Штамм бактерий BacILLUS вRеVIS-продуцент рестриктазы В @ BI Советский патент 1993 года по МПК C12N9/16 C12N1/20 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в практике научно-исследовательской работы в молекулярной биологии, биохимии, генетический инженерии,

Целью изобретения является получение штамма бактерий, продуцирующих новую эндонуклеазу рестрикции BbvBI со специфичностью 5 G G(T/CXA/G)CC3 с высоким выходом,

Поставленная задача достигается тем, что биомассу В. brevls ВКМ В-679 выращивают в аэробных условиях в питательной

среде, содержащей источники углерода, затем и минеральные соли до поздней логарифмической фазы роста, целевой продукт выделяют из полученной биомассы известными методами.

Эндонуклеаза рестрикции BbvBI, изо- шизомер HgiCI, узнает и гидролизует участок нуклеотидной последовательности ДНК б С СГГ/СХА/фССЗ1. Рестриктаза расщепляет ДНК фага А по 25 участкам, ДНК аденовируса Ad2 по 57, ДНК обезьяннего вируса SV40 по 1, ДНК фага 0X174 по 3 и плазмиду pBR322 по 9.

оо со

ю

го

N0

Г о и с к шта м м a-n p о дун о к та 11 о о вод мл м при помощи разработанное- нами экспресс-метода тестирований зиткчност л ре- стрмктзз в толуольных зкс фзнтах ш клеток микроорганизмов с последующим электрофорезом продуктов расщепления ДНК в ;з га-роз ном геле.

Штамм В, В KM ПЧГ/9 получен нзми мз Всесоюзной коллакии-. ; микроорганизмов СССР, еде оп хранится под № BKivl B--879 -NCIB 8698 (Каталог культу;,: Всесоюзной коллекции нйпатог v.u: MX. рооргзнызмои. Наука, 1976, с. ;нм.

Характеристик ; штлммгг.

Морфологические особенпоппт Палочки, подвижны. Образуют спиоьу oaMno/iO-- житеяьные (иногда п .. знак парьируот Гра.-ГТрам).

Культура л ьно 5похимичоски о -с юйстгза, На скошенном агаре, рост по штриху кеж ный, мелкие, блестящие колонн;;. На чаи ках Петри с мйсопаптониым агаром мелкие, блестящие, гладкие колонии. На млссна. тонном бульоне м бульона Хот гнкгзра - о л номерное помутнение осадок.

Отношение к кислородуазроб.

Утилизация угя.йродот - на i:i :c- лота ± , газ +, на аннмте ±. .

И и дал и сероводород- не образует.

Желатина уколов - разжижение.

Огггимальные условия ;ыпащм ч пн;: . хранения культуры.

Культура В. bravis BKiVl B-679 хороша растет в условиях аэрации при 37VC па бульоне Хоттингера, содержагцом 2% глюкозы, без глюкозы, на среде с гидроли этом спль,- км и средь LB. При ш,ращунз:.:шг,; ;;ультури t lpn 37°C на качалке из различ;-;;.:) с.рздох - .течение 10ч значение Аб50 составляет: оуль- сп Хоттингера 1,3; бульон Хотгнмг .гр; ;-2% глюкозы 1,8; среда LB-1, x срг:п.о с рмС;нуг ; гидро;шзатом 2,5.

Ферментацию куль :/ прополз ;ю::;,:а добавления. п фермент.;:- :.;нохул ; |;1 г ссос- ношении 1:10 к объему среде:-;.

Оптимум роста культуры: темпепл тура 37°С, рИ 7,2-7,4.

Наиболее высокое накоплен .е актиг.но.сти рестриктазы BbvS п бкомаисе происхпдмт при выращивании купътуры и

ферментера при 37°С с аэрацией из среде с

рыбным гид релиз атом.

Рабочие культуры пересеиоают нг бульон Хоттингера или мяео-пептониый иульон 1 раз в 7-10 дней. Хранят культуру к пол- ужиДком мпсо-пептонном агаре под .злзели- новым маспом или в яиофплизпропанном виде в ампулах.

Выделение рестриктазы BbvBI прово- дпт фракционированием в двухфазной сис- т о м е п о л и з т и л е н г л и к о л ь / д е к с т р а н и хроматографией на колонках с аффинными и ионообменными сорбентами.

Инкубационная смесь для определения активности рестриктазы BbvBI, объемом40- 50 мкл, со.пермалт 0.01 М трис-HCI, рН 7,5, 0,01 М fvlgC ;;, 0,001 М дитиотреитола, 100 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина, 1,5 мкг ДНК фага Аи 0,3-3 мкл фермента. l i;;:; G iiHio проводят при 37°С в течение 60 м /;|-. Продукты гидролиза ДНК фага Я раз- 5л:1:от электрофорезом в 1,2-1,5% агароз- ном еле с последующим прокрашиванием. :. боомистом этидии. За единицу актив- ;. р .:.,стазы BbvBI принимают коли- м; фспг ентя (в мкл), которое за 1 ч Sauwii полиостью гидролизует 1 мкг :b;ira А при оптимальных условиях реакП п н м а р 1. Культуру В. brevis BKM В-079 Г рцдз;зрительно адаптируют в тече- и;.;с ночи при 37°С в условиях аэрации на ссн(п;ппй г.-тательиой среде, содержащей в 1 л; гмдролизат кильки 33,0 г; NaCI 7,0 г; до

1гокулят для посева п ферментер гото- ерссс-:аГ:Я адантировзнную культуру на т-:. гс:Л из расчета 1:10, и рззмно Ь ,

1ч5;з лент;;ц. культуры проводят после плзпим D среду ннокулята в соотноше- : 10 к объему среды в условиях аэрации v/°C, рН соеды 7,2-7,4. inn выращивании рН культуральной поддерживают в пределах 7,0 ыраин1 яние продолжают до достиже- ю.- . логарифмической фазы роста. ь ход сырой Ь момзссы 6-7,5 г/л куль ЬНОЙ ЖИДКОСТИ.

л-.диркаммз рестриктазы BbvBI в био- .-. составляет 9000-10000 ед./г микро1 3ыделеиив рестриктазы.

К) г биомассы В brevis BKM B-679 суспендируют з буфере, клетки разрушают уль- тг)азг)уковой дезинтеграцией при 2-4°С и к.:;сточ -г гО суспензию центрифугируют при i05000 g v, течен-ие 60 мин. Содержащуюся в нздооадочной жидкости рестриктазу

Bl.:vBi фраКЦИОНИруЮТ Б СИСТвМб ПОЛИЭТИjiei /инсояь/декстран по Альбертсону, по- сле чего обогащенную по ферменту BbvBI верхнюю фазу хроматографируют в калий- фосф-йтном в градиенте концентрации КС на колонках с голубой сефэрозой CL-fiB (Plinrrnacia, Швеция), фосфоцеллюлозой Р11 (Whatman, Англия) и гепарин- сефарозой CL-6B (Pharmacia, Швеция).

Получают 15000ед. активности фермента в 5 мл буфера с 50% глицерином. Выход очищенного препарата рестриктазы BbvBI составляет 1500 ед. на 1 г сырого веса биомассы. Активность фермента не снижается при хранении при -20°С в течение 6-8 мес.

Препарат рестриктазы BbvBI не содержит примесей фосфатаз, экзонуклеаз и не- специфических эндонуклеаз и пригоден для целей молекулярного клонирования и структурных исследований ДНК.

Пример 2. Культивирование штамма В. brevis BKM B--679 проводят аналогично описанному в примере 1, за исключением того, что в качестве питательной среды используют среду, содержащую в 1 л: 250 мл основного перевара Хоттингера; 5 г NaCI; 1 г КаНРСМ; до 1 л Н20.

Выход биомассы 4-5 г/л культуральной жидкости,

Содержание эндонуклеэзы рестрикции в биомассе 7000-8500 ед/г сырого веса.

После проведения очистки фермента, как описано выше, выход рестриктазы Вы/В составляет 1200 ед. актипности/гсырого веса биомассы.

Таким образом, по предлагаемому способу получают новую зндонуклеазу рестрикции BbvBI.

Биомасса штамма В. brevis BKM B-679 содержит новую сайт-специфическую зндонуклеазу BbvBI, узнающую и расщепляющую нуклеотидную последовательность 5(ji3fr/A)(A/G)CC3 в количествах, достаточных для получения фермента в препаративных масштабах содержанке рестриктазы BbvB в биомассег7000-10000 ед/r сырого веса.

Выход очищенной рестриктазы HglCI, изошизомера BbvBI, авторами не указан 1.

Для рестриктазы BbvBi. выход очищенного фермента составляет 1200-1500 ед. на 1 г римкробной массы,

Эндонуклеазз рестрикции BbvBI не содержит примесей фосфатаз и неспецифических нуклеаз.

НСчый фермеи; ) быть использован в биотех нол.огиче.ских и генно-инженерных исследованиях.

Ф. о р м у л а изобретения Штамм бактерий Bacillus brevis BKM B- 679 - продуцент рестриктазы BbvBI.

Использование: биотехнология и практика научно-исследовательской работы в молекулярной биологии, биохимии генетической инженерии. Сущность изобретения: продуцент В. brevls В КМ В-679 выращивают в аэробных условиях в питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли до поздней логарифмической фазы роста, целевой продукт выделяют из полученной биомассы известными методами. Биомасса В. brevls В КМ В-679 содержит новую сайт-специфическую эндо- нуклеазу BbvBI, узнающую и расщепляющую последовательность ДНК 5 G CfT/CXA/G)CC3 .B количествах, достаточных для получения рестриктазы в препаративных масштабах, содержание рестриктазы BbvBI в биомассе 7000-10000 ед на 1 г сырого веса. Для изошизомера BtvBt, рестриктазы HgiCI, выход очищенного фермента не указан. Выход очищенного препарата рестриктазы BbvBI составляет 1200-1500 ед. на 1 г сырой биомассы. Эндонуклеаза рестрикции BbvBI не содержит примесей фос- фатаз, неспецифических эндонуклеаз и экзонуклеаз.