Изобретение относится к биологической химии, в частности к методам определения nmiotf протеидлипазной активности в жировой ткани и другом биологическом материале, и может быть использовано в лабораторной практике при изучении липидного обмена.
В настоящее время получили широкое распространение ряд методов определения активности липопротеидлипазы (ЛПЛ) с использованием в качестве субстрата фирменных образцов эмульсии масел, таких как эдиол и интралипид. Все они основаны на количественном определении прироста жирных кислот, отщепившихся от субстрата под действием ЛПЛ, путем титрования или колориметрирования. Наиболее удобным при этом является метод непрерывного титрирования с использованием рН-стата, снабженного автоматической микробюреткой и самописцем. Учитывая то, что дорогостоящие коммерческие приборы исключают возможность его ишрокого применения, в практике чаще всего используют какой-либо из обычных Методой титрования Ц.
Этот метод не всегда является точным, так как при этом трудно уловить конец титрования.
1. Наиболее близким к предлагаемому является способ определения активности ЛПЛ, использованный в анализах жировой ткани птицы. Способ основан на анализе комплексных соеди нений свободных жирных кислот с медью после экстракции их органическими растворителями и предусматривающий определение количества жирных кислот в имкубате колориметрическим методом. Схема этого способа включает притх)товление ацетоновых порошков из жирной ткани, гомогенизацию их в 0,025 и. NHj, инкубацию в течение 60 мин при 37° С 1 Mrt суспензии ацетонового порощка в инкубационной среде, содержащей трыс-буфер (1,35 М, рН 8,1), 1,5 мл 15%-ного бычьего альбумина 5-й фракции в 0,15 М NaCI, 0,2 мл субстрата (интралипида), активированного свежей сы-. вороткой крови, и 0,3 мл 0,15 М NaCI, экстрагирование, окраишвание и колоримет| фова нне 2.
Недостатками этого способа являются тру доемкость и дополнительный расход кимреак-тивов, обусловленные необходимостью приготовления ацетоновых порошков исследуемых тканей, а также частичная потеря активности фермента при проведешга этой операции и большая продолжительность (60 мин) тисубации ферментного препарата с Субстратом. В качестве последнего используется жирвоая эмульсия интралшшд (Vltrum, Стокгольм, Швеция).
Целью изобретения является упрощение способа и снижение потерь фермента.
Цель достигается тем, что согласно способу определения активности ЛШ1, включающему
инкубирование ис(;ледуемого материала с субстратом и акцептором жирных кислот, экстрагирование, окрашивание продуктов реакции и колориметрование, инкубирование проводят к В течение 15-20 мин с использованием в качестве субстрата активированной жировой эмульсии липофундина.
В качестве исследуемого материала берут 0,75-0,80 мл гомогената свежей жировой ткани в разведении 1:5, а в качестве субстрата используют 0,25-0,30 мл 2%-ного раствора активированной жировой эмульсии липофундина.
Пример. Принцип способа, как и в прототипе, состоит в определении прироста ,j жирных кислот, отщепившихся от субстрата в ходе инкубации под действием фермента - ЛПЛ, колориметрическим методом.
Общая схема способа сводится к следующему. К 0,25 - 0,30 мл активированной змуль.. сии липофундина .прибавляют 0,25 мл
0,1 М CaCl2 и.0,75-0,80 мл гомогената свежей жировой ткани (в разведении 1:5) и инкубируют при непрерывном встряхивании в течение 15-20 мин, после чего к смеси добавляют ,- 6 мл хлороформа и 2 мл смеси медного реагента. Интенсивно встряхивают, центрифугируют и колориметрируют против контроля при длине волны 440 нм.
Способ характеризуется тем, что в инкубационную среду вносят гомогенат свежей жиро0 вой ткани без приготовления ацетоновых порошков, в качестве субстрата используется жировая эмульсия липофундина, инкубацию проводят в течение 15-20 мин при .
I
5 Способ определения активности ЛПЛ осущеЬтвляется следующим образом.
Жировую ткань тотчас после убоя животного замораживают в морозительной камере. Продолжительное (более 4-5 дней) хранение в
0 замороженном виде не рекомендуется ввиду снижения активности фермента. В день проведения анализа 1 г жировой ткани гомогенизируют на холоде с 4 мл охлажденного до 2 4-С 0,05 М трмс-буфара, рН 83 в стеклян5 ном гомогенизаторе. В инкубационные пробирки, снабженные шлифами, вносят 0,25 мл жировой эмульсии липофундина, предварительно активированной путем инкубации ее в течение 30 мин со свежей сывороткой крови в соотно0 шении 1:9 при 37° С и непрерывном встряхивании, добавляют 0,25 мл.0,1 М pacTBOja CaCI, 0,75 мл гомогената жировой ткани (в раэведент 1:5) и инкубируют 15 мин в водяной бане при 37° С и непрерывном встряхивании (80 даижений/Мин). В конце Инкубации для экстрагирования жирных кислот в инкубационную смесь добавляют 6 мл хлороформа и 2 мл реагента, состоящего из 10 ч. 53%-ного шгграта меди, 9 ч. 1 М триэтаноламина н 1 ч. 1 и.
уксусной кислоты. Интенсивно (240 движешга/мин) встряхивают на механическом встряхивателе в течение 30 мин, затем центрифугирукп 30 мин при 1000 q/мин. Верхнюю фазу, окрашенную в синий цвет, отсасывают 1шпеткой с помощью насоса, а 4 мл нижней фазы, содержащей высвобожденные в ходе реакщга. жирные кислоты, переносят в обыкновенные стеклянные пробирки. Туда же добавляют 0 мл 0,1%-ного раствора {щэтилдитиокарбомата. Интенсивность окраски реакционной смеси определяют на электрофотоколориметре в кювете 1 см при длине волны 440 нм про тив контрольной пробы. Контрольная проба содержит все те же компоненты, что и опытная, только инкубацию субстрата проводят без ферментного препарата, а ферментный препарат (гемогенат свежей жировой ткани) вносят в инкубационную среду после добавления хлороформа и медного реагента. Количество жирных кислот образовавшихся в- результате ферментативного расщепления субстрата, определяют по стандартной калибровочной кривой. Построение калибровочной кривой осуществляется следующим образом : к I мл раствора пальмитиновой кислоты, содержащего в этом объеме 0,1-1,0 мкм пальмитиновой кислоты, прибавляют 6,0 мл хлороформа, 1,25 мл воды и 2 мл медаого реагента и далее все операции проводят описанным способом. Активность ЛПЛ выражают в мкмолях жирных кислот минД сырой жировой ткани.
Прелагаемый способ апробирован в лаборатории онтогенеза ВНИИФБиП сельскохозяйствен-, ных животных.
В таблице приведена сравнительная зффек-, тивность предлагаемого способа определения активности ЛПЛ в свежей жировой ткани поросят до отнощению к прототипу.
1. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ЛИПОПРОТЕИДЛИПАЗЫ. включанлций инкубирование исследуемого материала с суб. страхом и акцептором жиртых кислот, экстрагирование, окрашивание продуктов реакции и колориметрирование, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа и снижения потерь фермента, инкуби;х)вание проводят в течение 15-20 мин с исполъзовашем в качестве субстрата активированной жировой эмульсии липофундана. . : 2. Способ по п, 1, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что в качестве исследуемого материала берут 0,75-0,80 мл гомогената свежей жировой ткани в разведении 1:5, а в качестве субстрата используют 0,25т-0,30 мл 2%-ного раствора активированной Жировой эмульсия липофундина.
