Штамм бактерий BacILLUS вRеVIS-продуцент рестриктазы В @ BI Советский патент 1993 года по МПК C12N9/16 C12N1/20 

Описание патента на изобретение SU1832129A1

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в практике научно-исследовательской работы в молекулярной биологии, биохимии, генетический инженерии,

Целью изобретения является получение штамма бактерий, продуцирующих новую эндонуклеазу рестрикции BbvBI со специфичностью 5 G G(T/CXA/G)CC3 с высоким выходом,

Поставленная задача достигается тем, что биомассу В. brevls ВКМ В-679 выращивают в аэробных условиях в питательной

среде, содержащей источники углерода, затем и минеральные соли до поздней логарифмической фазы роста, целевой продукт выделяют из полученной биомассы известными методами.

Эндонуклеаза рестрикции BbvBI, изо- шизомер HgiCI, узнает и гидролизует участок нуклеотидной последовательности ДНК б С СГГ/СХА/фССЗ1. Рестриктаза расщепляет ДНК фага А по 25 участкам, ДНК аденовируса Ad2 по 57, ДНК обезьяннего вируса SV40 по 1, ДНК фага 0X174 по 3 и плазмиду pBR322 по 9.

оо со

ю

го

N0

Г о и с к шта м м a-n p о дун о к та 11 о о вод мл м при помощи разработанное- нами экспресс-метода тестирований зиткчност л ре- стрмктзз в толуольных зкс фзнтах ш клеток микроорганизмов с последующим электрофорезом продуктов расщепления ДНК в ;з га-роз ном геле.

Штамм В, В KM ПЧГ/9 получен нзми мз Всесоюзной коллакии-. ; микроорганизмов СССР, еде оп хранится под № BKivl B--879 -NCIB 8698 (Каталог культу;,: Всесоюзной коллекции нйпатог v.u: MX. рооргзнызмои. Наука, 1976, с. ;нм.

Характеристик ; штлммгг.

Морфологические особенпоппт Палочки, подвижны. Образуют спиоьу oaMno/iO-- житеяьные (иногда п .. знак парьируот Гра.-ГТрам).

Культура л ьно 5похимичоски о -с юйстгза, На скошенном агаре, рост по штриху кеж ный, мелкие, блестящие колонн;;. На чаи ках Петри с мйсопаптониым агаром мелкие, блестящие, гладкие колонии. На млссна. тонном бульоне м бульона Хот гнкгзра - о л номерное помутнение осадок.

Отношение к кислородуазроб.

Утилизация угя.йродот - на i:i :c- лота ± , газ +, на аннмте ±. .

И и дал и сероводород- не образует.

Желатина уколов - разжижение.

Огггимальные условия ;ыпащм ч пн;: . хранения культуры.

Культура В. bravis BKiVl B-679 хороша растет в условиях аэрации при 37VC па бульоне Хоттингера, содержагцом 2% глюкозы, без глюкозы, на среде с гидроли этом спль,- км и средь LB. При ш,ращунз:.:шг,; ;;ультури t lpn 37°C на качалке из различ;-;;.:) с.рздох - .течение 10ч значение Аб50 составляет: оуль- сп Хоттингера 1,3; бульон Хотгнмг .гр; ;-2% глюкозы 1,8; среда LB-1, x срг:п.о с рмС;нуг ; гидро;шзатом 2,5.

Ферментацию куль :/ прополз ;ю::;,:а добавления. п фермент.;:- :.;нохул ; |;1 г ссос- ношении 1:10 к объему среде:-;.

Оптимум роста культуры: темпепл тура 37°С, рИ 7,2-7,4.

Наиболее высокое накоплен .е актиг.но.сти рестриктазы BbvS п бкомаисе происхпдмт при выращивании купътуры и

ферментера при 37°С с аэрацией из среде с

рыбным гид релиз атом.

Рабочие культуры пересеиоают нг бульон Хоттингера или мяео-пептониый иульон 1 раз в 7-10 дней. Хранят культуру к пол- ужиДком мпсо-пептонном агаре под .злзели- новым маспом или в яиофплизпропанном виде в ампулах.

