ПРИМЕНЕНИЕ ИММУНОРЕГУЛЯТОРНОГО БЕЛКА ГАНОДЕРМА (rLZ-8) В ПОЛУЧЕНИИ ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ МЕЛАНОМЫ Российский патент 2018 года по МПК A61K38/16 A61K36/06 A61P35/00 A61P35/04 

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к области биомедицины и точнее к применению рекомбинантного иммунорегуляторного белка ганодерма (rLZ-8) в ингибировании роста и метастазирования меланомы.

Описание связанной области техники

Злокачественная меланома, так же известная как меланома или меланобластома, представляет собой рак меланоцитов с относительно высокой злокачественностью, преимущественно наблюдаемый в коже и также наблюдаемый в слизистых оболочках, приближенных к коже, таких как конъюнктива, полость рта, полость носа, анальный канал, прямая кишка, шейка матки, влагалище, пенис и головка полового члена. Европейское Обновление руководства по диагностике и лечению меланомы, в 2012, показало, что частота меланомы увеличивается, достигая 10-20/10⁵ в Европе, 20-23/10⁵ в Соединенных Штатах и 50-60/10⁵ в Австралии. Частота меланомы для китайцев с желтой кожей ниже чем 1/10⁵. В соответствии со статистикой ВОЗ (Всемирная Организация Здравоохранения) около 66000 людей умирает от рака кожи каждый год, из них 80% умирают от меланомы. Пациенты с распространенной меланомой имеют средний период выживаемости 7-9 месяцев и выживаемость в течение года около 25%.

Соответственно, в отношении метода лечения ортотопической меланомы, операция предпочтительна для лечения меланомы in situ; пациентов с метастазами опухоли преимущественно лечат системной терапией, которая сочетает несколько схем лечения. Системная терапия метастатической меланомы преимущественно включает таргетную терапию и химиотерапию. Исследования, связанные с таргетной терапией, демонстрируют, что для пациентов с мутацией V600E таргетная терапия, обеспечивая высокую степень ответа опухоли (около 50%), существенно не удлиняет время выживаемости по сравнению с Дакарбазином (DTIC). Данные по иммунотерапии показывают, что терапия анти-CTLA-4 антителом (ипилимумаб) является первым лекарственным средством, которое демонстрирует интегральные преимущества выживаемости для метастатической меланомы, но имеет частоту положительной реакции только около 10,9%. Химические лекарственные средства принадлежат к клинической терапии, которая в настоящее время имеет самую длительную историю применения, и являются наиболее широко применяемыми. Множество химических лекарственных средств имеют эквивалентные эффекты и применяются для системной химиотерапии распространенной меланомы. Химиотерапия может вызывать уменьшение размеров опухоли и уменьшение симптомов, связанных с опухолью, где DTIC является наиболее классическим лекарственным средством с эффективностью приблизительно 5-10%.

В качестве заключения, опухоль может быть ликвидирована посредством операции; однако, как только некоторые отдельные опухолевые клетки распространяются в теле, операция становится бесполезной. Неэффективно применять химиопрепараты у пациентов на ранней стадии опухоли; более того, резистентность к лекарственным средствам опухолевых клеток ухудшает эффективность химиопрепаратов в уничтожении раковых клеток и вызывает исключительно токсические побочные эффекты. Следовательно, лечение злокачественной меланомы главным образом осуществляют обычными методиками, а именно операцией, лучевой терапией и химиотерапией, и снова лучевой терапией и химиотерапией при любом рецидиве. Химиотерапию широко применяют при распространенной меланоме, и она в большинстве случаев не работает. Неспецифическая иммунотерапия редко дает продолжительный эффект. Следовательно, необходимо разработать новое лекарственное средство для облегчения симптомов пациентов со злокачественной меланомой и увеличения продолжительности жизни.

Иммунорегуляторный белок ганодерма (LZ-8) принадлежит к семейству иммунорегуляторных грибковых белков. Предшествующие исследования показали, что рекомбинантный LZ-8, полученный генно-инженерным способом, эффективно уничтожает человеческие клетки рака желудка (SGC-7901) и человеческие клетки карциномы легких (A549) in vitro. Не предполагали, что иммунорегуляторный белок rLZ-8 способен непосредственно уничтожать опухолевые клетки in vivo, так что нет сообщений про уровень rLZ-8 относительно опухолевых клеток in vivo. Жители востока всегда рассматривали ганодерму как лекарственное средство для большинства тяжелых заболеваний, являющееся наиболее важным среди китайских растительных лекарственных средств. В качестве одного компонента ганодерма rLZ-8, очевидно, что возможность применения rLZ-8 для лечения заболеваний человека должна быть оценена посредством антираковых исследований in vivo. В последние 6 лет авторы настоящего изобретения изучали уничтожающий эффект rLZ-8 в отношении почти сотен видов опухолевых клеток. Обнаружено, что только 10 видов опухолевых клеток, включая клетки рака печени Hep G2 и меланому, являются относительно чувствительными к уничтожающему эффекту rLZ-8 и демонстрируют достоверное отличие от группы отрицательного сравнения в отношении противоопухолевого эффекта, где уничтожающий эффект в отношении клеток меланомы является наиболее достоверным. Настоящее изобретение обеспечивает применение rLZ-8 в профилактике и лечении роста и метастазирования меланомы, улучшая выживаемость и удлиняя продолжительность жизни, и демонстрирует неожиданные эффекты rLZ-8 в уничтожении меланомы.

СУЩНОСТЬ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к применению rLZ-8 в получении лекарственного средства для лечения меланомы. Ряд экспериментов и результатов показали, что rLZ-8 обладает существенным ингибирующим эффектом в отношении меланомы, особенно, как указано далее.

