Способ разделения дезоксинуклеозидов Советский патент 1983 года по МПК C07H21/04 A61K31/7052 A61K31/711 

(54) СПОСОБ РАЗДЕЛЕНИЯ ДЕЗОКСИНУКЛЕОЗИДОВ

1

Изобретение относится к усовершенствованному способу разделения дезоксин;уклеозидов, которые находят применение в медицине для синтеза лекарственных препаратов.

Известен способ разделения дезоксннуклеозидов из гидропизатов дезоксирибонукаеиновых кислот (ДНК) путем хроматографирования на ионообменном сорбенте Дауэкс 248, включающий элюирование ц 0,4 М буферным раствором формиата аммония при рН 8,6-9. Выход каждого дезоксинуклеозида 0,0001-0,0005% от веса сухого исходного сырья tlj

Недостатком известного способа разделения дезоксинуклеозидов является низкий выход целевого продукта.

Целью изобретения является повышение выхода целевых продуктов.20

Поставленная цель достигается описы- ваемым способом разделения дезоксинуклеозидов из гидролизатоЕ дезоксирибонуклеиновых кислот, заклкэчаюшнмся в тсж.

что гидролизат дезоксирибонуклеиновых кислот хроматографиру ют на сополимере оксиэтилметакрилата и этилендиметакрилата с размером частиц 1О-4О мкм, а элюирование осуществляют О,02-ОД М буферным раствором формиата аммс«ия при рН 2,5-4,9 и линейной скорости 1,6-3,2 см/мин.

Выход каждого дезоксинукпеозида О,3-3,7% от веса сухого исходного сырья.

Увеличение выхода достигается в результате изменения механизма сорбционного взаимодействия дезоксинуклеозидов и сорбента при использовании катионообменной хроматографии с гликопьметакрилатной матрицей при рН 2,5-4,8. В этих условиях из-за повьпиенной гмдрофильности гликопьметакрилатной матрицы происходит уменьшение роли гидрофобного взаимодействия в процессе разделения, из-за наличия катионообменных функцио- HaJUaHbix групп сорбента и протонирования

при рН 2,5-4,8 амфотерных деаоксинук- леозидов происходит увеличение роли электрбстатического взаимодействия в процессе разделения.

Пример 1, Хроматографическую копонцу размером 1,650 см наполняют катионообменнь1М сорбентом сферой S 1ОО (диаметр зерен сорбента 10-25 мкм). Через колонку пропускают поток, элюэнта с линейной скоростью 1,6 см/мин (обт емкая скорость О{ОО31 л/мин). Состав члюэнта:О,1 и. буферный раствор формиата аммония с рН 4,8. Не прекращая потока элюэнта, в колонку вводят водный раствор (рН 4,8) гидролизата ДНК, содержащий 1,8 мг тимидина 3,1 мг дезоксигуанс)зина, 2,2 мг дезоксиаденозина и 2,0 мг дезоксицитидина (суммарное содержание дезоксинуклеозидов 9,1 мг). Давление в колонке во время хроматографирования 40-50 атм. Выход фракции из колонки регистрируется ультрафиолетовым детектором при 254 им. Одновременно осуществляется отбор фракций в коллектор фракций. Общее время хроматографирование 160 мин.

Результаты хроматографирования приведены в табл. 1.

Таблица 1

Пример 2. Хроматографическую колонку размером 0,827 см наполняют . катионообменным сорбентом сферон S 1ООО (диаметр зерен сорбента 254С) мкм). Через колонку пропускают поток элюэнта с линейной скоростью2,7 см/мин (объемная скорость О,ОО14 л/мин). Состав элюэнта : 0,025 н. буферный раст- пор формиата аммония с рН 2,5. Не прекращая потока элюэнта, в Колонку вво

дят водный раствор (рН 2,5) гидролизата ДНК, содержащий 2,3 мг тимидина, 0,9 мг дезоксигуанозина 1,9 мг дезоксиаденозина, 3,7 мг дезоксииитидина (суммарное содержание дезоксинуклеозидов 8,8 мг).

В течение 20 мин после ввода гидролизата да К продолжают элюирование 0,О25 н. буферным раствором формиата аммония с рН 2,5. Затем в течение 40 мин линейно повышают концентрацию ионов аммония в элюэнте до 0,1 н. и рН до 4,8 и продолжают элюирование при этих значениях концентрации и рН до конца хроматографирования. Скорость элюирования сохраняется постоянной в течение всего процесса хроматографирования, при этом давление в колонке 6-9 атм. Выход фракций из колонки регистрируется ультрафиолетовым детектором при 254 нм. Одновременно осуществляется отбор фракг ций в коллектор фракций. Общее время хроматографирования 18О мин.

Результаты хроматографироваиия приведены в табл. 2. I.Таблица2

28

О,021 81

43

Тимидин

катионообменным сорбентом сферон S 1000 (диаметр зерен 25-40 мкм). Через колонку .пропускают поток элюэнта с линейной скоростью 3,2 см/мин (объ емная скорость О,О065 л/мин). Состав элюэнта: 0,1 н, буферный раствор формиата аммония с рН 4,8. Не прекращая потока элюента, в колонку вводят водный раствор (рН 4,8 ) гидролизата ДНК, содержащий 130 мг тимидина, 37 мг дезоксигуанозина, 204 иг деаоксиадено - зина и 138 мг дезоксицитидинй (суммарное содержание дезоксинулеозидов 5О9мг Давление в колонке во время хроматогра- фирования 8-т10 атм. Выход фракций из колонки регистрируется -ультрафиолетовым детектором при 254 нм. Осуществляется отбор только фракций дезоксиаденозина и дезоксиоитидина. Общее время хроматографирования 1ОО мин. . Результаты хроматографирования приведены в табл. 3 Т и б л и ц а 3 Дезокси40 55 О,О94 130О аденозин Дезокси67 8О 0,085 11ОО цитидин Формула изобретения Способ разделения дезоксинукпеоэвдов из гидролизатов дезоксирибонуклевновых кислот путем хроматографирования на ионообменном сорбенте, включающий зяюирование буферным раствором формиата аммония, отличающийся тем, что, с цепью повышения выхода целевых продуктов, в качестве ионообменного сор-г бента используют сополимер оксиэтилме- такрилата и этилeндимeтaкpШIaтafc раз- Мером частиц 1О-4О мкм, а .элюированив проводат при концентрации буферного раствора 0,О2-О,1 М, рН 2:5-4,9 и линейной скорости 1,6-3,2 см/мин. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Авторское свидетельство CCXIP № 540874, кл. С О7 Н 19/ОО, 03.03.75 (прототип).