Способ получения корпускулярного антигена Советский патент 1983 года по МПК A61K39/02 

:о 4 Изобретение относится к области медицины, преимущественно к разделу получения реагентов и препаратов для диагностики паразитарных болезней человека, в чacтнoctи амебиаза. Известен способ получения корпускулярного антигена из поликсеническо культуры дизентерийной амебы, заклю, чающийся в выращивании амеб и очистке их от неспецифических компонентов среды l . Известен способ получения корпускулярного антигена из поликсеническо культуры дизентерийной амебы путем ее выращивания на питательной среде содержащей сопутствующую бактериальную флору, с последующей очисткой и инактивацией амеб 2 . Однако известные способы приготовления антигена не обеспечивают высокого выхода целевого продукта. Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта. Цель-достигается тем, что в способе получения корп:/скулярного антигена из поликсенической культуры дизентерийной амебы, предусматривающем выращивание их на питательной / среде, содержащейсопутствующую бак- териальную флору, с последующей очисткой и инактивацией амеб, за 7 14 ч до посева амеб в питательную среду вносят 0,01-0,04 мл надосадочной жидкости 48-72-часовых культур дизентерийной амебы, содержащей сопутствующую бактериашьную флору, и ну л. л. Л у nJUJiJf ч (.Л. л tA ii li Jf у jri после выращивания амеб проводят очистку амебной взвеси центрифугированием в 8%-ном растворе сахарозы при 1700-1800 об/мин в течение 30-35 с. Способ иллюстрируется следующими примерами.« Пример 1. Наращивание амеб в бактериальных пробирках. В стерильныее пробирки, заполненные на 2/3 средой Павловой (10-12 мл без крахмала, добавляют 0,01-0,04 мл надосадочной жидкости из 48-72-часовых культур дизентерийной амебы.Пробирки, закрытые стерильными; пробками, помещают в термостат (36,6°С), Через 7-14 ч на прекондиционированну среду производят посев амеб из 4872-часовых культур. Пробирки инкубируют в горизонтальном положении при 36,6°С. Через 24-28 ч амеб снимают со стенок пробирки и осаждают центри фугированием при 1500 об/мин в течение 5 мин. При посеве 50.-100 тыс.готе на пробирку с прекондиционированной средой через сутки наблюдается увели чение численности амеб примерно в 5 раз.. Пример 2. Наращивание амеб во флаконах для культуры тканей емкостью 100 мл., Стерильный- флакон заполняют на 2/3 средой Павловой (80 мл) без крах мала,вносят 0,07-0,3 мл надосадочной жидкости из культуры дизентерийной амебы. Флакон, закрытый резиновой пробкой, помещают в термостат (36,бОс). Через 7-14 ч вносят взвесь амеб из 2-3 пробирок с 48-96-часовой культурой, из которых предварительно удален крахмал и большая часть среды. Флакон в горизонташьном положении помещают в термостат СЗб,6°С). Через сутки (24-28 ч) рост амеб можно оценить визуально по всей горизонтальной поверхности флакона при малом увеличении микроскопа. После осторожного удаления более половины культуральной жидкости амеб снимают со стенок.флакона с помощью стеклянного шпателя или многократным пипетированием культуральной жидкост Р . или легким покачиванием. Затем взвесь амеб центрифугируют 5 мин при 1500 об/мин. При посеве 60-150 тыс. амеб наблюдается увеличение численности амеб в 8-12 раз. Пример 3. Освобождение полученной взвеси амеб от неспецифических компонентов среды. Взвесь амеб из культуры в объеме 1-1,5 МП осторожно наслаивают на 5-6 мл сахарозы. Это приводит к самопроизвольному осаждению наиболее крупных частиц и зерен крахмала на дно пробирки. Амебы остаются в верхней части содержимого пробирки. Более деликатная и тщательная очистка от .«JVjt/ Ж1 .b«A ..bb л микробного компонента среды достигается центрифугированием. Для зтого 2-3 мл верхней части содержимого пробирки наслаивают на столб саха.розы высотой 5 центрифугируют в течение 30 с при 1700-1800 об/мин. Микробные частицы, бактериальные пленки оседают на внутренней поверхности пробирки, поэтому осторожно, не касаясь стенок, содержимое с помощью пастеровской пипетки переносят в другую пробирку. Амеб концентрируют при 1500 об/мин в течение 3-5. мин.. Фиксацию амеб проводят забуференным 1С)%-ным формалинрм и отмывают полученную взвесь. Отмытый осадок суспендируют в забуференном физиологическом растворе (0,015 М и фосфатный буфер - 7,2) из расчета получения в капле взвеси от 20 до 40 амеб при малом увеличении микроскопа. Взвесь амеб переносят на размеченные предметные стекла с кружками диаметром до 8 1ИМ. После естественного высыхания (2-3 ч)f фиксированная на предметных, стеклах взвесь интактных, отмытых в сахарозе, свободно лежащих амеб служит антигеном для постановки реакции. Предлагаемый .способ позволяет повысить выход амеб (через 24 ч куль31009471,

тивирования количество амеб в I млсравнению с известн М позволяет снисреды 250000-300000, тогда как в из-зить необходимость в приготовлении

вестном способе через 48 ч культиви- ,антигена до 9-10 раз в год, так как

рования количество амеб 50000-70000).антиген можно готовить через 6-7 неКроме того, предлагаемый способ по дель, вместо 2-3 недель по известному.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОРПУСКУ; ЛЯРНОГО АНТИГЕНА из поликсеническоЙ культуры дизентерийной амебы путем их выращивания на питательной среде, содержащей сопутствующую бактериальную флору, с последующей очисткой и инактивацией амеб, отличающийся тем, что/ с целью повышения выхода целевого продукта ,за 7-14 час .до посева амеб в питательную среду вносят 0,01-0,04 мл надосадочной жидкости 48-72-часовых культур дизентерийной амебы, содержгидей сопутствующую бактериальную флору, и после вырапщвания проводят очистку амебной взвеси центрифугированием в 8%-ном растворе сахарозы при 1700- § 1800 об/мин в течение 30-35 с. (Л