Способ определения активности моноаминоксидаз в биологическом материале Советский патент 1980 года по МПК G01N21/24 

Изобретение OTHOcifrcH к биологическим (биохимическим) методам исспедобания и предназначено дпя определения активности ферментов моноаминоксидаз (МАО) в биологическом материале с использованием .в качестве субстратов индольных биогенр.1Х аминов.. Известен способ определения активности моноаминоксидаз в биологическом материале путем обработки тирамина в слабоосновной среде инкубации избытком се- микарбазида в присутствии моноаминокси- дазы с последующей обработкой полученной смеси раствором трихлоруксусной кис лоты, избытком 2,4-динитрофенилгидразина,экстракцией образовавшегося 2,4динитрофенилгидразона бензолом, обработкой щелочью бензольного экстракта и спектрофотометрированием полученного соединения ij. Недостатком известного способа является его недостаточно высокая чувствительность. Цель изобретения - повыщение точности способа. Указанная цель достигается тем, что серотонин или триптамин, используемые в качестве амина, обрабатывают в слабоосновной среде инкубации избытком семйкарбазида в присутствии моноамино- ксйдазы с .последующей обработкой полученной смеси раствором трихлоруксусной кислоты, избытком 2,4-диш1ТрофенилГИдразина и измерением оптической плотности полученного раствора. Из серотонина (или триптамина) в среде инкубации, содержащей фосфатный буфер с рН 7,4 и избыток семйкарб азида, в при-, сутствии МАО получает. 5-оке ни идо ли лацетальдегид (или индолилацетальдегид) п / rnr V 2- «2HOИ VVА ЛО-о.и .-ИЧН,;Ш,0, который, взаимодействуя с семикарбазидом, дрет семнкарбазон (что предохраняет альдегид от дальнейшего окисления) zN- -C-NH И О f «l-C-N-C-NH., ° tH,0 Пссле удаления блоков с помощью трихлоруксусной кислоты в пробу вносится избыток 2,4-динитрофенш1Гидразина, которьтй взаимодействует с семикарбазином, образуя гидрофобный гидразон , «4-9- -V КИ - Н„1Ч-1 1-С-МЦ., Н. о Гидрофобный гидразон 5-оксииндопилацетальдегида уже через несколько минут об разует мелкодисперсную суспензию, концентрация которой, а вместе с этим светопоглсхцение и светорассеяние, постепенно возрастает, достигая максимального ус тойчивого значения в течение 20-30 мин Интенсивность светопоглсчцения (или светорассеяния) мутного раствора определяю турбидиметрически (или нефелометрически используя любой доступный йолориметр (нефелометр), микрокалорнметр, ФЭК или спектрофотометр. Разница кежду экстинкцией опытной и контрольной (инкубация проводится в от., сутствие субстрата биогенногй аштнй или в отсутствие источника фермента) проб с жит мерой активности фермента в условны единицах после пересчета на 1 г свежей ткани или 1 мг белка за 1 ч .инкубации. Для пересчета активности МАО из условных в абсолютные единицы более доотупным является построение калибровочно го графика с определением образующегося инкубационной среде под действием МАО аммиака, так как получение весьма нестабильных альдегидов биогенных аминов и последующая работа с ними весьма затруднитепьна.: Инкубационная смесь состоит из ком- ; понентов, мл: раствор фосфатного буфера с рН 7,4; 1,0 0,1 М; нейтрализованный : раствор семикарбазида солянок ислого 0,2 0,5%-ного; нейтрализованный раствор серотонин-креатининсульфата 0,25 1%-ного (6,25 мкмоль); (или раствор триптамина солянокислого; 0,25 0,2%-ного 2,5 мкмоль;); источник фермента (10%ные гомогенаты тканей, субклеточное фракции и др. 0,2-0,5). После 1 ч инкубации прш 37 С в пробы добавляют по 1,0 мл 1О%-ного раствора трихлоруксусной кислоты, после чего их центрифугируют. В контрольные пробы после трихлоруксусной кислоты добавляют субстрат. К прозрачному безбелковому центрифутату добавляют по 0,2 мл О,1%г-н го розтвора 2,4-динитрофенилгидразина, , приготовленного на 2н. растворе соляной кислоты, и, образовавшаяся Суспензия гидразона индолилацет альдегида, через 2О-ЗОмин турбодиметрируется (на спектрофотометре или фотоэлектроколориметре с зеленым фильтром) или нефелометриру«тся. При измерении на ФЭК-М экстинкция опытных проб, содержащих в качестве источника МАО 10-25 мг свежей ткани мозга или мг белка, превышает экстинкцию контрольных проб, инкубируемых без субстрата, в 20-30 раз, что позволяет надежно работать уже с малыми активностями фермента и неочищенными препаратами (источниками) МАО. Прирост продукта ерментативной реакции и величины экстинкции в пробах прямо пропорциональjn,, продолжительности инкубации (от 15 мин до 2 ч) и количеству источника .фермента МАО в инкубационной среде (1-100 мг ткани). Митохондриальная фракция из ткани мозга и печени обладает максиквльной удельной активностью МАО. Метод высокоспецифичен для определения МАО, так как при введений в организмили добавлении в инкубационную среду больших доз ингибиторов МАО активность фермента полностью угнетается. Точность .метода ± 3% (из 5 параллельных определений). Чувствительность метода достаточно высокая для того, чтобы измерить активность МАО с. небольшими количествами различных тканей. 1 мкмояь продукта реакции, образующегося из серотонина, дает 0,5 единиц и ил триптами- 57 на 0,55 единиц прироста эксти1жщга в у ловиях предлагаемого метода (фЭК-М, проба объемом 2,5. мл- кювета с толщиной слоя раствора 0,5 см). Малярный коэффициент экстинкиии { гидраэона в суспензии равен 2000 МСМ для серотонина и 2200 трйптамина. Выход конечного продукта в форме гидраэона альдегида, обрв« зующего суспензию, составляет 55% для серотонина и 60% для трипгами1на от всего количества эквиваленtOB образукяцегося в инкубационной среде в ходе ферментаггивной реакции альдегида (или аммиака). В табл. 1 представлена активность МАО с субстраггом серотонином в мозге крыс после введения различных доз транс амина. В табл. 2 представлена активность МАО с субстратом триптамяном в мозге крыс после введения транс амина.

11 73938112

формула изобретениячто, с цепью повышения чувствительносСпособ определения активности моно-ти способа, в качестве амина используют

аминоксидаз в биологическом материалесеротонин или трйптамин. путем обработки амина в слабоосновной

среде инкубации избытком семикарбазида Источники информации, в присутствии моноаминокеидазы с после-прин$ггые во внимание при экспер изе дующей обработкой полученной смеси раствором трихлоруксусной кислоты, избыт-i.Gfeen A-U.and Hauffiiton Т lA-Aco ком 2,4 яинитрЬф1енипгидразина и изме-toHrnetv-f6 method lorestimition о рением оптической плотности полученного Q monoowne oMdase.Biocliewicat Jour раствора, о т л и ч а ю щи и с я тем,,Па&,19б1 Л&.l,.(пpoтoтип).