Способ получения рекомбинантной ДНК,содержащей ген,кодирующий амилазу Советский патент 1986 года по МПК C12N15/00 C12N15/00 C12R1/07 C12R1/85 C12R1/85 C12R1/11 C12R1/22 

Изобретение относите;-: к био- х- ,,л1 гл-м: :;: .п ;

НОЛОГИИ-, а именно к производству- .- - f-ii /na;-ин ;;iopi-i;:a н; тт i

рекомбинантных ДНК. содержащих ген,,-ч .нля veMii.pHTv:::;

кодирующий амилазу., :;,н i: - л;,.я:-ьп; i; --Kiirp-- i

Пример 1 . КлонирОЕЯНИГ г pir,- гг; i , :и: :ГЧя/1 ,млк ;

альфа-амит азу. сг. ч : S-vn V; с л т - е-лн - г г.

Для клонирования г ена применяю- -а - - - лоОгл-й к;м:ч ..-,,:

следующие материаль ; ограничивающаяMI-KPOO:;;: а; и:-гч i-7 ,П1 и Ъии

эндонуклеаза Hind 111; ДИК лигазаJv::-.iTl: :s rnt gat аг lum на зсл,

фага ТА; Фаг л NM 590, ДНК ксторог ;.„ л-;;;; -н; Пиоло -г чес.их -ри-.нлк,

получена экстракцией фенолом ка очи----той г-гл R rs:r:v ; М;;плаТ ni :

щенньп частиц; фага; плазмида pBR 322,,If,: BacLerilogy 3 cdi Liori)

ДНК которой получена из клеток Е. со- i- inav ,. N, F, , Г1 i n ldus , п-

ti обработанных лизоиимом в грапиап- :Чм- к i;-.: ;,ч Ъ

те плотности хлорида цезия - бромида, .: к:,иъ Согтоагэтидия; микроорганизм - хозяин Е. со-гпт лх.орг

li HBIO;; микроорганизг- донор бак- luc l- ..

терки BaciJIus magaterium со c,ne;;yio- :ii -eiM-ai морфологическими признаками:с гп, РО ВС

морфологиуп палочки (О „З-О 7x2 ,,0--;,(, A -;rd-::;:r л

5.0 мк) S подвижные 5 сопоры термикаль- :- ; ,

ные и субтерминальные 51-а К л;би;1

жидках питательная среда: ,;. oafi и Ва

короший;Окспг: .

твердая питательная среда; рост-: ia v ; .щ- p;icy;

:н;ороший, колонии плотные погредиие з -гечеяие -- а об ьср-к- v

и более расп-льгачатые вокруг;г., -буферного .;астг.ора лои р

молоко: пептонизирует бея измене-(л ,(-i 2 мкс ,1ям }да Ь VJO па лп

лИЯ рИ ;:i ;;,S.-;-r4-r:;Hbn обпНЗОл ТПМ ЖО ОС

желатин; не разжижает;„, r:)v- акции остаяов,г105ть; av-r-e

зосстанс)пление Т1итратов: оч рхца--i . -; ,, тс.чечие 1П ,-и-л1 ггри V-/

ге,лън:ая реакция; ; ;;:,с, ью оире/гелат- и,;

катализиая реакиир отркцате,лъ--; . сгтлплсния прогедепы два и;лл

oyfCvijva3na,K реакдкя: отрит-ате.ть--: -,.ircp: jai : -jeKcpoaopcay в гсил

ая;-- ь - е-:;-гие 10 ч при напря;

дитохрококсидная реакии:; ; отркц,;- С ::. Несло лкг-г .;-язсн) :

тельная;:л,,--.-г-п.,: Hc,rKia;cj,n лаидсеаую :

продуиирование индола: отрида ;;,пл-. г.лс i:j,iuu м НИК ,лямбда.

