Штамм бактерий BacILLUS coaGULaNS - продуцент рестриктазы Всо AI Советский патент 1992 года по МПК C12N9/16 C12N1/20 

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в молекулярно-генетических и генноинже- нерных работах.

Сайт-специфические эндонуклеазы (синонимы: рестриктазы II класса, эндонуклеазы рестрикции) нашли широкое применение в качестве уникального инструмента исследования в молекулярном клонировании, структурных исследованиях ДНК, разработке подходов к диагностике наследственных заболеваний у человека, являются удобной моделью для изучения механизмов ДНК- белковых взаимодействий.

К настоящему времени обнаружено и охарактеризовано более 1300 рестриктаз, одна из которых PmaCl выделена из Pseudomonas maltophila CB50P /1/. Фермент гидролизует ДНК фага Я в 3 участках, аденовируса Ad2 в 10 и не расщепляет ДНК обезьяннего вируса SV40, ДНК и плазмиду pBR322 /2/.

Содержание рестриктазы PmaCl в биомассе не указано, а выход очищенного препарата фермента составляет около 20 ед активности на 1 г биомассы.

Целью изобретения является получение штамма бактерий, продуцирующего новую

VI (

СО

о

рестриктазу BcoAl со специфичностью 5 ... С-А-С G-T-G ... 3 с высоким выходом фермента.

Поставленная задача достигается тем, что биомассу B.coagulans BKM В-732 выращивают при аэрации в питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, до поздней логарифмической фазы роста, целевой продукт выделяют из полученной биомассы известными методами.

Рестриктаза BcoAl - изошизомер PmaCI, узнает и расщепляет участок нукле- отидной последовательности ДНК 5 ... С-А- С G-T-G ... З1. Фермент гидролизует ДНК фага А по 3 участкам, ДНК аденовируса Ad2 по 10 и не имеет сайтов узнавания на ДНК обезьяннего вируса SV40, ДНК фага0 Х174 и плазмиде pBR322.

Поиск штамма продуцента проводили с использованием толуольного экспресс-метода тестирования рестриктазной активности в клетках микроорганизмов с последующим электрофоретическим разделением продуктов гидролиза ДНК в геле агарозы. Всего обследовано 48 штаммов, относящихся к родам Bacillus.

Штамм B.coagulans BKM В-732 получен из Всесоюзной Коллекции Микроорганизмов АН СССР, где хранится под № ВКМ В-732 «-ССМ 3557.

Характеристика штамма.

Морфологические особенности. Клетки палочковидные, прямые или почти прямые, подвижны, образуют споры. Грамположи- тельные.

Культурально-биохимические свойства. На скошенном агаре рост по штриху обильный. На чашках Петри с мясо-пептонным агаром колонии крупные, матовые. На мясо- пептонном бульоне и бульоне Хсттингера равномерное помутнение, осадок.

отношение к кислороду - строгий аэроб.

Каталаза +,

Индол -,

На глюкозе - кислота +, газ -,

Желатина уколом - разжижение.

Оптимальные условия выращивания и хранения культуры.

Культура Bacillus coagulans BKM В-732 хорошо растет на твердых и жидких полноценных питательных средах: мясо-пептон- ном бульоне, среде LB, бульоне Хоттингера.

Оптимальные значения температуры и рН роста культуры находятся при 37° С и рН 7,2-7,4.

Наибольший выход биомассы, содержащей рестриктазу BcoAl, достигается при вы- ращивании штамма-продуцента в

ферментере при 37° С в аэробных условиях на питательной среде Хоттингера, которая содержит в 1 л: 250 мл основного перевара Хоттингера; 5 г NaCI; 1 г К2НР04 и до 1 л

воды. Выращивание прекращают в конце логарифмической фазы роста, когда рост достигает ,5-1,7. Выход биомассы 7-8 г/л.

На рыбной среде культура растет плохо

(при 18-часовой ферментации на качалке ,3).

Ферментацию культуры проводят после добавления в ферментер инокулята в соотношении 1:10 к объему среды.

Рабочие культуры пересевают на мясопептонный бульон или среду Хоттингера один раз в 8-10 дней.

Хранят культуру в полужидком мясо- пептонном агаре под вазелиновым маслом

или в лиофилизированном виде в ампулах.

Выделение рестриктазы BcoAl проводят фракционированием бесклеточных экстрактов двухфазной системе полиэтиленгли- коль/декстран и хроматографией на колонках

с ионообменниками.

Инкубационная смесь для определения активности рестриктазы BcoAl объемом 30- 50 мкл содержит: 0,01 М трис-HCI буфер, рН 7,5, 0,01 М MgCl2, 0,1 М NaCI, 0001 М дитиотреитола, 100 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина, 1 мкг ДНК фага А и 0,2-2 мкл фермента, Инкубацию проводят при 37° С в течение 60 мин. Продукты расщепления ДНК фага А анализируют электрофоретически в 0,8-1 % агарозном геле с последующим прокрашиванием геля в бромистом этидии. За единицу активности рестриктазы BcoAl принимают количество фермента (в мкл), которое за 1 ч инкубации полностью

гидролизует 1 мкг ДНК фага А при оптимальных условиях реакции.

