Способ количественного определения регуляторов роста растений на основе четвертичных аммониевых солей Советский патент 1987 года по МПК G01N30/04 

Изобретение относится к аналитической химии, в частности к определению регуляторов роста растений методом твердожидкостной хроматографии, и может использоваться в химических и биохимических лабораториях для обнаружения и определения содержания в биологических объектах хлорхолинхло- рида, N-диметилморфолиний (хлорида морфола), Н,Н-дигидро(оксиэтил)-мор- фолиний хлорида (морфонола) и N,N-ди- метилпиперкдиний хлорида (пикса).

Цель изобретения - повышение селективности способа.

Способ осуществляют следующим образом (концентрации растворов ацетона

и этанола даны в объемных % в воде, концентрация всех других растворов дана в массовых % в воде). Навеску 50 г измельченного образца экстрагируют 80%-ным раствором этанола в воде при малом содержании углеводов и высоком липидов, например семян масfO

ческую плотность OKpniiieiifrhix пятен солей аммония на спектрофотометре в проходящем свете при 720-740 им. Количество определяемых регуляторов роста растений, являющихся четвертичными солями аммония, определяют по градуировочному графику, который строят в период проведения подготовительных операций, осуществляемых следующим образом.

На аналитических весах взвешивают по 1,00 г химически чистых регуляторов роста с точностью до 0,01 г. Навески переносят в мерную колбу на 5 300 мл и растворяют в 0,2 н. соляной кислоте, доводят объем до метки. С помощью бюретки переносят в 4 мерные колбы на 500 мл сьответственно 5, 15, 25 и 35 мл полученного стандартного маточного раствора и разбавляют до 500 мл дистиллированной водой.

На катионитовые пластины размерами

20

30

70x100 мм параллельно одной из мень- личных культур, или 80%-ным раствором у ших ctopOH пластинок и на расстоянии ацетона в воде при высоком содержании 13 мм от края мягким карандашом проводят стартовую линию, на которую наносят с помощью микропипеток разбавленные стандартные растворы по 0,05мл в порядке увеличения их концентрации, что соответствует количеству определяемых; регуляторов роста по зонам соответственно ,0:3,0; 5,0:7,0 мкг. Этот процесс выполняют в трехкрат- ной повторности (3 пластинки). 35 В хроматографическую камеру наливают 2,0-25%-ньш раствор серной кислоты и устанавливают в него катионитовые пластинки на ребро, вдоль которого нанесены определяемые регуляторы роста. После поднятия фронта раствора кислоты на высоту 80 мм от стартовой линии пластинки вынимают из камеры.

Для проявления хроматограмм опускают пластинки на 3/4 их высоты в 10,0-12,0%-ный раствор фосфорномолиб- деновой кислоты в воде, выдерживают 2-3 с,и промывают в 6 порциях воды

40

углеводов и малом липидов, например плодов фруктовых и ягодных культур, в анализируемом материале. Этанол и ацетон предварительно подкисляют соляной кислотой до рН 2,0. Экстракт в полном объеме очищают от липидов гек- саном и пропускают через колонку с силикагелем со скоростью 2-3 мл/мин.

Силикагель промывают от коэкстрактив- I

ных веществ 150 мл 45-55%-ного ацетона в воде со скоростью 30-40 мл/мин.. Хлорхолинхлорид и другие органические катионы, осевшие в микропорах силика- геля, элюирутот из последнего 250 мл 0,9-1,1%-ного раствора соляной кислоты со скоростью 2-3 мл/мин. Элюат упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 0,5 мл дистиллированной воды и наносят микропипеткой 0,1 мл на хроматографическую пластинку с тонким слоем катионита. Осуществляют развитие хроматограммы восходящим потоком 21,0-25,0%-ным раствором серной кислоты или 3,0-3,0%-ным раствором соля- Q ной кислоты. Дпя проявления разделенных четвертичных солей аммония хроматографическую пластину без просушки обрабатывают 10,,0%-ным раствором фосфорномолибденовой кислоты и 5 после промьгоки водой 0,8-1,2%-ным раствором двухлористого олова. После просушивания пластинки просветляют вазелиновым маслом и измеряют опти45

(первые 5 - водопроводная, а последняя - дистиллированная), выдерживая в них пластинки по 5 мин.