пая;-,:;, i--a;i3 н лс ;у,пы а гс застеллеа;

образова1-гке серонодооодг ; OTini-ia- a,ca:jHO; , v-iacTKo ;iiac Гл и. л1

,гель, . :-i -/асч-г; лл 1ыпси И Л -:- -и

лотреблегше уллеводов: лотребл/имлл- п гл-л- ск Э,/;-;.,-;; ;;рл;л-: пилл ;с

арабипоггу. кси,лозу5 га-лактозу, чдцо--- лгчо ТНК,, ; аст,л-л icKaobi цл л,;

козу, левулезу 3 мал- ътозуэ афино; :у,: --х ллт ,-гаи /час г:св

сахарозу, крахмал и кислоть;. пол ла -Л :Ь:-лл 1ия ИК ,г,-;;га лл)(; л fBHt-Die из них. гакнозу; ма-п- озу - Р-г чецлс-кт ; - -uljir-;,-«лг; ллл гл- :

мелибиояу, инулиь; и сйллнгп ;-ге ил , Ь, ,-: п: л , л:1(л,- л л лли-: ллл/

ребляет;. - Л . ,. С Л:,Л; л Л Л, :: Л , ь- ;:Л -Л потребление многоато --1г1ьл; cnaaixifi; Н- ja,-.:.

потребляет сорбитол и манкитол - :Л, лс ::1л;,лс:- ;л,1г (, - ;-1Л л

потребляет аденито,л,, гг с гьци ал ;, лмл1 ,,-Си:лл:ал; и , -; :1Л1зитол;-, : е,:,г L,;-a ,,ЧМ ли; слл,, к - лдекарбоксилазная реакция аа ,л--,, . ,:л л.;, ,., л л л: --л;-,и:1;ио. а:аач

;;ин: отрица гельная; :лллъ; и копал(

уреолиз . слабый;- лл Л1мт(алт / лт;аг ггал-л н ГК-;.

сопротиЕляемоеть дейсть -nfi гяка,лъ1Х: о г лгала a-it-i raa Caa:-:-; . НН

комплемсич арио ;1ефск1Ч1НИ,1х лияатон фага (лямбда Оагл и лямбла Earn), индуцированных из не подаили- ющих и тампоп. В чтой смеси любая молекула ДНК, Р1моюп;ая края cos ЛИК лямбда н соответствующие размеры, может быть введена в протеки фага, таким образом воссоздавая in vitro биологически актирную частицу фаг а, способную инфинировать Е. coFi и продуп,ировать дентр инфекции (пятно) .

Чтобы оценить эффективность этого способа, были выполнснь два контрольных опыта.

Образец смеси бып посеян на Е. coEi, было найдено 3x10 пятен иа I мкг введенцой ЛИК лямбда. Это приблизительно в 100 раз больше, чем найдено в расщепленном препарате, и указывает на большую эффективность обработки лигазой.

Полученные таким образом пятна были исследованы визуально. Из них 70% были прозрачные, а не мутные, что указывает на присутствие фрагмента ДНК Bacilfus megaterium, который стыкует и, следовательно, инактиви- рует лямбда ген СР, отвечающий за помутнение пятна.

Таким образом, можно оценить, что препарат содержал случайно выбранный образец всех возможных фрагментов BaciJTus megaterium Hind Ш ДНК, совместимых с введением в фаг лямбда Ш 590.

Отделение деривата фага лямбда, несущего амилазу Bacilfus megateri- .um.

Остаток инкапсидированной смеси был применен для заражения Е. coEi на большом количестве крахмалсодер- жащих посевов приблизительно 10 жизнеспособнь1х частиц на посев. После роста зара-жениых Е. со Pi и образования пятен посевы были отсортированы на присутствие пятен разложения крахмала. Это было сделано путем кратковременного действия на посевы парами иода; гтредполагали, что пятно, образованное таким фагом, будет окружено прозрачной зоной, образующейся в результате диффузии и действия амилазы из лизованных клеток. Одно такое пятно было найдено и фаг, содержащий это пятно, немедленно был отобран для субкультивирования (длителт.ное лействие паров иода убило бы фа1 ) . Потомство этого пятна

1Я з -1нож ;тось в ч;1СТ(-1те (продуцщтуя ами:1азу) и обозначено лямбда NN 590 Amy 1. Фаг лямбда №1 590 Amy I сдан на хранение в Национальную коллекцию 5 промьпиленных бактерий I 2 фев11аля 1980 г., как NC1B № 11569.

Повторное клонирование гена амилазы в плазмиду pBR 322.

Это было сделано с целью щтамма 0 сверхпродуцента, а также с целью получения большого количества ДНК с геном амилазы.