Пример Культуру B.coagulans BKM В-732 предварительно адаптируют в течение ночи при 37° С в условиях аэрации на

основной питательной среде, содержащей в 1 л: 250 мл основного перевара Хоттингера: 5 г NaCI; 1 г К2НР04; до 1 л НаО. Инокулят для посева в ферментер готовят, пересевая адаптированную культуру на 1 л свежей среды из расчета 1:10 и размножают в условиях аэрации.

Ферментацию культуры проводят после добавления в среду инокулята в соотношении 1:10 к объему среды в условиях аэрации

при температуре 37° С; рН среды 7,2-7,4.

Во время выращивания рН культураль- ной жидкости поддерживают в пределах 7,0-7,6.

Выращивание продолжают до достижения конца логарифмической фазы роста.

Выход сырой биомассы составляет 7-8 г/л культуральной жидкости.

Содержание рестриктазы ВсоА в биомассе составляет 6000-8000 ед/г микробной массы.

Выделение рестриктазы ВсоА

10 г биомассы B.coagulans BKM В-732 суспендируют в буферном растворе, клетки разрушают ультразвуком при температуре + 2-4° С и клеточную суспензию центрифугируют в течение 60 минут при 105 000 д. Осадок, содержащий клеточные оболочки и неразрушенные клетки, отбрасывают, а присутствующий в супернатанте фермент фракционируют в двухфазной системе полиэтиленгли- коль/декстран. Обогащенную по рестриктазе ВсоА верхнюю фазу хроматографируют в ка- лцй-фосфатном буфере в градиенте концентрации KCI на колонках с ДЭАЭ-сефарозой CL-6B и с фосфоцеллюлозой РП.

Получают 12000 ед. активности фермента в 2 мл буфера с 50% глицерином. Выхрд очищенного препарата рестриктазы ВсоА составляет 1200 ед на 1 г сырого веса биомассы. Препарат фермента стабильно сохраняет активность в течение 9-12 месяцев при хранении при -20° С.

Фермент не содержит примесей фосфа- таз, экзонуклеаз и неспецифических эндо- нуклеаз и пригоден для молекулярного клонирования и изучения структуры ДНК.

П р и м е р 2. Культивирование штамма B.coagulans BKM В-732 проводят аналогично описанному в примере 1, за исключением того, что в качестве питательной среды используют среду LB, которая содержит в 1

л: 10 гтриптона; 10 г дрожжевого экстракта; 10 г NaCI; до 1 л воды.

Выход биомассы 5-6 г/л культуральной жидкости.

После проведения очистки фермента, как

описано выше, выход рестриктазы ВсоА составляет 700-900 ед. активности/г сырого веса биомассы.

Таким образом, по предлагаемому спо- собу получают новую эндонуклеазу рестрикции BcoAI.

Биомасса штамма B.coagulans BKM B-732 содержит новую сайт-специфическую эндонуклеазу BcoAI, узнающую и расщепляющую нуклеотидную последовательность ДНК 5 ... С-А-С G-T-G ... 3 в количествах, достаточных для получения рестриктазы в препаративных масштабах: содержание рестриктазы BcoAI в биомассе 6000-8000 ед/г.

Выход очищенной рестриктазы PmaCI,

изошизомера BcoAI, 20 ед/г микробной массы.

Для рестриктззы ВсоА выход очищенного фермента составляет 700-1200 ед ак- тавности на 1 г сырой биомассы, что в 35-60 раз превышает указанные цифры для рестриктазы PmaCi (50 ед).

Эндонуклеаза рестрикции ВсоА не содержит примесей фосфзтаз и неспецифиче- ских нуклеаз.

Учитывая особенности строения участка узнавания рестриктазы BcoAI и его локализации на векторных молекулах ДНК, новый фермент может быть использован в молекулярно-генетических и биотехнологических работах.

ф ормула изобретения Штамм бактерий Bacillus coagulans BKM B-732 - продуцент рестриктазы Всо AI.

Использование: биотехнология и в практике молекулярно-генетических и генноин- женерных работ. Сущность изобретения: продуцент B.coagulans ВКМ В-732 выращивают при аэрации в питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, до поздней логарифмической фазы роста, целевой продукт выделяют из полученной биомассы известными методами . Биомасса B.coagulans ВКМ В-732 содержит новую сайт-специфическую эндонуклеазу BcoAl, узнающую и расщепляющую последовательность ДН К 5 С-А-С G-T-G 3, в количествах, достаточных для получения рестриктазы в препаративных количествах, содержание рестриктазы BcoAl в биомассе 6000-8000 ед/г сырой биомассы. Для изошизомера BcoAl, рестриктазы PmaCl, выход очищенного фермента 20 ед на 1 г сырого веса биомассы. Выход очищенного препарата эндонуклеазы рестрикции BcoAl составляет 700-1 200 ед. активности на 1 г сырой биомассы, что в 35-60 раз превышает известные цифры для рестриктазы PmaCl. Эндонуклеаза рестрикции BcoAl не содержит примесей фосфатаз, экзонуклеаз и неспецифических эндонукле- аз. oW Ё