Способ количественного определения группового состава липидов Советский патент 1983 года по МПК G01N31/08 

СП

:л

. Изобретение относится к способу количественного определения группового состава липидой. Известен, спооб количественного определения нейтральных липидов пос ле хроматографического разделения смесей липидов в тонком слое силика геля импрегнированного обугливгиощим агентом - сульфатом аммония в количестве 10% от веса аммония. Для обнаружения зон локализации липидов пластины с тонким слоем нагревают при в течение 10 мин при этом органические вещества обуг ливаются. Количественное измерение обнаруженных зон проводят путем ден ситометрирования С1. Однако известный способ имеет не достаточную точность количественног определения группового состава липи дов, содержащих остатки насыщенных жирных кислот, вследствие малой сте пени обугливания их в сравнении с селективным обугливанием липидов, включающих остатки ненасыщенных жир нйх кислот, Цель изобретения - повышение точ ности количественного группового со става липидов. Поставленная цель достигается согласно способу количественного определения группового состава липидов, включающему разделение смеси методом тонкослойной хроматографии на закрепленном слое силикагеля, им прегнированном обугливакнцим агентом - сульфатом гидрЬксиламина, взя тым в количестве 10-15% от веса силикагеля при нагревании пластин при 200-210 С в течение 20-30 мин и последующим денситометрированием. Способ осуществляется следующим образом. Искусственные или природные смеси липидов подвергают хроматографическому разделению: на стеклянных пластинах размером.25x75 мм с закре ленным слоем силикагеля, содержащим сульфат гидроксиламина. Для приготовления пластин суспензию из 1,050 г силикагеля, 0,105 г гипса и сульфата гидроксиламина в 7,5 мл дистиллированной воды разливают на 10 пластин по 0,75 мл, сушат при комнатной температуре и затем активируют при в течение часа. Пластины хранят в эксикаторе над хл ридом кальция. Перед нанесением образца пластины чистят в системе рас ворителей гексан ; диэтиловый эфир .уксусная кислота (50:10:1). Для про ведения хроматографического разделе ния на пластину наносят 1 мкл 23% раствора смеси липидов в хлороформе и проводят хроматографическое разде ление восходящим методом в стеклянной камере объемом 0,5 л в вышеуказанной системе растворителей. Oj6Hapy.жение липидных зон осуществляют прогреванием пластин в термостате и последующим денситометрированием. Обсчет денситограмм проводят по методу внутренней нормализации. Экспериментальные данные обрабатывают по методике Евтоподента с надежность1о 0,95. Число повторностей в каждом опыте не менее пяти. Данные количественного анализа искусственной смеси жирных кислот и ряда ацилглицеринов убедительно иллюстрирует преимущества использования в качестве обугливающего агента сульфата гидроксиламин§ перед сульфатом аммония (табл. 1, обнаружение липидных зон проводили прогреванием пластин при 210с в течение 30 мин) . г .Х- - Ошибка определения насыщенных и ненасыщенных компонентов () составляет 2,2-3,2%, в то время как при использовании в качестве бугливающего агента сульфата аммония по известному способу она достигает 41,5-62,2%. Использование предлагаемого способа обеспечивает значительное снижение различия в интенсивности обугливания насыщенных и ненасыщенных соединений и повышение точности определения липидов , содержащих остатки насыщенных жирных кИслот (табл.2, площадь пика линоленовой кислоты принята за 100%). , f Подобный сравнительный анализ промышленных липидных смесей (под солнечное масло и пальмовый стеарин) показали, что если при количественном определении липидов, содержащих высокий % ненасыщенных жирных кислот (подсолнечное масло), не наблюдаетх:я существенных различий по предлагаемому и известному способам, то в случае высоконасыщенного масла использование сульфата аммония в ка- честве обугливакмцего агента непригодно из-за значительных расхождений (табл. 3). В табл. 3 приведены результаты определения содержания триглицеридов денситометрическим методом. Сравнительный анализ количественнего состава природных липидов (дрожжевые микроорганизмы) по предлагаемому способу, весовым методом и с применением сульфата аммония в качестве обугливающего агента (табл. 4) показывает, что .