1 мкг ДНК из лямбда NM 590 Amy 1 и 0, плазмиды pBR 322 расщепи- 5 ли, смеп1али и обработали лигазой, как описано Bbmie. Этот препарат применили для трансформации (по обычной методике) щтамма НВ 101, Отбор производили по сопротивляемости ампицил- 0 .пину (ар) - свойству, которое сообщается клеткам в присутствии этой плазмиды. Обычно эта плазмида сообщает также сопротивляемость к тетра- г иклину (Тс) . Однако введение посто- 5 ронней ДНК в эту плазмиду расщепляется tet ген, таким образом содер- чувствительных к тетрациклину трансформированных клонов отражает содержание содержащих плазмиды клони- д рованных ДНК. В данном случае 16% клонов содержали новзло плазмиду, которая придавала амилазе активность к Е. coli (в соответствии с современной международной номенклатурой плазмид новые плаэмиды, описываемые в изобретении, называются (рСР), а конкретная плазмида согласно настоя- шему примеру обозначена (рСР 1).

Это показывает, что повторное клоч- нирование гена тем же самым ферментом (в данном Hind ИГ) является очень эффективным способом (16% вместо 1:10).

Штамм, содержащий плазмиду, обозначен Е. со Pi CL 7001 (рСР 1) и сдан на хранение в Национальную коллекцию промьшшенных бактерий (NC1B) 12 февраля 1980 г. как NC1B № 11570. Амплификация и продуцирование фермента . 0

Продуцирование фермента в содержащих плазмиду (рСР 1) клетках улуч- шено двумя способами.

Насьщ1енные культуры.

Культуры инкубированы в течение ночи при на вращающемся вибраторе в пятилитровьгх колбах Эрленмей- ера, содержащих 1 л культуральной

5

0

5

С1)рды (LB; дрожжевой экстракт - триптон).

Хлорамфеникольная амплификация. Культуры инкубированы лри 37 С на вращающемся вибраторе в пятилит- ровьгх колбах Эpлe iмeйepa, содержащи л культуральной среды (LB) , до до стижения плотности 0,8 (650 нм), после чего добавили 150 мкг/мл хлор амфеникола. Это предотвратило дальнейшую репликацию хромосомпой ДИК, цо не реплика-дию содержащей ген амилазы плаямиды (рСР 1). После амплификации (до 3000 копий) плазмиды по сравнению с хромосомной ДНК хлорам- феникол был удален, чтобы мог продолжаться синтез протеина. После амплификации клетки были отделены от среды методом це«трифугирования, промъгты для удаления хлорамфенико- ла и повторно культивированы длк продуцирования амилазы.

Выделение фермента.

Для выделения альфа-амилазы в очень чистой форме применяли метод осмотического шока. Способ, описанный X. С, Ней и Л, А, Хеппель в J. Bio. Chem 240, 36S5-3692 (1965) заключается в следующем.

Сначала клетки культивировали в течение ,, после чего их суспендировали в 25%-ном рас г-воре сахарозы в 0,5 объема культуры и подв1;рг- ли вибрации в течение 10 мин при 24 С-, в результате такой обработк;-, произошел плазмотшз клеток. Затем добавили ЭДТА к 1 :-4м конечного :jacT вора (чтобы стенки клеток стали проницаемыми) и материал подвергли вибрации в течение 10 мин при 2А С. Суспензию центрифугировали и клетки быстро повторно суспендировали в холодной (приблизительно ) П :)де и подвергли пибраци;- при этой же температуре еще 10 мин. Суспензию снова центрифуг ировалк и из всплывшего слоя можно выделить 9о% фермента .

Для сраппения культивировалги VVK роорганизм - донор (ВасаГТцз .Tiega- terium) и огфеделили ферментати:зпую активность. Количество фермента па 1 мл культуральной среды опреде, :илг по методу дне 5 причем одну фермеп-; ную единицу оцределялк как количество фермента, проду11,ирующее 1 мг восстанот лен}1ого сахара (с применением мальтозы в г;ачестве эталона

ЦП Г та В (ТРИ ИЯ ) Р MHHViy Ii РЧО :Ие

1 ; мип инк , бациоп)1ого врсмс-пи, Суб- был --(еп:-1 чистой амилазой.

