Способ определения урата в плазме и сыворотке крови Советский патент 1983 года по МПК G01N33/48 C12Q1/26 

Изобретение относится к клинической биохимии, а именно к разделу клинического медицинского анализа. Урат принадлежит к числу обязательных компонентов крови, в норме содержание урата в плазме крови соетавляет 0,02-0,04 г/л. Уровень содержания урата в крови имеет важное диагностическое -значение, повышенное содержание его характерно, например для заболеваний подагрой, резкие кол бания содержания урата в крови наблю даются при почечнЬ-каменной болезни Известен способ определения урата в плазме и сыворотке крови, состоящи в том, что анализируемую пробу разбавляют раствором типа физиологического, подвергают диализу, смешивают диализат с раствором фермента урикаг зы, растворенного в водной буферной смеси с рН 8,5-10, инкубируют полученный раствор при в течение 4 мин, смешивают инкубированный раствор с водным раствором замещенного бензидина или дифенилина, с водным раствором фермента пероксидазы и с водным буферным раствором с рН 5,5-8,5, полученный окрашенный

уриказаУрат + О,

аллантоин + С02 + Н-О. HjOj + этанол Ацетальдегид + где НАД - никотинамидадениндинуклеотид в окисленной формеj НАНД - никотинамидадениндинуклБотид в восстановленной форме. Содержание урата находят, измеряя содержание ионов водорода, образующихся в последней реакции С23. Иммобилизованные уриказа и альдегидцегидрогеназа позволяют проводить многократные определения урата с. одной и тойже порцией фермента, бла годаря чему уменьшается расход ферментов и снижается стоимость анализ Простота регистрации отклика дает возможность автоматизировать определение. Недостатки способа заключаются в том, что мешая реакционная поверхность нейлонового реактора-трубки замедляет основные реакции, из-за чего возникает много побочных реакций, приводящих к ошибкам в результате анализа. Большой ассортимент бводимых в анализируемый раствор реагентов свя зан с возможностью протекания разного рода побочных реакций, искажаю щих результат анализа и снижающих селективность определения. Регшизация способа усложняется также необходимостью введения в анализируемый раствор фермента каталазы, которая приводит к необратимым потерям этог каталаза аде тал ьде гид Нг Н2О НАД альдегиддегидрогеназа раствор пропускают через кювету для фотометрического анализа, фотометрируют при 420-460 нм l. К недостаткам данного способа относятся длительность анализа, так как диализ растворов - процедура крайне длительная, малая точность определения, так как фотометрированию мешают все содержащиеся в крови окрашенные соединения, большой расход ферментов, из-за чего стоимость анализов высока,-что не позволяет использовать способ для массовых анализов. Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности является способ определения урата в плазме и сыворотке крови, заключакяцийся в пропускании исследуемой пробы при рН 8-8,1 через нейлоновый трубчатый реактор, на стенках «которого иммобилизованы уриказа и альдегиддегидрогеназа. Кроме того, в реакционную среду непосредственно вводится фермент каталаза . Способ основан на последовательно протекающих ферментативных реакциях ацетат + НАДИ + н фермента, и тем, что никотинамидадениндинуклеотид принадлежит к числу очень дорогих и скоропортящихся реактивов, его использование резко удорожает анализ. Кроме того, иммобилизованные на поверхности нейлонового реактора ферменты сравнительно легко вымываются ансшизируемым раствором, ферменты теряются и активность реактора уменьшается, срок службы такого ферментного реактора не превышает 20 дней. Цель изобретения - повышение селективности определения и упрощение процесса. Указанная цель достигается тем, что согласно способу определения, урата в плазме и сыворотке крови, заключакхцемуся в контактировании исследуемой пробы с уриказой и каталазой при рН 8-8,1, пробу первоначально вводят в контакт с каталазой, а затем с уриказой, иммобилизованными на пористом стекле, содержащем покрытие из п йтоксида ниобия, с последующим определением хемилюминесцентным методом количества выделившегося пероксида водорода,по которому определяют количество урата. Указанная последовательность стадий процесса, а также применение описанных иммобилизованных форм ферментов обеспечивают возможность максимального устранения побочных рёакций, что позволяет повысить селективность определения, а также упростить процесс, поскольку его осуществ ление основано на двух (а не трех) ферментативных реакциях. Кроме того, используемые иммобилизованные фермен ты являются, стабильными и обеспечивают большую продолжительность использования. Данный способ для реали зацни не требует использования НАД Процесс основан на следующей схеме. .Фермент уриказа (уратоксидаза, урат: О- оксидоредуктаза, К.