Выделение рестриктазы BbvBI прово- дпт фракционированием в двухфазной сис- т о м е п о л и з т и л е н г л и к о л ь / д е к с т р а н и хроматографией на колонках с аффинными и ионообменными сорбентами.

Инкубационная смесь для определения активности рестриктазы BbvBI, объемом40- 50 мкл, со.пермалт 0.01 М трис-HCI, рН 7,5, 0,01 М fvlgC ;;, 0,001 М дитиотреитола, 100 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина, 1,5 мкг ДНК фага Аи 0,3-3 мкл фермента. l i;;:; G iiHio проводят при 37°С в течение 60 м /;|-. Продукты гидролиза ДНК фага Я раз- 5л:1:от электрофорезом в 1,2-1,5% агароз- ном еле с последующим прокрашиванием. :. боомистом этидии. За единицу актив- ;. р .:.,стазы BbvBI принимают коли- м; фспг ентя (в мкл), которое за 1 ч Sauwii полиостью гидролизует 1 мкг :b;ira А при оптимальных условиях реакП п н м а р 1. Культуру В. brevis BKM В-079 Г рцдз;зрительно адаптируют в тече- и;.;с ночи при 37°С в условиях аэрации на ссн(п;ппй г.-тательиой среде, содержащей в 1 л; гмдролизат кильки 33,0 г; NaCI 7,0 г; до

1гокулят для посева п ферментер гото- ерссс-:аГ:Я адантировзнную культуру на т-:. гс:Л из расчета 1:10, и рззмно Ь ,

1ч5;з лент;;ц. культуры проводят после плзпим D среду ннокулята в соотноше- : 10 к объему среды в условиях аэрации v/°C, рН соеды 7,2-7,4. inn выращивании рН культуральной поддерживают в пределах 7,0 ыраин1 яние продолжают до достиже- ю.- . логарифмической фазы роста. ь ход сырой Ь момзссы 6-7,5 г/л куль ЬНОЙ ЖИДКОСТИ.

л-.диркаммз рестриктазы BbvBI в био- .-. составляет 9000-10000 ед./г микро1 3ыделеиив рестриктазы.

К) г биомассы В brevis BKM B-679 суспендируют з буфере, клетки разрушают уль- тг)азг)уковой дезинтеграцией при 2-4°С и к.:;сточ -г гО суспензию центрифугируют при i05000 g v, течен-ие 60 мин. Содержащуюся в нздооадочной жидкости рестриктазу

Bl.:vBi фраКЦИОНИруЮТ Б СИСТвМб ПОЛИЭТИjiei /инсояь/декстран по Альбертсону, по- сле чего обогащенную по ферменту BbvBI верхнюю фазу хроматографируют в калий- фосф-йтном в градиенте концентрации КС на колонках с голубой сефэрозой CL-fiB (Plinrrnacia, Швеция), фосфоцеллюлозой Р11 (Whatman, Англия) и гепарин- сефарозой CL-6B (Pharmacia, Швеция).

Получают 15000ед. активности фермента в 5 мл буфера с 50% глицерином. Выход очищенного препарата рестриктазы BbvBI составляет 1500 ед. на 1 г сырого веса биомассы. Активность фермента не снижается при хранении при -20°С в течение 6-8 мес.

Препарат рестриктазы BbvBI не содержит примесей фосфатаз, экзонуклеаз и не- специфических эндонуклеаз и пригоден для целей молекулярного клонирования и структурных исследований ДНК.

Пример 2. Культивирование штамма В. brevis BKM B--679 проводят аналогично описанному в примере 1, за исключением того, что в качестве питательной среды используют среду, содержащую в 1 л: 250 мл основного перевара Хоттингера; 5 г NaCI; 1 г КаНРСМ; до 1 л Н20.