Микропрга 1- зм - донор ,уци.ро- вал 66 Д) ферме1 тньгх ел-/л культуры. Масыщегпгые культуры Е. cor i CL 7001 (рСР I) продуцмрова- ги 116jf; ед./л культуры, тогда как после культиви- рс чания (амплификации) в течение : ч с хлорлмфряиколом с последующим культ -л ированисМ в течение 5 ч без ;лора - фенцкола бактерии Е, cc: f -i CTj 7001 (рСР ) продудировалк 84.5 ед./ Э тп тюказывает, что метод касыщен- ньп культуо обеспечивает достаточное пг- яъпаение продупировакия фермента .

Фермен.т продуцированный бактеряя ш Е, coVi CL 700 i (рСР 1) .идентифи- т,ированр ый как альфа-амилаза, имеет слйдующие свойства. Он расщепляет амилазу и / милопектин на глюкозу, мальтС Зу и мальтотриозу, главным обэазом малтэтозу; и расщепляет дикло дехст рин и малътотриозу на глюкозу и :--1ал:ьтоЗ} : Креме того, рас- те тляэт пуллулан па панозу и/или изо-паксзу.

Вотг т-ткло предположение, что мик- т ос рг я.иизм .) megsteriiim явля- о г-я Baci Tius circulaus,

Г j) и : е р 2 , Кло ироваяие термостойкого гена альфа-ямила зь.

Микроор анизмом-допором бьи; исходный П глмм BaciJfuS; выделенный из о.учпогта и идентифицированный как Ravi Kj us coagulaus. Он проду::ирует -ел то стойкую а.гьфа-амилпзу и отлича- т я с. те д ууошим и мик ро биол о г ич е ск ими гпэизнаками;

морфология; палочки (056-1x2,5- ) Д) ) ,, чодвкжные, грамположи- гепьныо и грамотридательные, cnopi-: :1 : мтральнр-,1:х или терминальные, не :;еф(1р -1Иропанные ;

1г-1 1 г;-ельиый бл льон: рост ч ятел/-.(ый CKCiiienf;i,ui -чгяр: лср(ч:-ий {( т.. ; и-г зидные:, оаскилл с-ые . МГ-О--белые;

1отреб. 1сние органических ч окпой поло/;гитйльн;;я реакция, мл чопогой: отрицательная;

же;:;:: ;-: : ожижение;

- г;рог:уииопБа1;ке пцетилмс i .)п, ; пл i ; це гзинл) : полож тель;;; ;

/ ид)с:;из о -ни урофсни. тгалпК :ч ирз ;;г1;:ожительчая :;

BjTiMTnnoBJiCKiiP и ; с, : : ) .- | ;ьнля, чоя О : п;; 4/i ; п .:{-:

71

каталазная реакция: положитель:1ая

продуцирование индола: отрицательная;

декарбоксилазная реакция на лизин; отри:дательная; орнитин: отрицательная; аргинин: отрицательная:

образование сероводорода: отрицательная ;

потребление углеводов: потребляет;

пуллулан Потребляет на ми гималь- ной среде;

потребление многоатомных спиртов: потребляет глицерин, сорбитол, ман- нитол5 инозитол; не потребляет адо- нитол, дульцитол:

уреолиз: отрицательная;

потребление лецитина: отрицательная ;

оптимальная температура роста 50 С; максимальная температура роста 55-60°С 5 минимальная температура роста 15-25 С;

потребность в кислороде: аэробный и анаэробный.

Штамм сдан на хранение в NC1B 12 февраля 1980 г., как NC1B № 11571

ДНК экстрагировали и подвергали действию Е. со R I; .Hind Ш; Rst 1; Sal 1; Earn HI и Bgl.D. Только Bgl D MOT произвести много фрагментов в широком диапазоне молекулярных весов. Однако можно было получить фрагменты с Есо R I и при концепт- рации хлорида натрия менее 50 хМ, Поэтому решили применять Есо R I для получения фрагментов для клонирования в Есо R Т переносчика лямбда ДНК (лямбда NM 781).

Расщепление ДНК baciljus coagu- laus и ДНК лямбда №1 781.