В настоящем изобретении использовали мышей Kunming с опухолями в качестве объектов исследования, и создали экспериментальные модели на животных - мышей с трансплантированной меланомой, соответственно модель ортотопических опухолей и модель метастатических опухолей. В настоящем изобретении обеспечивают пять экспериментальных групп, включающих группу отрицательного сравнения (физиологический раствор), группу положительного сравнения (DTIC), группу с низкой дозировкой rLZ-8, группу со средней дозировкой rLZ-8 и группу с высокой дозировкой rLZ-8. Каждая группа включает 10 мышей с меланомой. Дозировка DTIC составляет 2,5 мг/кг; дозировки в группе с низкой дозой rLZ-8, группе со средней дозой rLZ-8 и группе с высокой дозой rLZ-8 составляют соответственно 123 мкг/кг, 246 мкг/кг и 492 мкг/кг. Обеспечивали два пути введения: непрерывное введение в течение 28 дней и непрерывное введение в течение 56 дней, таким образом, изучая влияние различных периодов введения лекарственного средства на эффект излечения. Исследуемые показатели эксперимента противоопухолевой фармакодинамики rLZ-8, главным образом, включают два жизненных аспекта и эффект излечения. В отношении жизненных аспектов мышей с опухолью наблюдали в отношении блеска шерсти, основного питания, экскрементов, движения и быстроты действия; в отношении аспекта излечения, главным образом, записывали и рассчитывали массу тела, массу опухоли, объем опухоли, количество лейкоцитов и смертность. В тесте нейтрализации rLZ-8 сыворотку крови нормальных макак (Macaca fascicularis) после продолжительного введения выбирали для исследования антител rLZ-8 посредством иммуноферментного анализа (ELISA) и исследовали нейтрализующую активность анти-rLZ-8 антител посредством метода биологической активности. Результаты теста показали, что rLZ-8 не создает нейтрализующих антител у Macaca fascicularis и что rLZ-8 не нейтрализуется антителами на всем протяжении процесса лечения меланомы. В исследовании токсичности rLZ-8 крысам SD, как объектам исследования, интраперитонеально вводили белок rLZ-8 непрерывно в течение 46 дней. Результаты теста показали, что белок rLZ-8 способен стимулировать рост крыс; и белок rLZ-8 не оказывает очевидного нежелательного эффекта на функцию печени и почек крыс. В исследовании токсичности, четко повышенная мочевая кислота (UA) играет важную роль в антиокислительной способности; белок rLZ-8 не оказывает очевидного неблагоприятного воздействия на основные органы крыс.

Результаты серии фармакодинамических экспериментов с rLZ-8 на экспериментальных моделях на животных с трансплантированной меланомой показали, что rLZ-8 способен улучшать выживаемость мышей с опухолями и обладает значительным противоопухолевым действием по сравнению с положительным сравнительным лекарственным средством DTIC.

В отношении степени ингибирования опухоли и переносимости лекарственного средства rLZ-8 способен значительно ингибировать рост ортотопических опухолей in vivo у мышей. Группа с высокой дозой rLZ-8, непрерывно вводимой в течение 28 дней, имела лучший ингибирующий эффект, чем группа положительного сравнения (DTIC). После непрерывного введения в течение 56 дней в группе с низкой дозой rLZ-8, группе со средней дозой rLZ-8 и группе с высокой дозой rLZ-8 наблюдали более высокую скорость ингибирования опухоли, чем в группе положительного сравнения (DTIC), и особенно степень ингибирования опухоли в группе с высокой дозой составила 95,66±1,77%, что редко встречается в фармакодинамических экспериментах использования противоопухолевых лекарственных средств in vivo. Между тем при сравнении данных каждой группы между введением в течение 28 дней и введением в течение 56 дней, степень ингибирования опухоли в группе DTIC снижалась, тогда как группы с любой дозировкой rLZ-8 демонстрировали увеличение около 15%. Это показывало, что мыши начинали формировать устойчивость к лекарственному средству DTIC во время лечения ортотопических опухолей in vivo, тогда как во всех группах с введением rLZ-8 устойчивости не развивалось. Следовательно, rLZ-8 является применимым для длительной терапии опухолей.

В отношении иммунной регуляции организма и безопасности, настоящее изобретение включает исследование образца крови из хвостовой вены в определенном экспериментальном периоде для мышей с опухолями. Гематологический анализатор определял количество лейкоцитов в каждом образце крови. Обнаружено, что количество лейкоцитов у мышей с опухолями в группе с любой дозировкой rLZ-8 всегда сохранялось на относительно высоком уровне в нормальном диапазоне, тогда как количество лейкоцитов у мышей с опухолями в группе положительного сравнения (DTIC) было существенно изменено. Количество лейкоцитов у мышей с опухолями в группе положительного сравнения существенно снижалось при увеличении продолжительности лечения; иммунитет организма существенно нарушался и проявлялся выраженный токсический эффект. Исследование образцов крови из хвостовой вены показало, что в группе rLZ-8 удавалось поддерживать количество лейкоцитов в организме и сохранять стабильность иммунной системы организма в течение процесса подавления роста и метастазирования меланомы, что четко доказывает безопасность rLZ-8 в лечении мышей с опухолями.

В отношении степени удлинения продолжительности жизни, тест rLZ-8 в оценке продолжительности жизни у мышей с опухолями показал, что rLZ-8 достоверно увеличивает продолжительность жизни у мышей с опухолями по сравнению с DTIC. При помощи создания экспериментальной модели метастазов меланомы в легких было обнаружено, что rLZ-8 достоверно ингибирует образование и рост метастазов меланомы в легких и достоверно обладает лучшим эффектом, чем средство положительного сравнения DTIC.

Настоящее изобретение имеет следующие преимущества. Описание настоящего изобретения доказывает, что rLZ-8 является применимым в получении лекарственного средства для лечения меланомы. rLZ-8 способен уничтожать клетки меланомы in vivo при поддержании количества лейкоцитов организма; более того, rLZ-8 способен эффективно контролировать метастазирование опухолевых клеток в другие ткани, не вызывая устойчивости и с хорошей безопасностью. Описание, представленное выше, доказывает применение rLZ-8 в получении лекарственного средства для лечения меланомы с множества позиций.

