderma lucidum (мутант rLZ-8), где аминокислотная последовательность указанного рекомбинантного белка представлена в SEQ ID NO: 14.
2. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая рекомбинантный белок по п.1.
3. Вектор экспрессии, включающий выделенную молекулу нуклеиновой кислоты по п.2.
4. Клетка для экспрессии рекомбинантного белка по п.1, включающая вектор экспрессии по п.3.
5. Клетка по п.4, которая является эукариоцитом.
6. Клетка по п.4 или 5, которая является дрожжевой клеткой.
7. Фармацевтическая композиция для использования в лечении опухоли, включающая эффективное количество рекомбинантного белка по п.1 и фармацевтически приемлемый носитель.
8. Набор для использования в лечении опухоли, связанной с экспрессией EGFR и/или аномальной экспрессией EGFR, включающий рекомбинантный белок по п.1, и где указанный набор дополнительно включает инструкцию.
9. Способ предупреждения, уменьшения или лечения опухоли, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества рекомбинантного белка по п.1.
10. Способ по п.9, где указанная опухоль включает солидную опухоль.
11. Способ по п.9 или 10, где указанная опухоль включает опухоль с экспрессией EGFR и/или аномальной экспрессией EGFR.
12. Способ по любому из пп.9-11, где указанная опухоль включает несолидную опухоль.
13. Способ по любому из пп.9-12, где указанная опухоль включает рак толстой и прямой кишки, рак легкого, рак печени, рак молочной железы, рак желудка, рак почки, рак мочевого пузыря, нейробластому, рак яичника, эпителиальную плоскоклеточную карциному и/или рак поджелудочной железы.
| СЛИТЫЙ БЕЛОК НА ОСНОВЕ РЕКОМБИНАНТНОГО ИММУНОРЕГУЛЯТОРНОГО БЕЛКА ГАНОДЕРМЫ И СЫВОРОТОЧНОГО АЛЬБУМИНА ЧЕЛОВЕКА, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ, А ТАКЖЕ ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ | 2014 |
|
RU2665802C2 |
| US 7601808 B2, 13.10.2009 | |||
| US 2019352345 A1, 21.11.2019 | |||
| EMBERSON L.M | |||
| et al., Expression of an anti-CD33 single-chain antibody by Pichia pastoris, Journal of Immunological Methods, 2005, v | |||
| Держатель для поленьев при винтовом колуне | 1920 |
|
SU305A1 |
| CN 105802989 A, 27.07.2016 | |||
| ПРИМЕНЕНИЕ ИММУНОРЕГУЛЯТОРНОГО БЕЛКА ГАНОДЕРМА (rLZ-8) В ПОЛУЧЕНИИ ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ МЕЛАНОМЫ | 2014 |
|
RU2649129C2 |
| YAMPOLSKY L.Y | |||
| et al., 1, The exchangeability of | |||