1,25 мкг ДНК лямбда NM 78 разрезали одной единицей Есо R I в 25 гкл следующего буферного раствора: 10 мМ три.с -HCF (рН 7,5), 10 мМ 2-серкапто- этанола. 10 мМ сульфата магния и 00 мМ хлорида натрия. 2 мкг ДНК . coagutaas разрезали тем же ферментом в аналогично буферном растворе за тем исключением, что концектрацкю лорида натрия понизили до 50 мМ, нкубация продолжалась 2 ч при 37 С и реакция была остановлена агреванием при 75 С в течение 10 мин. олноту расшепления контролировали етодом электрофореза в %-ньгх ага- озных ГР.ПЯ:;.

Связывание и выделение рекомби- антных фагов.

5

3380-;в

Раси;епленную ДНК смешивали и свя-лывали с приъ-генением двух единтти лигазы сЬага Т в . содержа- шей 60 мМ Tpi.r -HCF (рН 8), 10 мМ гульфята магния, 0 мМ 2-меркзг1то- этакола О, 1 мМ ЛТФ. Реакцию про- лолжали 10-15 ч при 10 С. После связывания аликвотные части 0,2 мкг ДНК смешали с АТФ для получения коJQ нечной концентрации 10 М. Эти алик- Еотнь е части подвергли инкапсила Ц1И :i п vitro и применили для инфицирования штамма НВ 0 Е. coEi. Было полл чено около 1,5x10 ПОЕ (пятно образующих единиц) на 1 мкг лямба ДНК, Некоторые из этих фагов проявили амилазную активность (обнаружение аммлазной активно Сти на чашках Петри выделение « фага аналогична примеру 1).

Наблюдалось довольно большое со- 7лер :;акие продуцир;.тоших амилазу фагов (1 Б АОО) . Один был отобран,, обозна- -.-ен лямба NM 78 альфа Amy 1 и

2 сдг;н хранение в NC1В 12 февраля 9ВО г. как N4 :- E 11572.

Повторное клонирование гена амила- 31 из лямбда NT-1 781 альфз Атлу . в п л 3 м -г i д у р В К 322.

1 мкг ,ДНК лямбда 781 альфа/ my 1 ь такое же количество ДНК pBR 322 разрезали Есс R Т при обычных -условиях. Связывание и трансформацию выполнили ПС методике, описанной в npiit- epe 1. Колонии Е, coFi. содержа20

30

35

40

щиР рекомоинанткую плазмиду, обнаружены по амилазной активности. Одна такая колония отобрана и обозначена Е, cofi CL 7002 (рСР 2) и сдана на хранэние в NCiБ 12 февраля 1980 г. под номером NC1B № 11573.

А галиф -;кацкя гена. Амплификйп.ия кодирующего амилазу гена лямбда ММ 761 альфа Amy 1 и про- дуц::ронант-:е амилазь осуществлены

след тот1-;м ,

Бактерия - хозяин (Е, coTi НВ 101) культивирована в l.B среде с 2 мМ хлорида магния npi-; 37°С до достижения оптической плотности 0,3 (650 нмХ

Затем добавили фгг лямбда NM 78 альфа Amv 1. количество фагов было рассчитано так, чтобы множественность заражения составляла приблизительно 1-2, т.е. .один тши два фага

на одну бактериальную клетку. Затем продолжали культивирование при энергичном перемешивании при 37 С до понижения оптической плотности. Когда

сп гнческая плотность понизилась кгоке С,5, культуру собрали и положили iia лед. Культуру центрифугировали и Fсплывший слой испытали на амилаз- ную активность.

Амплификация и продуцирование фермента Е.. соП CL 7002 (рСР 2) осуществлены по методам насыщенной культуры и амплификации хлорамфени- колом, как описано в примере 1,

Амилаэную активность определяли по методу ,ЦНС и в лизате фага и и культурах Е„ cofi, содержащих .рекок- бшшнтные плазмиды.

В табл. 1 представлены значенияj нолученные дхш амилазной активности в исходном штамме В. coaguSaus , и распределение между внеклеточной и клеточной активностью.

