Способ приготовления питательной среды для выявления дрожжей и плесеней в молоке и молочных продуктах Советский патент 1983 года по МПК C12N1/16 

Изобретение относится к микроЬио логии, а именно к приготовлению питательных сред, предназначенных для определения общего количества дрожжей и плесеней в молоке и молочных продуктах. Известен способ приготовления питательной среды для выявления дро жей и плесеней в молоке и молочных продуктах включающий получение пивн го сусла из ячменя путем длительной обработки при различных температурных режимах и приготовление на его основе суслового агара 1 . Недостатками этого способа являю ся длительность и сложность процесса и получение питательной среды нестабильного состав-а, срок хранения которой 10-15 дней. Наиболее близкими по технической сущности и достигаемому положительному эффекту к предложенному является способ приготовления питательной среды для выявления дрожжей и плесеней в молоке и молочных продуктах, предусматривающий получение питатель ной основы путем ферментативного гидролиза молочного белка в присутст вии хлороформа, освобождение от белкового осадка, сгущение, сушку смешивание с порошкообразным агар-агаром. Гидролиз обезжиренного молока . (титруемая кислотность 19°Т, активная кислотность рН 6,) проводят в щелочных условиях (рН 7,8-8,0) панкреатином в течение ч при постоянном коррегировании рН среды 20%-ным раствором едкоГо натра в присутствии хлороформа, который вносится одновременно с ферментом. Гидролиз проводится до содержания аминного азота 120-1 0 мг. %. После этого белковый осадок отделяется от гидролизата. Очищенный гидролизат сгущают и высушивают. При расфасовке в соответствии с рецептурой среды добавляется агар-аГар. рН выпускаемой среды 7,0-7,6. При приготовлении рабочего субстрата необхо димы подкисление его до рН 4,,5 раствором молочной кислоты и стерилизация, сопровождающаяся выделением обильного осадка, который удаляют фильтрацией 2}. Недостатком этого способа является получение питательной среды с заниженным углеводным питанием (содержание редуцирующих сахароз , что сопровождается недостаточно пол.ным выявлением дрожжей и плесеней, а также слабым дифференцирующим эффектом по отношению к сопутствующей молочнокислой микрофлоре, что требует проведения подтверждающего ТРС та - микроскопирования колоний микроорганизмов. Необходимость резкого снижения рН среды (от 0,,6 до 0-,5) в процессе приготовления рабочих субстратов в производственных условиях связана с нежелательным расходом молочной кислоты и отрицательным влиянием последней на состав среды и ее гелеобразующие свойства. Кроме того, проведение гидролиза в щелочной среде не позволяет осадить весь белок, который при приготовлении рабочего субстрата выпадает в осадок, что приводит к увеличению расхода среды на анализы. Цель изобретения - улучшение дифференцирующих и ростовых свойств среды и снижение ее себестоимости. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу приготовления питательной среды для выявления дрожжей и плесеней в молоке и молочных продуктах, предусматривающему получение питательной основы путем ферментативного гидролиза молочного белка в присутствии хлороформа, освобождение от белкового осадка; сгущение, сушку, смешивание с порошкообразным агар-агаром, для приготовления питательной основы составляют смесь из обезжиренного молока тит- руемой кислотностью 90-100°Т в количестве 68-70 и подсырной сыворотки - 30-32, гидролиз проводят ферментом реннинопузлиллйном, содержащим кислотоустойчивую протеазу, при рН it,8-5, в течение t-S ч до содержания аминного азота 70-90 мг.% и редуцирующих Сахаров 6, причем хлороформ вводят через ,75ч после внесения фермента, а в высушенный гидролизат допблнительно вводят индикатор бромфеноловый синий, фосфаты и Na-НРОд 2HvO при следующем соотношении компонентов, . г/л дистиллированной зоды: Сухой гидролизат смеси обезжиренного молока и подсырной сыворотки 30,,00 Агар-агар 20,00-25,00 ..

3101

Бромфеноловый синий0,10-0,20

Однозамещенный

фосфорнокислый

калий0,80-0,90

Дёузамещенный

фосфорнокислый

натрий - 0,01-0,0

В процессе приготовления смеси для гидролиза соблюдается строго определенное соотношение обезжиренного молока и молочной сыворотки.