После промывки пластинки осушают фильтровальной бумагой, не касаясь катионита выше стартовой линии, и об- .рабатывают. 0,8-1,2%-ньм раствором двухлористого олова в воде aнaлoг iч- но первой процедуре, увеличивая выдержку до полного развития окраски

ческую плотность OKpniiieiifrhix пятен солей аммония на спектрофотометре в проходящем свете при 720-740 им. Количество определяемых регуляторов роста растений, являющихся четвертичными солями аммония, определяют по градуировочному графику, который строят в период проведения подготовительных операций, осуществляемых следующим образом.

На аналитических весах взвешивают по 1,00 г химически чистых регуляторов роста с точностью до 0,01 г. Навески переносят в мерную колбу на 300 мл и растворяют в 0,2 н. соляной кислоте, доводят объем до метки. С помощью бюретки переносят в 4 мерные колбы на 500 мл сьответственно 5, 15, 25 и 35 мл полученного стандартного маточного раствора и разбавляют до 500 мл дистиллированной водой.

На катионитовые пластины размерами

(первые 5 - водопроводная, а последняя - дистиллированная), выдерживая в них пластинки по 5 мин.

После промывки пластинки осушают фильтровальной бумагой, не касаясь катионита выше стартовой линии, и об- .рабатывают. 0,8-1,2%-ньм раствором двухлористого олова в воде aнaлoг iч- но первой процедуре, увеличивая выдержку до полного развития окраски

хроматограмм. На светло-голубом фоне образуются темно-синие пятна восста- новлеиньрс солей фосфорномодибденовых определяемых регуляторов роста.

Проявленные хроматограммы высуши- вают под феном и просветляют вазелиновым маслом посредством мазков мягкой (беличьей) кисточкой не менее, чем за 1 ч до измерения их оптической плотности. Измеряют оптическую плотность проявленных пятен хромато- грамм относительно окружающего фона пластин в проходящем или отраженном свете при 720,,0 нм.

Строят градуировочный график, откладывая по абсдиссе количества нанесенных на пластинку регуляторов роста в мкг, а по ординате - соответствующие им величины оптических плотностей пятеп хроматограмм, и вычисляют коэффициенты пропорциональности.

Приготовление колонок с силикаге- лем. Из мелкопористого силикагеля марки МСМ выделяют фракцию 0,5-1,5 м просеиванием. Закрепляют на штативе стеклянные хроматографические колонки высотой 300 и диаметром 11-13 мм. Заполняют колонки на 1/2 высоты дистиллированной водой и затем через воронку засыпают силнкагель, постукивая по колонке стеклянной палочкой. Высота уплотненной набивки силикагеля должна быть 145-155 мм.

Устанавливают на колонки питающие сосуды и промывают силикагель 1 л 2,0 н. соляной кислоты со скоростью 2-3 мл/мин, заполненные раствором кислоты колонки выдерживают 1 сут, а затем повторяют промывку в том же режиме. После кислотной промывки проводят промывку колонок дистиллированно водой до нейтрального показателя рН по индикаторной бумаге.

Смену нромыБочнь1Х жидкостей, а таже последующие внесения анализируемы растворов осуществляют при высоте прдыдущей жидкости над слоем сорбента

на О,5-1,О см. (

Устанавливают рабочие объемы аце-

тона (для промывки колонок и соляно кислоты (для вытеснения определяемых веществ), пропуская через колонки со скоростью 2-3 мл/мин АО мл водного .раствора, содержащего по 80-100 мкг определяемых регуляторов роста. Проход собирают в плоскодонные колбы на 250 мл. В том же режиме собирают 4 порции элюата по 50 мл 45,0-55,0%-но

5

0

5

О

0

0

5

0

5

го раствора ацетона в воде. Вымывают адсорбированные силикагелем регуляторы роста 0,9-1,1%-ным раствором соляной кислоты, собирают в 250 мл, плоскодонные колбы со скоростью 2- 3 мл/мин 4 порции: первая 150 мл и три последующих по 50 мл.