Выход биомассы 4-5 г/л культуральной жидкости,

Содержание эндонуклеэзы рестрикции в биомассе 7000-8500 ед/г сырого веса.

После проведения очистки фермента, как описано выше, выход рестриктазы Вы/В составляет 1200 ед. актипности/гсырого веса биомассы.

Таким образом, по предлагаемому способу получают новую зндонуклеазу рестрикции BbvBI.

Биомасса штамма В. brevis BKM B-679 содержит новую сайт-специфическую зндонуклеазу BbvBI, узнающую и расщепляющую нуклеотидную последовательность 5(ji3fr/A)(A/G)CC3 в количествах, достаточных для получения фермента в препаративных масштабах содержанке рестриктазы BbvB в биомассег7000-10000 ед/r сырого веса.

Выход очищенной рестриктазы HglCI, изошизомера BbvBI, авторами не указан 1.

Для рестриктазы BbvBi. выход очищенного фермента составляет 1200-1500 ед. на 1 г римкробной массы,

Эндонуклеазз рестрикции BbvBI не содержит примесей фосфатаз и неспецифических нуклеаз.

НСчый фермеи; ) быть использован в биотех нол.огиче.ских и генно-инженерных исследованиях.

Ф. о р м у л а изобретения Штамм бактерий Bacillus brevis BKM B- 679 - продуцент рестриктазы BbvBI.

Похожие патенты SU1832129A1

название год авторы номер документа
Способ получения рестриктазы В @ AI 1990
  • Соколов Николай Николаевич
  • Фицнер Андрей Борисович
  • Аникейчева Нина Васильевна
  • Хорошутина Элла Борисовна
  • Самко Ольга Тихоновна
  • Калугин Алексей Александрович
  • Либрик Галина Исаковна
SU1712415A1
Штамм бактерий BacILLUS coaGULaNS - продуцент рестриктазы Всо AI 1990
  • Соколов Николай Николаевич
  • Аникейчева Нина Васильевна
  • Эльдаров Михаил Анатольевич
  • Фицнер Андрей Борисович
  • Карпычев Игорь Викторович
  • Калугин Алексей Александрович
  • Самко Ольга Тихоновна
  • Хорошутина Элла Борисовна
  • Либрик Галина Исаковна
SU1761804A1
Штамм бактерий BacILLUS aLVeI - продуцент рестриктазы BaV В II 1990
  • Соколов Николай Николаевич
  • Аникейчева Нина Васильевна
  • Фицнер Андрей Борисович
  • Самко Ольга Тихоновна
  • Хорошутина Элла Борисовна
  • Калугин Алексей Александрович
  • Либрик Галина Исаковна
SU1761803A1
Способ получения рестриктазы BSp DI 1990
  • Соколов Николай Николаевич
  • Аникейчева Нина Васильевна
  • Фицнер Андрей Борисович
  • Самко Ольга Тихоновна
  • Калугин Алексей Александрович
  • Хорошутина Элла Борисовна
  • Либрик Галина Исаковна
SU1707077A1
Штамм бактерий АснRомовастеR aGILe - продуцент рестриктазы AaG 525 I 1989
  • Соколов Николай Николаевич
  • Фодор Иштван Иштванович
  • Фицнер Андрей Борисович
  • Аникейчева Нина Васильевна
  • Калугин Алексей Александрович
  • Самко Ольга Тихоновна
  • Эльдаров Михаил Анатольевич
  • Хорошутина Элла Борисовна
SU1648976A1
Штамм бактерий LастовасILLUS рLаNтаRUм - продуцент рестриктазы LP @ 1989
  • Соколов Николай Николаевич
  • Фодор Иштван Иштванович
  • Фицнер Андрей Борисович
  • Аникейчева Нина Васильевна
  • Калугин Алексей Александрович
  • Хорошутина Элла Борисовна
  • Самко Ольга Тихоновна
  • Коваленко Наталия Аркадьевна
  • Эльдаров Михаил Анатольевич
SU1678832A1
Штамм бактерий BacILLUS aLVeI - продуцент рестриктазы В @ 1 1990
  • Соколов Николай Николаевич
  • Фодор Иштван Иштванович
  • Аникейчева Нина Васильевна
  • Фицнер Андрей Борисович
  • Калугин Алексей Александрович
  • Хорошутина Элла Борисовна
  • Самко Ольга Тихоновна
  • Эльдаров Михаил Анатольевич
SU1678833A1
ШТАММ PSEUDOMONAS AERUGINOSA-18 - ПРОДУЦЕНТ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКТАЗЫ PAE 11 1985
  • Соколов Н.Н.
  • Фодор И.И.
  • Фицнер А.Б.
  • Хорошутина Э.Б.
  • Аникейчева Н.В.
  • Самко О.Т.
  • Колоша В.О.
SU1314669A1
РЕКОМБИНАТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК PECO29KI, ОПРЕДЕЛЯЮЩАЯ СИНТЕЗ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ ECO29KI И ШТАММ ESCHERICHIA COLI - ПРОДУЦЕНТ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ ECO29KI 1992
  • Кравец Анатолий Николаевич[Ua]
  • Солонин Александр Сергеевич[Ru]
  • Перцев Александр Владимирович[Ru]
  • Захарова Марина Викторовна[Ru]
  • Белецкая Ирина Викторовна[Ru]
RU2054037C1
ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI - ПРОДУЦЕНТ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ CFRBI 1992
  • Кравец А.Н.
  • Солонин А.С.
  • Кузьмина Н.М.
RU2038382C1