Указанные и другие цели, характеристики и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из следующего подробного описания, приложенных чертежей и приложенной формулы изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1 представляет собой диаграмму изменения массы тела мышей, которым вводили rLZ-8 в течение 28 дней, в соответствии с примерами по настоящему изобретению.

Фиг.2 представляет собой диаграмму изменения массы тела мышей, которым вводили rLZ-8 в течение 56 дней, в соответствии с примерами по настоящему изобретению.

Фиг.3 представляет собой кривую количества лейкоцитов мышей в течение периода лечения в соответствии с примерами по настоящему изобретению.

Фиг.4 демонстрирует выживаемость каждой экспериментальной группы после смерти всей группы отрицательного сравнения мышей с метастазами в легких, в соответствии с примерами по настоящему изобретению.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНОГО ВАРИАНТА ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Пример 1: Уничтожение ортотопической меланомы in vivo, поддержание количества лейкоцитов и улучшение жизненных показателей мышей с опухолями посредством rLZ-8

Методы

(1) Материалы и реагенты

Самцов мышей Kunming в возрасте 6-8 недель, весом 18-22 г, покупали в Laboratory Animal Center of Norman Bethune University of Medical Science и содержали в специфических условиях без патогенов (SPF) в Northeast Normal University, при температуре, поддерживаемой на уровне (20±2)°C, и влажности 48% и с 12-часовым освещением. Мышам трансплантировали клеточную линию меланомы B16-F10.

Среда Игла, модифицированная Дульбекко (DMEM), фетальная бычья сыворотка, фосфатный буферный солевой раствор (PBS), трипсин-EDTA, диметилсульфоксид (DMSO), 0,9% раствор NaCl, Tris-HCl буфер с pH 7,6 для промывки, 0,05% трипсин, rLZ-8, и DTIC (средство положительного сравнения).

(2) Инструменты, оборудование и прибор

CO₂ термостатный инкубатор, микроскоп с инверсией, пипетка, пинцет, бокс, гематологический анализатор, низкоскоростная центрифуга, шкаф для хранения при ультранизких температурах, электронные весы, шкаф для свежего хранения, холодильник, стерилизатор, водяная баня, боксы для выращивания мышей, контейнеры для воды; одноразовые медицинские стерильные перчатки, медицинская стерильная вата, 50 мл центрифужные пробирки, наконечник для пипеток, криогенный флакон, 10 см плашки для культивирования клеток, культуральные колбы, 1,5 мл EP пробирки и камера для подсчета клеток; одноразовый 1 мл шприц, подстилка для мышей и корм для мышей.

(3) Группы и введение лекарственного средства

Клетки меланомы мышей B16-F10 культивировали в DMEM, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, при 37°C в CO₂ термостатном инкубаторе. 200 мкл суспензии клеток B16-F10 (содержащей 1×10⁷ клеток) вводили медленно подкожно в дорсо-вентральный бок мыши посредством 1 мл шприца, так, чтобы получить модель мыши с трансплантированной опухолью. Через 24 часа, мышам вводили в хвостовую вену rLZ-8 (123 мкг/кг, 246 мкг/кг и 492 мкг/кг), DTIC (2,5 мг/кг) и физиологический раствор соответственно. rLZ-8 вводили один раз в сутки; DTIC длительно вводили в хвостовую вену в течение 5 дней и вводили второй раз через 3 недели. В течение эксперимента наблюдали жизненные показатели мышей; мышей взвешивали раз в каждые 7 дней; образцы крови получали из хвостовых вен мышей каждые 2 недели; объем опухолей, подкожно введенных мышам, измеряли каждые 2 дня; для каждой группы опухоли иссекали в конце эксперимента и взвешивали на весах, массы записывали. В соответствии с формулой, что степень ингибирования роста опухоли = (средняя масса опухолей в группе физиологического раствора-средняя масса опухолей в группах, которым вводили лекарственное средство)/средняя масса опухоли в группе физиологического раствора, рассчитывали степень ингибирования rLZ-8 в отношении роста ортотопической опухоли.

Результаты

(1) Результаты анализа жизненных показателей

Через 28 дней непрерывного введения rLZ-8 мышам с опухолями, не наблюдали существенных различий в аспектах блеска шерсти, основного питания и экскрементов среди групп rLZ-8 (три дозировки), группы DTIC, группы физиологического раствора и нормальной группой; физиологическая группа хуже двигалась и была менее оживленной, чем группы rLZ-8 и группа DTIC, и особенно группа с высокой дозировкой rLZ-8 имела достоверно большую подвижность, чем группа с физиологическим раствором. Через 56 дней непрерывного введения rLZ-8 наблюдали, что группы, которым вводили rLZ-8, имели лучший блеск шерсти, чем группа отрицательного сравнения и группа DTIC.

(2) Результаты анализа влияния лечения лекарственным средством на массу тела мышей

Через 28 дней непрерывного введения rLZ-8 мышам с опухолями не наблюдали достоверных различий массы тела во всех группах до эксперимента; после эксперимента группа с высокой дозой rLZ-8 имела немного меньшую массу, чем другие группы, как показано на Фиг.1. После 56 дней непрерывного введения rLZ-8, группа rLZ-8 и группа DTIC имели большую массу, чем группа отрицательного сравнения, тогда как пять экспериментальных групп все имели меньшую массу, чем нормальная группа, как показано на Фиг.2. Через 28 дней непрерывного введения и затем 28 дней выращивания без введения лекарственного средства, в отношении массы тела, в конечном счете, выживших мышей, группа DTIC и группа с низкой дозировкой rLZ-8 имели меньшую массу, чем группа отрицательного сравнения, и пять экспериментальных групп имели меньшую массу, чем нормальная группа, что демонстрирует, что rLZ-8 способен регулировать у мышей состояние организма.