Собранные порции элюатов выпаривают досуха в ротационном испарителе. Сухие остатки в колбе после охлаждения до комнатной тe mepaтypы растворяют в 0,1-0,2 мл воды и в полном объеме наносят на катионитовые пластинки. Размер пластинок, нанесение и получение хроматограмм такие же, как при построении градуировочного графика.

На основании полученных результатов определяют рабочие объемы, например, для хлорхолинхлорила: первый для промьшки колонок, (от коэкстрактив- ных веществ при выполнении анализов), равный сумме объемов порций 45-55%- ного ацетона, в которых не обнаружены регуляторы роста, и второй для вытеснения адсорбированных регуляторов роста, равный сумме объемов порций 0,9-151%-ного раствора соляной кислоты, в которых обнаружены определяемые регуляторы роста. Например, в 45-55%- ном ацетоне обнаружен препарат в четвертой порции, а в 0,9-1,1%-ном растворе кислоты - в 1,2 и 3 порциях. Следовательно, промьгоать колонки от коэкстрактивных веществ нужно объемом не более 150 мл 45,0-55,0%-ного ацетона, а вытеснять адсорбированные препараты - объемом не менее 250 мл 0,9-1,1%-ной соляной кислоты. Первая порция прохода воды при внесении раствора препарата в колонку нужна для контроля полноты адсорбции силикагелем определяемых регуляторов роста.

Колонки, промытые дистиллированной водой от соляной кислоты, готовы к работе. Подготовленные и апробированные таким образом колонки с силикагелем могут использоваться постоянно без замены набивки, но не реже 2 раз в год проверяют и уточняют рабочие объемы для промывки и вытеснения определяемых регуляторов роста.

Пример 1.50г анализируемой средней пробы, измельченной на гомогенизаторе до размера частиц не более 1 мм, вносят в экстрактор, заливают 200 мл 80%-ного этанола или

80%-иого ацетона, подкисленных до рН 2 по индикаторной бумаге,и осуществляют процесс экстрагирования в течение 6 ч. Экстракт фильтруют чере бумажный фильтр в делительную воронку на 500 мл и смешивают с 50 мл гек сана путем энергичного встряхивания в течение 5 мин. После расслоения нижнюю фазу сливают в другую делительную воронку и повторяют процесс очистки новой порцией гексана. Операцию повторяют до получения бесцветного гексанового слоя.

Очищенный гексаном экстракт (нижняя фаза) пропускают через колонку с силикагелем со скоростью 2-3 мл/ /мин. Промывают колонку со скоростью 30-40 мл/мин 50%-ным раствором ацетона в воде с объемом, который установлен при апробации колонки. Поглощенные силикагелем регуляторы роста элюируют 1,0%-ным раствором соляной кислоты со скоростью 2-3 мл/мин объемом, который также установлен при апробации колонки. Солянокислый элю- ат собирают в плоскодонную колбу на 250 мл и выпаривают досуха (например на ротационном испарителе).

Сухой остаток растворяют в 0,5 мл дистиллированной воды, и 0,1 мл полученного раствора с помощью микропипеток в двукратной повторности наносят на катионитовую хроматографи- ческую пластинку. Нанесение и все дальнейшие операции вьтолняют так, как при получении градуировочного графика.

Содержание остаточных количеств регуляторов роста в анализируемой пробе вычисляют по формуле

f - 4

GX 5 А М где Cj( - содержание в пробе хлорхо- линхлорида мг/кг или мг/л;

5 - коэффициент, .равный отношению объема раствора сухого остатка экстракта (0,5 мл) к объему этого раствора, нанесенного на хроматографи- ческую пластинку (0,1 мл);

А - количество хлорхолинхлорида обнаруженное на хроматограм ме, мкг по градуировочному графику,

М - масса или объем анализируемой пробы, г или мл.

Пример 2, Определение проводят аналогично примеру 1, но промывку колонок осутцествляют 45%-ным раствором ацетона в воде и 0,9%-ным 5 раствором соляной кислоты.