Ф.1.7.3, катализирует реакцию окисления урата кислородом с образованием аллантоинэ и пероксида водорода Урат + О2 , аллантоин+Н2О2 Количество образовавшегося пероксида водорода эквивалентно количеству прореагировавшего урата. Насыщение буферного раствора, в котором проводят ферментативную реакцию, кис лородом обеспечивает практически мгновенное протекание этой реакции Фермент катализа разлагает все перекисные соединения, которые могут при сутствовать в анализируемом веществе, с образованием кислорода, и тем самым устраняет возможность сяиибки, вызванной взаимодействием этих перекисных соединений с люминесцентным реагентом. При использовании хемилюминесцент ного метода Сз 3 пероксид водорода подвергают реакции с замещенными арилоксалатами, образуя пероксиоксалаты, которые мгновенно распадаются, причем распад сопровождается яркой хемилюминесценцией,- интенсивность которой пропорциональна KOHW центрации пероксида водорода в растворе. В присутствии флуоресцентных реагентов с сопряженными двойными связями типа антрацена или перилена яркость свечения резко возрастает, что облегчает регистрацию хемилюминесценции. Способ осуществляют следующим образом. Пробу анализируемого вещества вводят в поток насыщенного кислородо фосфатного буферного раствора с рН 8 проходящий последовательно через две колонки с ферментами, иммобилизо ванными на покрытых пентоксидом ниобия шариках из пеностекла, причем впервой колонке находится фермент каталаза, во второй - фермент уриказа, и в выходящем из второй колонки раст воре определяют содержание пероксида водорода хемилюминесцентным методом 31 по реакции с бис-(3,4,6-трихлорфенил)-оксаяатом в присутствии 9,10-дифенилантрацена, по найденном содержанию пероксида водорода рассчиты вают содержание урата в анализируемо веществе. Экспериментально установлено,что наилучшие результаты дает применение в качестве хемилюминесиентного реагента бис-(3,4,б-трихлорфенил)-оксалата, а в качестве флуоресцентного реагента 9,10-дифенилантрацена. Эта реакция дает возможность по интенсивности свечения определять .очень малые количества пероксида водорода, благодаря чему резко снижается требуемый объем анализируемоговещества (для единичного определения достаточно 50 мкл плазмы или сыворотки крови, против 10 мл по обычно используемому методу, т.е. в 200 раз меньше). Введенная в поток буферного раствора проба ангшизируемого вещества разбавляется много раз. при этих: разбавлениях окрашенные компоненты крови не оказывают никакого статистически значимого влияния на результат определения. На реакцию пероксида водорода с замещенными арилоксалатами не влияют белковые вещества, поэтому не требуется операция диализа анализируемого раствора. Измерение хемилюминесценции может проводиться в автоматическом режиме. Иммобилизацию ферментов проводят следующим образом. 100 вес.ч. шариков из пеностекла, имеющих средний диаметр 0,25-0,35 мм и средний диаметр пор 200-500 нм высуашвают в вакуумном сушильном шкафу при 150°С и остаточном давлении 0,1 Па. Затем высушенные шарики помещают в кварцевы. стакан, заливают 150 вес.ч. 1%-ного раствора пентахлорида ниобия в безводном этиловом , стакан устанавливают в вакуумэксикаторе и откачивают воздух до начала :кипения жидкости в стакане, повторяют процедуру откачивания воздуха 5 раз. Далее стакан вынимают из вакуум-эксикатора и при интенсивном перемешивании содержимого стакана , пропеллерной мешалкой вливают в стакан 150 вес.ч. воды. Перемешивают массу в течение 30 мин, дают отсто яться, декантируют жидкость и приливают новую порцию 150 вес.ч. воды. Вновь перемешивают 30 мин, отсасывают шарики на воронке Бюхнера, промывая буферным раствором с рН 10. Промывку повторяют 3 раза. Промытые шарики готовы к употреблению, их хранят в фосфатном.буферном растворе с рН 8. Для иммобилизации растворяют 1 вес.ч. фермента в 200 вес.ч, буферного раствора с рН 10,5, в.полученный раствор вносят 8 вес.ч. шариков из пеностекла, покрытых пентоксидом ниобия, и оставляют в растворе на 24 ч при интенсивном перемешивании смеси магнитной машалкой, при 3537®С . Затем шарики отсасывают на воронке Вюхнера, промывая фосфатным

буферным раствором с рН 8, промытые шарики до употребления хранят в фосфатном буферном растворе с рН 8 при 4°С.

В колонку для проведения ферментативной реакции загружают шарики с иммобилизованным ферментом с таким расчетом, чтобы высота слоя шариков была в пределах 35-45 мм. Для проведения измерений используют установ- ку 33.

Пример 1, Определение урата в образцах крови.

Анализу на содержание урата подвергают образцы плазьвд и сыворотки донорской крови стандартного консераирования, а также плазму и сыворотку крови больного почечно-каменной болезнью на разных стадиях болезни.

Для анализа собирают установку З Иммобилизуют ферменты, как описано выше, загружают шарики с иммобилизо ванными ферментами в колонки, устана ливают постоянный поток буферного раствора через систему, включают регистрирующую установку и проводят корректировку нуля измерительного прибора.