(3) Влияние лекарственного средства на морфологию опухоли мыши

Масса опухоли

Опухоли иссекали и взвешивали, и затем рассчитывали среднюю массу опухолей в каждой группе. Как показано в таблице 1 и таблице 2, после 28 дней введения rLZ-8 группа с высокой дозой rLZ-8 имела меньшую массу опухоли, чем группа DTIC; для трех групп rLZ-8 с постепенно повышаемой концентрацией rLZ-8 масса опухоли постепенно снижалась. Группы rLZ-8 имели достоверные отличия от группы отрицательного сравнения, тогда как группа с низкой дозой rLZ-8, группа со средней дозой rLZ-8 и группа с высокой дозой rLZ-8 имели достоверные различия (n=10, P<0,05). Когда введение лекарственного средства достигало 56 дней, при взвешивании опухолей выживших мышей группы rLZ-8 имели лучший эффект ингибирования опухоли, чем группа DTIC, и особенно группа с высокой дозой rLZ-8 имела достоверное отличие от группы DTIC (n=10, P<0,05). Следовательно, после 28 дней введения rLZ-8 группа с высокой дозой rLZ-8 имела меньшую массу опухоли, чем группа DTIC; среди трех групп rLZ-8 с постепенно увеличивающейся концентрацией rLZ-8 масса подкожной опухоли постепенно снижалась; когда продолжительность введения увеличивалась до 56 дней, масса опухолей выживших мышей показывала, что в группах rLZ-8 наблюдали значительный эффект ингибирования опухоли по сравнению с группой DTIC.

Объем опухоли

В течение 28 дней введения лекарственного средства с постепенным увеличением концентрации rLZ-8 объем подкожной опухоли постепенно уменьшался; группы rLZ-8 имели достоверно меньший объем опухолей, чем группа DTIC, и особенно группы rLZ-8 демонстрировали значительное ингибирование роста опухоли по сравнению с группой сравнения (n=10). В результате анализа объемов опухолей, как показано в таблице 1, для 28 дней введения лекарственного средства группа с высокой дозой rLZ-8 обладала более выраженной степенью ингибирования опухоли, чем группа DTIC; среди групп rLZ-8 при постепенном увеличении дозировки лекарственного средства степень ингибирования постепенно увеличивалась. Когда период введения лекарственного средства продлевался до 56 дней, группы rLZ-8 демонстрировали особенно значительную степень ингибирования опухоли по сравнению с группой DTIC.

(4) Результаты исследования реакции устойчивости организма к лекарственному средству относительно DTIC и rLZ-8

При ингибировании массы опухоли, DTIC и rLZ-8 оказывали определенное влияние на устойчивость организма к лекарственному средству. Как показано в таблице 1 и таблице 2, после введения DTIC в течение 28 дней и в течение 56 дней, степень ингибирования существенно снижалась, и скорость роста опухоли существенно увеличивалась, что подтверждало постепенное формирование устойчивости организма в отношении DTIC с увеличением периода введения DTIC, так что ингибирование опухоли ослаблялось; однако, после введения rLZ-8 в течение 28 дней и в течение 56 дней, степень ингибирования существенно увеличивалась, что показывало, что устойчивость организма не увеличивалась с увеличением периода введения rLZ-8, и дополнительно доказало, что rLZ-8 оказывал лечебный эффект существенно лучше, чем DTIC.

Таблица 1

Влияние rLZ-8 на рост ортотопической опухоли (введение в течение 28 дней)

Группа Вариант введения Непрерывное введение в течение 28 дней Количество животных Масса опухоли (г) Объем опухоли (мм³) Степень ингибирования роста опухоли (%) Физиологический раствор 10 1,24±0,47 1,1±0,38 - DTIC 10 0,23±0,12** 0,19±0,09** 81,26±0,27 Низкая доза rLZ-8 10 0,6±0,21^**## 0,5±0,14^**## 51,81±0,41^## Средняя доза rLZ-8 10 0,43±0,17^**## 0,36±0,14**^## 65,00±0,77^## Высокая доза rLZ-8 10 0,14±0,04^** 0,11±0,03^** 88,49±0,51^#

Обратите внимание: по сравнению с группой сравнения, ^**P<0,01, ^*P<0,05 тест повторяли три раза, с согласующейся общей тенденцией результатов, где вышеуказанная таблица показывает результаты теста; по сравнению с группой DTIC, ^##P<0,01, ^#P<0,05 тест повторяли три раза, с согласующейся общей тенденцией результатов, где вышеуказанная таблица демонстрирует результаты одного теста.

Таблица 2

Влияние rLZ-8 на рост ортотопической опухоли (введение в течение 56 дней)

Группа Вариант введения Непрерывное введение в течение 56 дней Количество животных Масса опухоли (г) Объем опухоли (мм³) Степень ингибирования роста опухоли (%) Физиологический раствор 10 3,40±0,87 2,83±0,77 - DTIC 8 0,87±0,26* 0,73±0,21* 64,42±0,41 Низкая доза rLZ-8 9 0,79±0,31** 0,65±0,24**# 76,76±0,53## Средняя доза rLZ-8 9 0,68±0,19**## 0,56±0,18**## 80,10±1,01## Высокая доза rLZ-8 10 0,15±0,07**## 0,13±0,09**## 95,66±1,77##

Обратите внимание: по сравнению с группой сравнения, ^**P<0,01, ^*P<0,05 тест повторяли три раза, с согласующимися тенденциями всех результатов, где вышеуказанная таблица показывает результаты одного теста; по сравнению с группой DTIC, ^##P<0,01, ^#P<0,05 тест повторяли три раза, с согласующимися общими тенденциями результатов, где вышеуказанная таблица демонстрирует результаты одного теста.

