Способ получения щелочной фосфатазы Советский патент 1992 года по МПК C12N9/16 

фермента и отпадает необходимость концентрирования образца, наносимого на колонку, на последующей стадии хроматографии;

применение в качестве хроматографи- ческой стадии ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-сфероне, на которой кроме очистки фермента происходит и его концентрирование с лимитирующим фактором для хорошего разделения, также исключает - необходимость в стадии концентрирования ультрафмльтрзцией. Кроме того, это позволяет существенно сократить по сравнению с процессами на Сефадексах G-75 и G-200: продолжительность хроматографического цикла за счет увеличения скорости элюиро- вания, что делает возможным проведение процесса при комнатной температуре без инактивации фермента.

Предлагаемый способ заключается в следующем: 0,5 кг свежезамороженного тонкого кишечника тюленя размельчают, загружают в гомогенизатор и добавляют 0,5 л буферного раствора 0,05 М трис-НС1, рН 7,4, содержащего 2,5 мМ MgS04 (ТМ буфер), проводят гомогенизацию до получения гомогенной массы. Объем полученного гомогеиизата - около 2л.

К гомогенизату добавляют 2 л н-бутано- ла и проводят экстракцию при 35-40°С в течение 1,5 ч.

После экстракции м разделения фаз бу- тансльную фазу отбрасывают, а водную фазу (1,0-1,3 л) диализируют протие 10 л ТМ буфера в течение 24 ч при 4-5°С. Буфер заменяют свежим через 12ч.

Получают 1,5-2,0 л диализата,

К полученному диализату при медленном перемешивании добавляют предварительно охлажденного до 4 С этанола до конечной концентрации 55-65 об.% выдерживают в течение 30 мин при 4°С и оса,док отделяют центрифугированием, -Полученный осадок растворяют в 250 мл буфера 0,05 М трис НС1, 0,01 М МдСКрН8{буфераА), и . фильтруют для удаления нерастворившихся частиц. Фильтрат наносят на колонку 5х 30 см, наполненную ДЭАЭ-сфероном и предвари- тельно уравновешенную буфером А, Нанесение образца и элюирозаниеосуществляют градиентным программируемым микронасосом РРМ (ЧССР) со скоростью потока 1,2 л/ч, Элюирование проводят в градиентном режиме с увеличивающейся в буфере А концентрацией NaCl от О до 1 М. В процессе хроматографирования отбирают фракции по 20 мл. В полученных фракциях определяют активность щелочной фосфатазы и содержание белка, рассчитывают удельную активность фермента и выход по активности.

После хроматографической очистки на ДЭАЭ-сфероне активность щелочной фосфатазы составляет 120-130 ед/мг белка и выход до активности 80-84%.

За единицу активности принимают количество фермента, катализирующего отщепление 1 мкМ неорганического фосфата при рН 9,3,37°С в присутствии 10 м М MgCl2, Верхняя граница температуры зкстракций нтбутанолом 40°С обусловлена тем, что при более высоких темпераурах происходит термоинактивация щелочной фосфатазы.

Нижняя граница температуры зктрак- ции н-бутанолом 35°С обусловлена снижением при более низких температурах выхода по активности из-за неполной экстракции фермента из ткани за данный промежуток времени.

Верхняя граница конечной концентрации этанола npi i осаждении 60 об.о обусловлена тем, что при более высокой концентрации этанола вся фосфатаза уже осаждена и происходит осаждение балластных белков, что приводит к уменьшению

степени очистки на данной стадии и в конечном итоге к умень.шению активности целевого продукта.

Нижняя граница конечной концентрации .этанола прм осаждении 65 об.% обусловлен.а тем, что при более низкой концентрации этанола большая часть щелочной фосфатазы остается в растворе, что приводит к уменьшению выходгЗ процесса по активности.

П ри мер 1.0,5кгсвежезамороженного, тонкого кишечника тюленя размельчают, загружают в гомогенизатор и добавляют 0,5 л ТМ буфера и проводят гомогенизацию до получения гомогенной массы. Получают

1,9 л гомогенизата.

К гомогенизату добавляют 1,9 л н-бута- нола и проводят экстракцию при 35°С в течение 1,5 ч. .

После экстракции и разделения фаз бутанольную фазу отбрасывают, а водную-фазу (1,1 л) диализируют против 10 л ТМ буфера в течение 24 ч при . Буферный раствор заменяют свежим через 12 ч. Получают 1,6 п диализата.

к полученному диализату при медленном перемешивании добавляют предварительно охлажденного до 4°С этанола до конечной его концентрации 55 об.%, выдерживают в течение 30 мин при 4°С и осадок

отделяют центрифугированием. Полученный осадок растворяют в 250 мл буфера А и фильтруют для удаления нерастворившихся частиц.

Фильтрат наносят на колонку размеров 5 X 30 см, наполненную ДЭАЭ-сфероном и

предварительно уравновешенную буфером А, Нанесение раствора щелочной фосфата- зы и элюирование осуществляют градиентным программируемым микронасосом РРМ {ЧССР)со скоростью протока 1,2 л/ч. Элюи- рование проводят в градиентном режиме с увеличивающейся в элюирующем буфере А концентрацией NaCI от 9 до 1 М. В процессе хроматографирования отбирают фракции по 20 мл. В полученных фракциях определя- ют активность щелочной фосфатазы и содержание белка, рассчитывают удельную активность фермента и выход по активности.

После хроматографической очистки на ДЭАЭ-сФероне активности щелочной фосфатазы составляет 125 ед/мг белка, выход по активности 80,5%.

П р и м е р 2. 0,5 кг свежезамороженного -ТОНКОГО кишечника тюленя размельчают, загружают в гомогенизатор, добавляют 0,5 л ТМ буфера и проводят гомогенизацию до получения гомогенной массы. Получают 2 л гомогенизата.

К гомогенизату добавляют 2 л н-бутано- ла и проводят экстракцию при 37°С в течение 1,5 ч. После экстракции и разделения фаз бутанольиую фазу отбрасывают, а водную фазу (1,2 л) диализируют против Ю л ТМ буфера в течение 24 ч при . Буферный

Редактор Л.ПисьмЭн

Составитель Техред М.Моргентал

Заказ 544ТиражПодписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035. Москва, Ж-35, Раушская наб,, 4/5

Производственно-издательский комбинат Патент, г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

раствор заменяют свежим мере. 12 ч. По лучают 1,6 л диализата.

К полученному диализату при медленном перемешивании добавляют предварительно oxлaждeн oгo до 4°С этанола до конечной его концентрации 60 об.%. выдерживают в течение 30 мин при 4 С и осадок отделяют центрифугированием. Полученный осадок растворяют в 250 мл буфера А и фильтруют для удаления нерастворившихся частиц.

Фильтрат наносят на колонку размером 5 X 30 см, наполненную ДЭАЭ-сферонбм и предварительно уравновеше1 ную буфером А, Нанесение раствора щелочной фосфатазы и злюирование осуществляют градиентным программируемым микронасосом РРМ (ЧССР) со скоростью протока 1.2 л/ч. Элюм- рование проводят в градиентном режиме с увеличивающейся в элюирующем буфере А концентрацией NaCI отО до 1 М. В процессе хроматографирования отбирают фракции по 20 мл. В полученных фракциях определяют активность щелочной фосфатазы и содержание белка, рассчитывают удельную активность фермента и выход по активности.

После хроматографической очистки на ДЭАЭ-сфероне активность щелочной фос- фзтазы составляет 130 ед/мг белка выход по активности 84%.

Корректор Е.Папп