предлагаемый способ обеспечивает большее совпадение с весовым способом, нежели известный. В табл. 4 приведены результаты количественного определения группового состава липидов дрожжей. Приведенные выше данные показывают, что предлагаемый способ обеспечивает значительное увеличение точности количественного анализа (от 5,9 до 41,5%) липидов, содержащих остатки насыщенных жирных кисло (три-, ди- и моно- ацилглицерины, фосфатидилхолин) вследствие того, что он позволяет избежать селективного обугливания липидов с ненасыщенными жирными кислотами, Пример 1, Пластины, приготовленные как указано выше, прогревают при 190, 200, 210 и . Интенсивность пятна маргариновой кислоты ( )/ определенная на денси тометре относительно интенсивности пятна-линоленовой кислоты .-j) , пр ведена .в .табл. 5 (отношение площаде пиков li . S9: Пример 2. Приготовление пластинок с закрепленным слоем сили кагеля, импрегнированного 10% сульфата гидроксиламина. Для приготовления 10 пластинок к силикагелю (1,050 г) и гипсу (0,105 г) приливают раствор 0,105г сульфата гидаоксиламина в 7,5 мл дистиллированной водой и-тщательно перемешивают. На одну пластинку наносят 0-,75 мл суспензии. Пластинки сушат при комнатной температуре и затем активируют при 110®С в течение часа. На пластинку наносят 1 мк .2%-го раствора кислоты (0,02 мг) в хлороформе и хроматографировании, как описано выше. Обнаружение кисло осуществляют, прогревая пластинки в термостате при 210С в течение 30 мин с последующим денситометриро ванием. Пример 3. Приготовление пластинок с закрепленным слоем силикагеля, импрегнированного 5% суль фата гидроксиламина. Для приготовления 10 пластинок К. силикагелю (1,050 г) и гипсу (0,105 г) приливают раствор 0,0525 .сульфата гидроксиламина в 7,5 мл ди тиллированной воды и тщательно пере мешивают. На одну пластинку наносят 0,75 МП суспензии. Подготовку пластинок, нанесение образцов, проявление хроматограмм и обнаружение.проводят как указано в примере 2. пример 4. Приготовление пластинок с закрепленным слоем сили кагеля, импрегнированного 20% суль фата гидроксиламина. Для приготовле ния 10 пластинок к силикагелю (1,050 г) и гипсу (0,105 г) прили вали раствор 0,21 г сульфата гидро ксиламина в 7,5 мл дистиллированно воды и тщательно перемешивают. На одну пластинку наносили 0,75 мл су спензии. Подготовку пластинок, нан ение образцов,-проявление хроматограмм и обнаружение проводят, как указано в примере 2. Результаты, полученные по примерам 2-4, приведены в табл. 6. Из данных, представленных в табл. 6, следует, что наиболее оптимальная концентрсщия импрегнирующего агента 10-15%. При более ниэ1сом содержании сульфата гидроксиламина (например, 5%) увеличивается различие в интенсивности обугливания насыще ной и ненасыщенной кислот. При увеличении концентрации импрегнирующего агента (например, 20%) интенсивность обугливания кислот не изменяется, но в связи с потемнением фона пластинки экстинкция зон уменьшается, что неблагоприятно сказывается на точности анализа. Пример 5. Пластины, пригоЧ товленные, как указано вьвие, прогревались при 210°С в течение 10-40 мин. Интенсивности пятка маргариновой кислоты относительно интенсивности пятна линоленовой кислоты приведены в табл. 7. Как следует из данных, предстагленных в табл. 7, наиболее оптимальным является время прогрева, равное 20-30 мин. При уменьшении времени прогрева (например, 10 мин) значительно возрастает разница площадей пиков насыщенной и ненасыщенной кислот. При увеличении времени прогрева (например, 40 мин) происходит по-видимому, деструкция линоленовой . кислоты, что приводит к снижению точности анализа. Данные по влиянию соотношения насыщенных и ненасыщенных соединений в группе на определение данной .группы липидов на хроматограммах. Сравнительные данные, полученные по предлагаемому способу и способу-прототипу, приведены, в табл. 8 J пpивeдeны средние значения не менее пяти параллельных измерений). Во всех случаях площадь пика ненасыщенного соединения принимгшась i5a 100%, влияние доли насыщенных, соединений на обнаружение определяли как разность между показаниями (выраженными в процентах) ненасыщенного соединения и соответствующей смеси (Л и Да.) . Отношение этих величин () показывает, что ошибка при определении на хроматограммах смесей, содержащих более 20% насыщенных соединений по предлагаемому способу в 1,2-9,2 раза меньше, чем по известному, при увеличении содержания ненасыщенных соединений в смеси зта величина возрастает и точность определения по предлагаемЬму способу превышает точность, определения по известному способу в 7-18 раз.

Таблица 1

40,0

38,7

Триолеин Маргариновая

3,2

64,9

62,2

VO

r

«л r

CO

00

r- co

o

rVO

in

VD

in

CO

о 00

r

M

о

ОЧ 00

t

rt -l

fS

го

a

CO 1-1

00 r CO

CO

VO CO

CO

e« о

«o

D 1-4

Ol

т

in

VO

и

in

in

)

CJ

N VO

CO tn

t in

4

tn in

7t

.4 tn tn

VO

in

го

4

VO tn

+1

-l

or

о

o«

o

о

M

ГО m

to

e

fM

VO

, «. . «. (SI .. «.

fO и- СЧ

о tn.

m tn VO +1

in

tn N.

fO

in

tn

(4

Т а б л и

ц а

Смесь диoлeии диaпaль штин

Таблица 8