(5) Влияние rLZ-8 на количество лейкоцитов и безопасность

При введении в течение 28 дней постепенно повышающейся концентрации rLZ-8 количество лейкоцитов у мышей немного увеличивалось, тогда как количество лейкоцитов в группе положительного сравниваемого лекарственного средства (DTIC) явно снижалось; в частности, каждая группа rLZ-8 имела особенно значимое влияние на количество лейкоцитов по сравнению с группой сравнения (n=10). При увеличении времени введения до 56 дней количество лейкоцитов в каждой группе rLZ-8 достоверно отличалось от группы DTIC (n=10), как показано на Фиг.3; количество лейкоцитов группы DTIC достигало минимального значения. При введении лекарственного средства в течение 28 дней и дальнейшем выращивании без введения лекарственного средства, количество лейкоцитов в группе rLZ-8 немного снижалось; количество лейкоцитов в группе DTIC непрерывно снижалось и затем оставалось стабильным в течение некоторого времени. При анализе количества лейкоцитов, было показано, что группа rLZ-8 демонстрировала небольшое влияние на количество лейкоцитов в экспериментальном противоопухолевом лечении, тогда как в группе положительного сравниваемого лекарственного средства (DTIC) существенно снижалось количество лейкоцитов при экспериментальном противоопухолевом лечении, что повреждало и ослабляло иммунную систему организма, вызывая скрытую опасность иммунодефицита в процессе противоопухолевого лечения. Более того, в противоопухолевом эксперименте rLZ-8 оказался способен не только эффективно ингибировать рост опухоли, а также обладал функциями сохранения и защиты иммунитета организма. rLZ-8 имел лучшую безопасность, чем положительное сравниваемое лекарственное средство (DTIC).

(6) Влияние rLZ-8 на степень продления жизни у мышей с опухолями

После непрерывного введения лекарственного средства в течение 28 дней мыши не умирали в течение эксперимента. После непрерывного введения лекарственного средства в течение 56 дней смерть имела место в группе отрицательного сравнения и группе положительного сравниваемого лекарственного средства (DTIC), где массивную смертность наблюдали в группе положительного сравниваемого лекарственного средства (DTIC). Однако мыши не умирали во всех группах rLZ-8, как показано в таблице 3. Следовательно, rLZ-8 демонстрировал достоверное отличие в поддержании увеличения продолжительности жизни мышей с опухолями относительно DTIC, с достоверным преимуществом.

Таблица 3

Статистические результаты относительных индексов смерти мышей в течение введения

Группа Смертность Количество животных Смертность (введение в течение 28 дней) Смертность (введение в течение 56 дней) Физиологический раствор 10 0/10 1/10 DTIC 10 0/10 4/10 Низкая доза rLZ-8 10 0/10 0/10 Средняя доза rLZ-8 10 0/10 0/10 Высокая доза rLZ-8 10 0/10 0/10

Пример 2: Ингибирование роста метастазов меланомы в легкие посредством rLZ-8 и влияние rLZ-8 на степень продления жизни мышей с меланомой с метастазами меланомы в легких

Методы

(1) Материалы и реагенты

Самцов мышей Kunming в возрасте 6-8 недель, весом 18-22 г, покупали у Laboratory Animal Center of Norman Bethune University of Medical Science и выдерживали в условиях SPF в Northeast Normal University, при температуре (20±2)°C и влажности 48%, с 12-часовым световым циклом. Мышам трансплантировали клеточную линию меланомы B16-F10. DMEM, фетальная бычья сыворотка, PBS, трипсин-EDTA, DMSO, Tris-HCl буфер с pH 7,6 для промывки, 0,05% трипсин, rLZ-8, и DTIC.

(2) Инструменты, оборудование и прибор те же, как в примере 1

(3) Группы и метод введения

Клетки меланомы мышей B16-F10 культивировали в DMEM, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, при 37°C в CO₂ термостатном инкубаторе. 200 мкл суспензии клеток меланомы B16-F10 (содержащей 1×10⁷ клеток) медленно внутривенно вводили в хвостовую вену мыши посредством 1 мл шприца, так чтобы получить модель мыши с трансплантированной опухолью. Через 24 часа мышам вводили в хвостовую вену rLZ-8 (123 мкг/кг, 246 мкг/кг и 492 мкг/кг), DTIC (2,5 мг/кг) и физиологический раствор соответственно. rLZ-8 вводили один раз в сутки; DTIC длительно вводили в хвостовую вену в течение 5 дней и вводили второй раз через 3 недели. После смерти мышей легкие мертвых мышей иссекали и подсчитывали количество черных пятен на поверхности легких, образованных агрегацией клеток метастазов, так чтобы рассчитать степень ингибирования роста метастазов в легких лекарственным средством, как: степень ингибирования = (среднее количество метастазов в группе отрицательного сравнения - среднее количество метастазов в группе, которой вводили лекарственное средство)/среднее количество метастазов в группе отрицательного сравнения×100%. Время и количество мертвых мышей в каждой экспериментальной группе записывали подробно, особенно во время непрерывного введения лекарственного средства, до того, как группа отрицательного сравнения полностью умирала; и затем анализировали выживаемость мышей в экспериментальных группах и группах сравнения. Выживаемость рассчитывали в соответствии с количеством мертвых мышей в других группах, когда все мыши группы отрицательного сравнения умирали, на основании формулы, что выживаемость = (общее количество мышей - количество умерших мышей)/общее количество мышей.