При использовании сыворотки в количестве, превышающем 32, содержание Сахаров в смеси увеличивается, но при этом снижается уровень аминного азота за счет соответственного снижения количества обезжиренного молока в смеси. Это приводит к ухудшению ростовых свойств среды. В случае использования меньшего количества сыворотки (менее 30) и соответственного увеличения обезжиренного молока в смеси ухудшаются как ростовые, так и дефференцирующие свойства .среды. рН смеси при указанном соотношении компонентов находится в пределах ,8-5,0. Гидролиз осуествляют при 58-60°С с использованием фермента реннинопузиллина, имеющего оптимум действия в пределах активной кислотности составленной смеси. Фермент вносится в кьлиуестве 0,1-0,2 (25-30 ЕД/г)к объему смеси л Гидролиз проводят до содержания аминного азота 70-90 мгД и реуцирующих сахароз 6,0-6,5

Ферментётивный гидролизат, полученный с использованием реннинопузиллина отличается прозрачностью и стабильным рН(,0-,5) оптимальным для развития данной группы микро- организмов. Хлороформ в количестве OjtO.B вносится после 0,5-0,75 ч с начала гидролиза, что устраняет его ингибирующее действие на фермент. В высушенный гидролизат вводится индикатор бромфеноловый синий, что облегчает подсчет и дифференциацию выросших колоний, а также сокраает время проведения анализа за счет исключения подтверждающего теста - микроскопирования.

Дополнительное введение фосфатов HnPONeuHPO обеспечивает буферость рабочих питательных субстраов. Стабильность состава среды досигается тем, что она имеет значение

694

рН в пределах ,0-ч,Б, что полностью исключает необходимость внесения молочной кислоты в процессе приготовления рабочего субстрата.

J Прикер.КУл обезжиренно ПР молока с титруемой кислотностью 90 (рН 5.) добавляют 3 л под сыр ной сыворотки. Смешанные компоненты,подогревают до . В 100 мл подогретой

o смеси разводят 10 г порошка реннинопузиллина-и переносят в общую массу. Смесь вторично перемешивают. Хлороформ в количестве О, л добавляется через 0,75 ч после внесения фермен- 5 та. Ферментер герметически закрывают, через каждый час гидролизат перемешивают . Внешним признаком получения готового гидролизата является отделение белого творожистого осадка и отстаивание прозрачной желтоватой жидкости. В это время следят .за нарастанием аминного азота и содержанием редуцирующих Сахаров в гидролизате. При содержании аминного азота

5 80 мг. и редуцирующих Сахаров ,2 гидролиз прекращают. Продолжительность гидролиза 5 ч, конечный рН гидролиза ,5. Гидролизат полностью освобождается от белкового осадка

Q автоклавированием при 10 Па в течение 15 мин.

Гидролизат упаривается до содержания сухих веществ при . Сгущенный гидролизат высушивается распылительным способом до содержания сухих веществ Э.

Упаковка сухой питательной среды, предназначенной для приготовления 1 л рабочего субстрата, содержит 40 г сухого гидролизата, 25 г агар0агара, 0,1 г бромфенолового синего водорастворимого, 0,9 г , 0,0 г НЕоНРОл. Сухая питательная среда содержит аминного азота 7б5 мг. %t редуцирующих Сахаров 60%.

.Среды упаковываются в пакеты из полимерной пленки, обернутой в светонепроницаемую бумагу, и хранятся в течение 18 мес при комнатной температуре и относительной влажности 75. Для приготовления рабочего субстрата в производственных условиях содержимое упаковки переносится в колбу и доводится дистиллированной.

5 водой до 1 л, нагревается до расплавления агара и стерилизуется при 10 Па в течение 10 мин, рН рабочего субстрата ,. При микробиологическом изучении среды, приготовленной согласно предлагаемому способу, проводили сравнительные посевы на указанном субст. рате, сусловом агаре и сухой пита- тельной среде по ТУ Э . В качестве посевного материала использовали смесь штаммов дрожжей, .плесеней и молочнокислых микроорганизмов, молочные продукты, смывы с производственного оборудования; Термостатировали посевы при ние k сут. Результаты сравнительных noceioB приведены в таблице. Использование среды с индикатором .позволяет дифференцировать дрожжи и плесени от молочнокислых микроорганизмов, не прибегая к микроскопированию.Колонии дрожжей - серые со стальным блеском, плесени имеют инди 1 69 . . видуальную окраску, колонии молс1чнокислых бактерий окрашиваются, в яркосиний цвет. На среде, приготовленной согласно предлагаемому способу, рост дрожжей и плесеней не тормозится, учет посевов намного облегчен. Изучение колоний, вь1росших на сравниваемых питательных субстратах, показало, что предлагаемый способ .приготовления среды обеспечивает более полное выявление дрожжей и плесеней за -счет улучшенных ростовых свойств и стабильности субстрата. Экономический эффект от использования сухой питательной среды по предлагаемому способу составляет 233,Э руб.

Смесь штаммов дрожжей, плесекей и мелочно, i

1,7-10 1,0«10

8 Продолжение таблицы-i

6,7-10 ЬЭ-Ю ЬМО 6,