Отбирают 200 мкл анализируемого образца (плазмы или сыворотки) в

шприцевый микродозатор и далее последовательно проводят три определения, вводя.в установку по 50 мкл анализируемого образца и измеряя интенсивность хемилюминесценции. Содержание урата определяют по градуировочному графику.

Парёшлельно те же образцы анализируют на содержание урата способомпрототипом с использованием иммобилизованных на поверхности нейлоновой трубки-реактора ферментов уриказы и альдегиддегидрогеназы, также повторяя ансшиз три раза.

Полученные в эксперименте резулЬтаты обрабатывают следующим образом.

По табл. 1, в которой приведены результаты изучения влияния концентрации урата в анализируемом растворе на величину интегрального значения интенсивности хемилюминесценции, возникающей на конечном этапе определения урата, строится градуировочный график в билогарифмических координатах (см. чертеж). В диапазоне содержаний урата в пробе анализируемого раствора 2 10-8- 8-10 моль/л зависимость имеет линейный характер. Методом наименьших квадратов найдено уравнение прямой, описывахицей эту зависимость

рС 9,5852 - 1,1733 IgQ.,

где рС - отрицательный логарифм молярной концентрации урата;

Определение урата в образцах крови

Таблица 2

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УРАТА В ПЛАЗМЕ И СЫВОРОТКЕ КРОВИ, предусматривающий контактирование исследуемой пробы с урикаэой и каталазой при рВ 8-8,1, отличающийся тем, что, с целью повышения селективности определения и упрощения процесса, пробу первоначально вводят в контакт с каталазой,алэатем с уриказой, иммобилизованными на пористом стекле/ содержащем покрытие из пентоксида ниобия, с последующим определением хемилюминесцентным методом количества выделившегося пероксида водорода, по которому определяют количество урата.

Примечание. видно из табл. 2 предлагаемый способ не уступает по точности опре деления известным, является более простым и селективным. Пример 2. Сравнение удержания ферментов иа носителе и сохранения постоянства активности фермент ного реактора при длительном использовании. Собирают установку . Устанав-, ливают постоянный поток буферного раствора через реакторы, по истечении определенного промежутка времеУдерживание фермента на носителе

О 6 SpТаблица 3

24,2

0,04

24,3 24,1 24,4 0,04 среднее содержание урата, относительное стандартное отклонение. ни анализируют один и тот же образец плазмы крови с известным содержанием урата. . Параллельно собирают установку по способу-прототипу с нейлоновым фрубчатым реактором, устанавливают постоянный поток буферного раствора через реактор, равный потоку буферного раствора в способе-прототипе. Через те же cai«ie промежутки времени анализируют тот же сапыв образец плазмы крови. Результаты представлены в табл.3. Предлагаемый способ после 144 ч промлвания ферментных реакторов буферным раствором показывает одинаковые с исходным результаты;определения содержания урата в образце плаз1уы крови. Способ-прототип после 24 ч промывания реактора буферным раствором дает колеблющиеся результаты, после 48 ч промывания реактор полностью теряет активность и определение становится невозможным. Пример 3. Влияние срока хра нения ферментного реактора с иммобилизованными ферментами на результат определения урата в плазме крови. Собирают установку СзЗ Иммоби-пизуют ферменты на шариках их пеностек ла, покрытых пентоксидом ниобия, загружают шарики в реакторы, подключают к установке. Полностью готовую к работе установку подключают к термостату,устанавливают темрер Влияние срока хранения фе определения содержания

Продолжение табл. 3 туру ферментных реакторов равной 4 С и оставляют при этих условиях на время. Через заданный промежуток времени включают установку и проводят определение урата в плазме крови, как описано выше. Параллельно готовят ферментный реактор по способу-прототипу, иммобилизуя уратоксидазу и альдегиддегидрогеназу на внутренней стенке нейлоновой трубки. Готовый ферментный реак тор заливают буферным раствором и погружают в нермостат с температурой , хранят в этом термостате. Через заданный промежуток времени реактор вынимают из термостата-, устанавливают температуру реактора равной 37°с и проводят определение, как описано в способе-прототипе. Полученные результаты представлены в табл. 4. Таблица 4 тного реактора на результат а в плазме крови

Хранение ферментного реактора с ферментами, иммобилизованными на шариках из пеностекла, покрытых пентоксидом Ниобия, в течение года не сказывается на активности ферментов и не влияет на результат анализа, в то время как ферментный реактор, изготовленный в соответствии со способом-прототипом, через 4 мес хранения дает непригодные результаты, а через 6 мес полностью теряет активность.

Преимущества предлагаемого способа по сравнению с прототипом состоят в том, что вместо трёх ферменто для анализа требуется тoлькo два, ферментный реактор служит дольше (не менее 12 мес. против 4 мес, по способу-прототипу),-затраты времени на айализ в 2 раза меньше, исключается применение дорогих и скоропортящихся реактивов типа никотинамидадениндинуклеотида, отсутствуют помехи от окрашенных веществ, определение легко автоматизируется.