Результаты

(1) Ингибирование метастазов меланомы в легкие

На основании анализа статистики метастазов меланомы в легких, каждая группа rLZ-8 имела меньшее количество метастазов опухоли, чем группа отрицательного сравнения и группа положительного сравнения; группа положительного сравнения имела четко меньше метастазов, чем группа отрицательного сравнения. В соответствии с формулой степени ингибирования, рассчитывали ингибирование метастазирования опухоли лекарственным средством в каждой группе. Как показано на Фиг.4, для 28 дней введения лекарственного средства группа с низкой дозой rLZ-8 имела степень ингибирования 62,13±1,88% по сравнению с группой сравнения; группа со средней дозой rLZ-8 имела степень ингибирования 67,65±2,1% по сравнению с группой сравнения; и группа с высокой дозой rLZ-8 имела степень ингибирования 71,17±2,43% по сравнению с группой сравнения. Следовательно, rLZ-8 достоверно ингибировал образование и рост в легких метастазов B16-F10, которую вводили внутривенно в хвостовую вену мышей. Группа положительного сравнения имела степень ингибирования 32,04±1,27%, ниже чем в трех группах экспериментального лекарственного средства, что показало, что rLZ-8 оказывал лучший ингибирующий эффект на метастазы в легких B16-F10, которую вводили внутривенно в хвостовую вену мышей, чем положительное сравниваемое лекарственное средство DTIC, как показано в таблице 4.

Таблица 4

Степень ингибирования относительно роста метастатических опухолей меланомы в легких

Группа Степень ингибирования Количество животных Введение в течение 28 дней. Степень ингибирования метастазов опухоли (%) Введение в течение 56 дней. Степень ингибирования метастазов опухоли (%) Физиологический раствор 10 - - DTIC 10 32,04±1,27 58,43±3,21 Низкая доза rLZ-8 10 62,13±1,88^** 66,18±1,79^* Средняя доза rLZ-8 10 67,65±2,1^** 84,31±3,12^** Высокая доза rLZ-8 10 71,17±2,43^** 89,78±2,77^**

Обратите внимание: по сравнению с группой DTIC, ^**P<0,01, ^*P<0,05 тест повторяли три раза, с однородной общей тенденцией результатов, где вышеуказанная таблица демонстрирует результаты одного теста.

(2) Влияние rLZ-8 на увеличение продолжительности жизни мышей с метастатическими опухолями легких

Как показано в таблице 4, посредством подробной записи времени и количества мертвых мышей в каждой группе анализировали выживаемость мышей в экспериментальных группах и группах сравнения. Когда все мыши в группе отрицательного сравнения умерли (соответственно на 87^й день и на 95^й день после введения опухолей, в двух повторных тестах), выживаемость мышей, оставшихся в группе положительного сравнения лекарственного средства DTIC, составила 10%, то есть 10% от исходного общего количества мышей были все еще живы; выживаемость в трех экспериментальных группах с различными концентрациями экспериментального лекарственного средства составила соответственно 25%, 30% и 10%. Из результатов заключили, что лекарственное средство положительного сравнения и экспериментальное лекарственное средство оказались в некоторой степени эффективными в увеличении времени выживаемости мышей. В общем, экспериментальное лекарственное средство продлевало выживаемость мышей и улучшало степень увеличения продолжительности жизни лучше, чем лекарственное средство положительного сравнения DTIC.

Пример 3: Образование антител и нейтрализующих антител после длительного многократного введения rLZ-8 Macaca fascicularis in vivo

Методы

Для грибкового рекомбинантного генноинженерного лекарственного средства важно отслеживать образование антител к rLZ-8 для доклинического исследования. Образцы сыворотки крови нормальных макак, Macaca fascicularis после длительного введения выбирали для исследования антитела rLZ-8 посредством ELISA и для исследования нейтрализующей активности анти-rLZ-8 антитела посредством метода биологической активности.

Результаты

На 9^й-11^й дни введения лекарственного средства у трех обезьян был выявлен низкий титр (1:5) анти-rLZ-8 антител; после 28^го дня введения титр антител сохранялся низким с диапазоном 1:25-1:125. Не обнаруживали анти-rLZ-8 антител у обезьян группы сравнения. На основании исследования влияния культуральной среды, с сывороткой крови обезьян, положительной по анти-rLZ-8 антителам (1:125) (разведенной в 10 раз) и без сыворотки крови обезьян, на IFN-γ секретирующую экспрессию, стимулированную различными концентрациями rLZ-8, в кривой пролиферации клеток культуральной среды с сывороткой крови обезьян, значение максимальной экспрессии (Emax) значения A снижалось до 0,78±0,09; полумаксимальная ингибирующая концентрация ИК₅₀ повышалась; и наклон кривой снижался до 0,77±0,20. Следовательно, ингибирующий эффект на сыворотку крови обезьян не был свойством конкурентного нейтрализующего антитела.

Заключение: rLZ-8 не вызывает образование нейтрализующих антител у обезьян и не нейтрализуется антителами в течение всего процесса лечения меланомы.

Пример 4: Исследование токсичности rLZ-8 у крыс

Методы

(1) Материалы и реагенты

98 крыс SD (49 самцов и 49 самок), массой 100-120 г, покупали у Laboratory Animal Center of Norman Bethune University of Medical Science и выдерживали в условиях SPF в Northeast Normal University, при температуре (20±2)^oC и влажности 48%, с 12-часовым световым циклом.

(2) Инструменты, оборудование и приборы те же, что в примере 1

(3) Группы и метод введения

Вводимые дозы для крыс рассчитывали на основании вводимой дозы для мышей; крыс делили на группу сравнения (физиологический раствор), группу с низкой дозировкой (15 мкл/кг массы тела), группу со средней дозировкой (30 мкл/кг массы тела) и группу с высокой дозировкой (60 мкл/кг массы тела). Методом введения была интраперитонеальная инъекция.

(4) Исследуемые показатели

Количество корма, масса; серология: функция печени и функция почек; иммунитет: индекс тимуса и индекс селезенки; комплемент сыворотки IgM, IgG, C3 и C4; патологоанатомическое исследование: сердце, печень, селезенка, легкие, почки, поджелудочная железа, тимус, гонады и др.