Пример 3, Анализ проводят, используя 55%-ный раствор ацетона и 1,1%-ный раствор соляной кислоты.

)Q Результаты влияния концентрации ацетона в промывочном растворе на уменьшение содержания загрязняющих коэкстрактивных веществ (г) в элюа- те четвертичных солей аммония привеJ5 дены в табл. 1.

В табл. 2 приведены результаты влияния концентрации хлористоводороной кислоты на активность вымывания с 250 мл элюата адсорбированных силкагелем четвертичных солей (%).

20

Результаты определения препаратов четвертичных солей аммония и коэффициенты их подвижности приведены в табл. 3 и 4.

Пример 4. Проводят анализ аналогично примерам 1-3, определяя стабильность и воспроизводимость ре- .зультатов определений. Данные о стабильности сорбции мелкопористым силикагелем определяемых регуляторов роста при многократном использовании (200 определений) приведены в табл.5.

Формула изобретения

Способ количественного определения регуляторов роста растений на основе четвертичных аммониевых солей путем экстракции их органическим растворителем, пропусканием экстракта через колонку с адсорбентом, элюированием растворителем с последующим тонкослойным хроматографированием элюата, о т- личающийся. тем, что, с целью повышения точности и селективности определения, в качестве адсорбента используют силикагель, перед элюированием адсорбент обрабатывают 45-55 об.% раствором ацетона и в качестве растворителя используют 0,9- 1,1 мас.% раствор соляной кислоты в воде.

Картофель

Яблоки

Томаты

1,32 0,96 0,68 0,56 0,54 0,48 0,48 0,49 0,64 2,24 1,64 1,24 0,92 0,89 0,84 0,90 1,04 1,36 1,80 1,28 0,96 0,72 0,70 0,64 0,71 0,76 0,97

Таблица 1

Таблица 3

Вещество

N,Ы-Диметилпиперидиний

хлорид (пике)0,13-0,15

2-Хлорэтилтриметиламмоний хлорид (хлорхолинхлорид)0,21-0,25

N-Диметилморфолиний хлорид (морфол)0,29-0,31

Холин0,35-0,37

Триметиламин хлоргидрат 0,36-0,38

Примечание, Пределы обнаружения для пикса, хлорхолинхлорида и морфола равны 0,5 мкг, а для морфоно- ла 1,0 мкг.

2-Хпорэтилтриметиламмоний хлорид 100-200 8,}-9,7 150-250 24,9-29,1 41,8-3.8,4

и-Диметилморфолиний хлорид 200-300 7,-8,4 250-330 23,4-27,2 21 37,3-44,7

N,N-Дигидро-(оксиэтил)морфолиний хлорид 430-550 7,,0 450-550

22,1-24.5 . 40,8-48,4

Коэффициент подвижности

Таблица 5

Ы,Ы-Диметилпиперидиний хлорид

450-550

8,5-9,9

26,0-29,2

45,1-50,5

Составитель С. Хованская Редактор О. Бугир Техред А.Кравчук Корректор А. Зимокосов

Заказ 613/52 Тираж 777Подписное

ВНИШШ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

. Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

8,0-9,4

24,1-28,3

41,4-48,2

-5,4 -1,4 -7,3

Изобретение касается аналитической химии, в частности количественного определения регуляторов роста растений на основе четвертичных аммониевых солей, и может быть использовано для определения в биологических объектах хлорхолинхлорида, хлорида морфола или морфонола. Повьпление селективности определения с помощью экстракции растворителем и пропускания экстракта через адсорбент достигается использованием другого растворителя для элю- ирования - 0,9-1,1%-ного раствора НС1 в воде и адсорбента - силикагеля, который перед элюированием обрабатывают 45-55%-ным водным раствором ацетона со скоростью 30-40 мл/мин. Далее элюат хроматографируют в тонком слое. Способ позволяет определять пике,хлор холинхлорид.и морфол в концентрации 0,5 мкг, а морфонол - 1 мкг. 5 табл. (Л С ;о ел СА: CAD о: