Способ получения рестриктазы BSp DI Советский патент 1992 года по МПК C12N9/14 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в научно-исследовательской работе в генетической инженерии и молекулярной биологии.

Рестриктазы II класса (сайт-специфические эндонуклеазы) широко применяются при изучении первичной структуры ДНК, в молекулярном клонировании, изучении структурно-функциональной организации генома, выяснении механизмов экспрессии генов, в частности роли метилирования в этом процессе.

В литературе описано более 1100 эндо- нуклеаз рестрикции, одна из которых выделена из Streptococcus aureus ЗА.

Этот фермент имеет 116 участков узнавания на ДНК бактериофага Я, 87 - на ДНК аденовируса Ad2, 8 - на ДНК обезьяннего

вируса SV40, 22 - на плазмиде pBR322 и ни одного на ДНК .

Содержание рестриктазы Sau3AI в биомассе S.aureus ЗА не указано, выход очищенного препарата фермента составлял 500 ед/г биомассы.

Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта.

Поиск штамма-продуцента осуществляли с помощью разработанного экспресс-метода определения рестриктазной активности в толуольных лиза тах из клеток микроорганизмов с последующим электро- форетическим разделением в агарозном геле продуктов расщепления ДНК.

Поставленная задача достигается тем, что в качестве продуцента рестриктазы используют Bacillus sphaericus ВКМ В-752 (D

о VI

о VI VI

I), который выращивают на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, в условиях аэрации, целевой продукт выделяют из полученной биомассы известными методами.

Рестриктаза Bsp DI - изошизомер SauSAI узнает участок нуклеотидной последовательности ДНК 5...САТС....З и расшеп- ляет ДНК фага А по 116 участкам. ДНК вируса SV40 - по 8, ДНК плазмиды pBR 322

- по 22 и не гидролизует.ДНК рк174.

Штамм Bacillus sphaerlcus BKM В-752 был получен из Всесоюзной Коллекции Мик- ррорганизмов АН СССР, где хранится по номером ВКМ В-752 ССМ 1087-Ви 386- АТСС 10208 N.R.Smith 966 (Каталог культур Всесоюзной коллекции непатогенных микроорганизмов).

Характеристика штамма.

Морфологические особенности.

Палочки подвижны, грамотрицательны.

Культурэльно-биохимические свойства.

На скошенном агаре рост по штриху обильный. На чашках с мясопептонным агаром колонии крупные, матовые. На мясо- пептонном бульоне Хоттингера заметное равномерное помутнение, осадок.

Отношение к кислороду - аэроб.

Лакмусовое молоко - свертывание, пен- тонизация. Индол - не образует. На глюкозе

- кислота+, газ-, маннит-. Желатина уколом

- разжижение.

Оптимальные условия выращивания и хранения культуры.

Культура B.sphaericus BKM В-752 хорошо растет на твердых и жидких полноценных питательных средах: масопептонном агаре, бульоне Хоттингера, среде LB. Оптимум роста культуры при рН среды 7,2 - 7,4. При рН 10 культура не растет.

Наибольший выход биомассы, содержащей рестриктазу BspDI, достигается в том случае, когда штамм-продуцент выращивают на питательной среде Хоттингера, которая содержит в 1 л 25Q мл основного перевара Хоттингера, 5 г NaCI, 1 г К2НР04 и до 1 л Н20.

Ферментацию культуры проводят после добавления в ферментер инокулята в соотношении 1:10 к объему среды.

Рабочие культуры пересевуют на среду Хоттингера один раз в 8 - 10 дней. Хранят культуру в полужидком агаре под вазелиновым маслом или в лиофилизировзнном виде в-ампулах.

Выделение рестриктазы BspDI производят фракционированием полиэтиленими- ном и хроматографией на колонках с аффинным сорбентом и ионообменниками.

Инкубационная смесь, для определения активности рестриктэзы BspDI объемом 50 мкг, содержит 0,01 М трис-НС буфер(рН 7,4) 0,01 М iv1gd2, 0.001 М дитиотреитола (или

Г,007 М 2-меркаптоэтанола) и 2 мкг ДНК фага А . Инкубацию проводят при 37°С л течение 60 мин. Продукты расщепления ДНК фага А рестриктазой BspDI анализируют в 1,4%-ном агарозном геле с последующим прокрашиванием геля бромидом этидия. 3,1 единицу активности фермента принимают то минимальное количество (в мкл), которое необходимо для полного расщепления 1 мкг ДНК фага Я при 37°С за

ч инкубации в стандартных условиях инкубационной смеси.

Пример 1. Культуру В, sphaericus ВКМ В-752 предварительно адаптируют в течение ночи при 37°С в условиях аэрации

на основной питательной среде, содержащей в 1 л 250 мл основного перевара Хоттингера, 5 г NaCI, 1 г К2НРО 1 и до 1 л воды. Инокулят для ферментера готовят, пересевая адаптированную культуру на 1 л свежей

среды из расчета 1:10 и размножают в условиях аэрации.

Ферментацию культуры проводят после добавления в среду инокулята в соотношении 1:10 к объему среды при 37°С г условиях

аэрации (рН среды 7,2 - 7,4).

Зо время выращивания рН культураль- HOI жидкости поддерживают в пределах 7.1 - 7,5. Выращивание продолжают до достижения конца логарифмической фазы роста.

Выход сырой биомассы составляет 3 - 4 г/п культуральной жидкости. Содержание рестриктазы BspDI в биомассе составляет 7000-9000 ед/г.

Выделение рестриктазы BspDI.

5 г биомассы Bacillus sphaericus BKM В-752 суспендируют в буферном растворе ч клетки разрушают ультразвуком при 2 - 4°С. После удаления остатков клеточных оболочек и неразрушенных клеток с помощью ультрацентрифугирования к бесклеточному экстракту добавляют полиэтиленимин до конечной концентрации 1%. раствор осветляют центрифугированием и ведут последовательно хроматографию на

ДЭАЭ-целлюлозе, голубой сефарозе и фос- фоцеллюлозе.

Получают 10000 ед активности фермента в 10 мл глицеринового буфера Выход счищенного препарата рестриктазы 2000 ед

на 1 г сырого веса биомассы. Препарат рестриктазы BspDI стабильно сохраняет активность в течение не менее 3-5 мес при хранении при -20°С. Фермент не содержит примесей фосфатаз. эк зону к лезя и неспециических эндонуклеяз, пригоден для картиования ДНК и всех видов генно-инжечер- ных работ,

Пример 2. Культивирование штамма Bacillus sphaericus ВКМ В-752 проводят аналогично примеру 1, но в качествае питательной среды используют среду LB, содержащую в 1 л 10 г триптона, 5,0 г дрожжевого экстракта, 10,0 г NaCI и до 1 л воды.

Выход биомассы 2,5 - 3,5 г/л культу- ральн ой жидкости. После проведения очистки фермента по примеру 1 выход рестриктэзы BspDI составляет 1600ед/гби- омассы.

Таким образом, по предлагаемому способу получают новую рестрмктэзу BspDl.

Биомасса штамма Bacillus sphaericus ВКМ В-752 содержит новую эндонуклеазу рестрикции BspDI. узнающую и расщепляющую нуклеотидную последовательность ДНК 5... GATC ... Уя количествах, доста- тоиных для получения рестриктазы в пре- парати зных масштабах: содержание рестриктазы BspDI в биомассе 7000 - 9000 ед на 1 г.

Выход очищенной рестриктазы Sau3Al, изошизомера , 500 ед на 1 г биомассы.

Для рестриктг :зы BspDI выход очищенного фермента составляет 1600 - 2000 ед. активности на 1 г сырой биомассы, ито е 3 - 4 раза превышает известные цифры дгя

ЗаиЗА (500 ед).

Рестрикт.чза BspDI из B.sphaerlcus ВКМ В-752 представляет интерес, для молекуляр- но-генетических исследований в плане ее использования для изучения процессов в

метилирования ДНК. Эот связано с особенностями расщепления сайта узнавания 5.., GATC ,.. ЗЪтим ферментом и его изошизоме- рзми.МЬо и Dpnll в зависимости от метилированного основания (аденин или цитозин)

в участке узнавания.

Формула изобретения Способ получения рестриктазы BspDI, предусматривающий культивирование продуцирующего микроорганизма на питательной среде, содержащей источники углерода, азотз и минеральные соли в условиях аэрации, разоушение клеток и выделение фермента из бесклеточного экстракта и хроматографическую очистку, отличающ и и с я тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, в качестве продуцирующего микроорганизма используется Bedims sphsericus ВКМ В-752.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в молеку- лярно-генетических работах. Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта. Изобретение заключается в том, что в качестве продуцента рестриктазы используют B.Sphaericus ВКМ В- 752, который выращивают на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, в условиях аэрации, целевой продукт выделяют из полученной биомассы известными методами. Биомасса B.sphaerlcus ВКМ В-752 (DI) содержит новую эндонуклеазу рестрикции BspDI, узнающую и расшепляющую последовательность ДНК 5 ... GATC ... З в количествах, достаточных для получения рестркактазы в препаративных масштабах. Для изошизомера BspDI-рестриктазы Sau 3AI выход очищенного фермента 500 ед на 1 г сырого веса биомассы. Выход очищенного препарата рестриктазы Bsp D составляет 1600 - 2000 ед. активности на 1 г сырой биомассы, что в 3 - 4 раза превышает указанные цифры для рестриктазы Sau 3AI. (Л