Результаты

Таблица 5

Статистические данные набора массы тела

Группа Самцы Самки Сравнение 202,50±13,43 124,17±15,16 Низкая дозировка 215,25±17,82 140,00±23,48^* Средняя дозировка 218,67±10,89^* 124,08±14,17 Высокая дозировка 221,92±21,84^** 133,37±15,29

По сравнению с группой сравнения, ^**P<0,01 ^* P<0,05.

Как показано в таблице 5, в группе со средней дозировкой белка rLZ-8 и группе с высокой дозировкой белка rLZ-8 масса самцов крыс достоверно увеличивалась; в группе с низкой дозировкой белка rLZ-8 масса самок крыс достоверно увеличивалась. Белок rLZ-8 не оказывал нежелательного явления на общие ростовые показатели крыс SD, такие как питание. Более того, в группе со средней дозировкой белка rLZ-8 и группе с высокой дозировкой белка rLZ-8 масса самцов крыс достоверно увеличивалась; в группе с низкой дозировкой белка rLZ-8 масса самок крыс достоверно увеличивалась.

Таблица 6

Функция печени и функция почек крыс

Показатель Группа Сравнение Низкая дозировка Средняя дозировка Высокая дозировка Alb 36,48±2,10 37,54±1,62 36,57±2,20 34,77±1,44^* ЩФ 252,83±85,53 243,50±103,54 242,83±80,94 218,50±69,98 АЛТ 34,08±5,99 35,50±4,93 34,42±4,50 30,75±2,42^* АСТ 171,42±31,08 175,00±34,96 169,08±30,83 128,58±18,74^** BUN 8,05±0,96 7,54±0,47 7,36±0,97 7,24±0,89^* ХЭ 474,58±320,63 474,17±305,10 487,17±303,02 456,17±309,59 CRE 27,33±2,50 24,97±1,89^* 24,26±3,55^** 24,22±2,55^** TBA 26,70±11,29 30,13±16,29 38,25±18,15 37,30±17,63 ТР 65,73±4,64 67,58±3,34 66,58±4,77 63,23±2,88 МК 125,17±39,94 174,42±46,65^* 186,83±45,67^** 164,50±28,94^**

Обратите внимание: сравнение с группой сравнения, ^**P<0,01 ^*P<0,05. Alb: альбумин; ЩФ: щелочная фосфатаза; АЛТ: аланин аминотрансфераза; АСТ: аспартатаминотрансфераза; BUN: мочевина; ХЭ: холинэстераза; CRE: креатинин; TBA: общие желчные кислоты; TP: общий белок; UA: мочевая кислота.

Как показано в таблице 6, белок rLZ-8 не оказывал очевидного нежелательного воздействия на функцию печени и функцию почек у крыс. В группе с низкой дозой rLZ-8 достоверно увеличивалось содержание Alb; в группе с высокой дозировкой rLZ-8 наблюдали более низкое содержание АсТ, чем в группе со средней дозировкой rLZ-8; в группах белка rLZ-8 наблюдали более низкое содержание BUN, чем в группе сравнения, где в группе со средней дозировкой rLZ-8 и группе с высокой дозировкой rLZ-8 наблюдали достоверно низкое содержание BUN. Уровень CHE в группе с низкой дозировкой rLZ-8 и в группе со средней дозировкой rLZ-8 достоверно увеличивался; уровень CRE во всех группах белка rLZ-8 достоверно увеличивался. В группе со средней дозировкой rLZ-8 уровень TBA и уровень UA достоверно увеличивался; в группе с низкой дозировкой rLZ-8 уровень TP достоверно увеличивался. Для самок крыс содержание ALB и содержание АсТ в группе с высокой дозировкой rLZ-8 достоверно снижалось; содержание TP в группе с высокой дозировкой rLZ-8 снижалось; и содержание UA в каждой из групп rLZ-8 достоверно увеличивалось.

Таблица 7

Индекс селезенки и индекс почки крыс

Показатель Группа Сравнение Низкая дозировка Средняя дозировка Высокая дозировка Индекс селезенки (масса селезенки/масса ×100) 0,21±0,03 0,19±0,03 0,18±0,02 0,19±0,02 Индекс тимуса (масса тимуса/масса×100) 0,12±0,03 0,15±0,03 0,12±0,02 0,17±0,03 IgG (г/л) 0,116±0,088 0,146±0,021 0,121±0,021 0,124±0,081 IgM (г/л) 0,204±0,051 0,220±0,080 0,228±0,084 0,236±0,076 С3 (г/л) 0,435±0,100 0,449±0,097 0,457±0,088 0,428±0,082 С4 (г/л) 0,394±0,020 0,397±0,021 0,412±0,017 0,352±0,016

В отношении таблицы 7 результаты иммунологического исследования показали, что индекс селезенки (за исключением группы с низкой дозировкой) и индекс тимуса каждой из групп rLZ-8 увеличивался по сравнению с группой сравнения, но не достоверно. В отношении IgG и IgM, во всех группах введения они немного недостоверно повышались по сравнению с группой сравнения. В отношении C3 и C4 не наблюдали достоверных различий между всеми группами дозировки и группой сравнения и, следовательно, rLZ-8 не влиял на C3 и C4 крыс.

Патологическое исследование: при сравнении исследуемых органов с органами группы сравнения не наблюдали очевидных морфологических изменений.

Результаты

Белок rLZ-8 ускорял рост крыс; белок rLZ-8 не оказывал нежелательного влияния на функцию печени и функцию почек у крыс. UA является полезной и вредной для организма, при этом первое относится к антиоксидантным свойствам и последнее относится в стимуляции пролиферации гладкомышечных клеток кровеносных сосудов и повреждению функций эндотелиальных клеток. В примере 4 достоверное повышение UA может играть важную роль в антиоксидантной способности; белок rLZ-8 достоверно усиливает иммунитет крыс, особенно гуморальный иммунитет; и белок rLZ-8 не оказывает достоверного нежелательного воздействия на основные органы крыс.