Реферат патента 1993 года Штамм бактерий BacILLUS вRеVIS-продуцент рестриктазы В @ BI

Использование: биотехнология и практика научно-исследовательской работы в молекулярной биологии, биохимии генетической инженерии. Сущность изобретения: продуцент В. brevls В КМ В-679 выращивают в аэробных условиях в питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли до поздней логарифмической фазы роста, целевой продукт выделяют из полученной биомассы известными методами. Биомасса В. brevls В КМ В-679 содержит новую сайт-специфическую эндо- нуклеазу BbvBI, узнающую и расщепляющую последовательность ДНК 5 G CfT/CXA/G)CC3 .B количествах, достаточных для получения рестриктазы в препаративных масштабах, содержание рестриктазы BbvBI в биомассе 7000-10000 ед на 1 г сырого веса. Для изошизомера BtvBt, рестриктазы HgiCI, выход очищенного фермента не указан. Выход очищенного препарата рестриктазы BbvBI составляет 1200-1500 ед. на 1 г сырой биомассы. Эндонуклеаза рестрикции BbvBI не содержит примесей фос- фатаз, неспецифических эндонуклеаз и экзонуклеаз.

Формула изобретения SU 1 832 129 A1

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 1993 года SU1832129A1

Печь для непрерывного получения сернистого натрия 1921
  • Настюков А.М.
  • Настюков К.И.
SU1A1
Kroger М„ Hobom G.« Schutte Н„ Mayer Н
Nucleic Acids Research
Колосниковая решетка с чередующимися неподвижными и движущимися возвратно-поступательно колосниками 1917
  • Р.К. Каблиц
SU1984A1
Станок для автоматической дуговой сварки труб 1924
  • Дульчевский Д.А.
SU3127A1
Аппарат для очищения воды при помощи химических реактивов 1917
  • Гордон И.Д.
SU2A1
Авторское свидетельство СССР Nfe 1170777, кл
Способ гальванического снятия позолоты с серебряных изделий без заметного изменения их формы 1923
  • Бердников М.И.
SU12A1

SU 1 832 129 A1

Авторы

Соколов Николай Николаевич

Аникейчева Нина Васильевна

Эльдаров Михаил Анатольевич

Фицнер Андрей Борисович

Карпычев Игорь Викторович

Калугин Алексей Александрович

Самко Ольга Тихоновна

Хорошутина Элла Борисовна

Либрик Галина Исаковна

Даты

1993-08-07Публикация

1990-12-27Подача