Пример 5: Противоопухолевая комбинация rLZ-8 и получение

1. Вышеуказанные фармакологические тесты показывают, что противоопухолевый эффект rLZ-8 является существенным в поддержании уровня лейкоцитов без токсичности. Следовательно, rLZ-8 является подходящим и безопасным в качестве лекарственного средства.

2. В качестве противоопухолевого лекарственного средства rLZ-8 можно вводить перорально и парентерально. Вводимая дозировка зависит от симптома, возраста, массы тела и др. Для взрослых пероральное введение осуществляют в количестве 10-1000 мг на дозировку/на человека, несколько раз в сутки; парентеральное введение осуществляют в количестве 10-100 мг несколько раз в сутки.

3. Лекарственное средство для перорального введения по настоящему изобретению может быть таблетками, пилюлями и капсулами (твердые капсулы и мягкие капсулы). Лекарственное средство для перорального введения включает rLZ-8 и по меньшей мере один инертный разбавитель, такой как лактоза, маннит, глюкоза, крахмал и поливинилпирролидон; и дополнительно включает фармацевтически приемлемые добавки, за исключением инертного разбавителя, такие как смазывающее вещество, дезинтегрирующее вещество и стабилизатор. Если необходимо, таблетки или пилюли могут быть покрыты оболочкой с помощью по меньшей мере одного слоя пленки, состоящей из желудочно-растворимого материала или кишечно-растворимого материала. Инъекционный препарат для парентерального введения по настоящему изобретению включает rLZ-8 и по меньшей мере один инертный жидкий разбавитель, такой как дистиллированная вода для инъекций и физиологический раствор. rLZ-8 может быть преобразован в лиофилизированный порошок и растворен в инертном разбавителе для инъекции.

(1) Препарат 1

1000 мг rLZ-8 растворяли в 100 мл стерильного физиологического раствора, гомогенно перемешивали, разделяли на каждое введение с концентрацией rLZ-8 10 мг/мл/на инъекцию для хранения в каждом пузырьке, герметизировали и стерилизовали в продукты. Другие пункты соответствуют требованиям для инъекций в Pharmacopoeia of the People’s Republic of China, 2010 edition.

(2) Препарат 2

100 г rLZ-8 и 0,5 кг фармацевтического крахмала получали в капсулах с помощью известных методик и устройств для получения капсул, rLZ-8 10 мг/на капсулу. Другие пункты соответствовали требованиям для капсул в Pharmacopoeia of the People’s Republic of China, 2010 edition.

(3) Препарат 3

100 г rLZ-8, 560 г микрокристаллической целлюлозы, 380 г безводной лактозы и 200 г стеарата магния получали в таблетках в соответствии с известными методиками и устройствами получения таблеток, rLZ-8 10 мг/на таблетку. Другие показатели соответствовали требованиям для капсул в Pharmacopoeia of the People’s Republic of China, 2010 edition.

(4) Получение 4

Определенное количество rLZ-8 в соответствии с требованиями для пероральной жидкости, в соответствии с Pharmacopoeia of the People’s Republic of China, 2010 edition, получали в пероральной жидкости посредством известных методик и устройств для получения пероральной жидкости.

Специалист в области техники понимает, что варианты осуществления настоящего изобретения, как показано в чертежах и описано выше, являются только примерными и не предназначены для ограничения.

Следовательно, очевидно, что цели настоящего изобретения были полностью и эффективно осуществлены. Его варианты осуществления показаны и описаны для иллюстрации функциональных и структурных принципов настоящего изобретения и могут быть изменены без отклонения от указанных принципов. Следовательно, настоящее изобретение включает все модификации, охватываемые сущностью и объемом следующей формулы изобретения.

Группа изобретений описывает применение рекомбинантного иммунорегуляторного белка ганодерма (rLZ-8) для получения лекарственного средства для лечения меланомы. На экспериментальных моделях ортотопических опухолей и метастатических опухолей на животных исследован противоопухолевый эффект rLZ-8, который показал, что rLZ-8 достоверно ингибирует рост ортотопических опухолей меланомы и образование метастазов меланомы. Также раскрыт способ лечения меланомы у субъекта. Группа изобретений обеспечивает расширение арсенала терапевтических средств. 2 н. и 7 з.п. ф-лы, 4 ил., 7 табл., 5 пр.

1. Применение рекомбинантного иммунорегуляторного белка ганодерма (rLZ-8) для получения лекарственного средства для лечения меланомы у пациента.

2. Применение, как указано в п. 1, где лекарственное средство ингибирует пролиферацию меланомы.

3. Применение, как указано в п. 1, где лекарственное средство ингибирует образование метастазов меланомы.

4. Применение, как указано в п. 1, где лекарственное средство имеет основные компоненты терапевтически эффективного количества rLZ-8 и произвольные фармацевтически приемлемые добавки.

5. Применение, как указано в п. 1 или 2, где лекарственное средство вводят перорально или парентерально, где лекарственное средство для перорального введения является пероральной жидкостью, таблеткой, пилюлей или капсулой; и лекарственное средство для парентерального введения представляет собой наружное лекарственное средство или инъекцию.

6. Способ лечения меланомы у субъекта, включающий введение субъекту лекарственного средства, включающего рекомбинантный иммунорегуляторный белок ганодерма (rLZ-8), при сохранении числа лейкоцитов у субъекта.

7. Способ по п.6, в котором лекарственное средство вводится перорально или парентерально.

8. Способ по п.7, в котором лекарственным средством для перорального введения является пероральная жидкость, таблетка, пилюля или капсула.

9. Способ по п.7, в котором лекарственное средство для парентерального введения представляет собой наружное лекарственное средство или инъекцию.