Приведены также активностиs полу ченные с рекомбинантным фагом (лямбда NM 781 альфа Amy 1) и штакм со- держаший рекомбинантную плаэмиду Е. co5i CL 7002 (рСР 2). Достигнуто примерно трехкратное узеличение продуцирования фермента с применением рекомбинантного фага, к еще большее увеличение наблюдалось с плазмидой (прибтшзительно в 300 раз}.

В случае применения фага (лймбда NM 781 альфа Amy i) весь фермент выделяется Бследст -зие лиьиса клеток и, следовательно э находится в куль- туральной среде. В случае применени плазмиды большая часть фермента (96%) .находится в клетке.

Повторнае клонирование Б дериват фага лямбда, способный к лизису Е. соН.

Для иллюстрации ггригото)зленйя системъ переносчик - хозяин,, содержащей лямбда лизогенньй Е. coEi, проведен следующий эксперимент,

Пргжекен бактериофаг лямбда Т4 lig CL 857 Warn Earn Sam (лямбда NM 989).

Этот фа.г содержит ген ДНК лигазы бактериофага Т4 и способек к лизису Ео coli. Кроме того, он содержг т термочувствительный ген иммунитета и две амбермутации в гене Е и гене S соответственно. Мутация гена на дает бактерии лизироваться под действием инфекции этим фагом. Целью субклонирования бьто заменить ген ДНК лигазы геном, кодирующим амилаз

ДНК фага и 1лазмиды (рСР 2) были расщеплены Есо R I и фрагменты был связаны. ДНК фага, полученная в ре

305(J

зультата лягацич, быпп упакована in v itrc пят:1а бьг и исслсдо- някы визуально путем itocfMria ;ia штамм Е:. Sur Е, -jii p r Пятна j лока- эынаюЕше акклаччую активное ь, бьпи собракы и ii:f.r очищен по ci HcaiH ott методике,

Затем ТОТ фаг был применен для лиьирс1гания штамма Ь. coFi С 600 (СТ. 1205) го обычной ме:тодике, Лизо- генные колонии Зыпи про зар нь1 визуально ка крал - 1алсодержащей ;:реде с пp т 5e -ieииeк метода окрашивания йодон. штамм обозначен нами Е, coFi CL 7СОЗ (.пямбДс альфа .Ajuy ) и сдан на хранение в 6 марта 1980 г. под номерок -IC 3 П586.

А.КП.ЛИФИ:-аци гена ос уществ.пена сле;ду)щкм образом.

был зырашен лри в )еде LE дс гшогности О ,,8 при 650 им. затек его ,ентр 1фугировали я клетки суспендировали св-эжсй среде LB, предЕ-арительно магратой до . Потом к З лътуру ии:ку6ировали i; водянпй бане при в течение П - ;чин с целью индуцирован гтя лити еского цик:га (тйк как ген иьп укитета является тйпло -гувстЕительньм} ,

Затем продо1 жа ;И иккубаг}:по при зН(т;рг5-1:чно; 5 пере; ешиБан и при З7 с в тг чекне 3 ч. после чего спрудаляли

;3;-ft( ;: КТИПИОС ТЬ ЗС Br n lblBUieM

гппе к Б клетка ;. Значения призедены п абл. 1.

Этот зкспериме1: т иллюстрирует ; ;егод суб - сз -бклонироветт: из 11ЛЯЗМ15ДЫ В новый лямбда фаг. .iIHK из .пя1-5бда Ж /81 1пьфа..А1пу 1 может бьгть так же лег хо субклонпрована в фаг пямбда ТА lig С1 857 Wain Za™ Зал: 1-,./;И же донорнйя .LifiK может бсгг : n.:.di.-:poBaHe. яег1оср2;:1ственно 3 ука- эя чньг : BbuDt фапп Бсзмож1 о .iiicone. ;чо.лк -ест1 о ваоигитоь эппсан- «его t iococa,

Вы7лО.:-1еи1че и : ;яра:г уе р:1С П Ка амилаf: 4-f R: cc li С ;.. 7002 ГрСР 2) и R. С;:, ;. CL 700:5 (л янбДо aJ:;ьфa Amy 1). Кил в пример- - : мъ: .- Кп;п1 метод осно-1-;-- 8Ского ударз .цпк выделеф йрмs т : .o i - L.c.n j эт 5ыу npL-n :;py явпя - термос таокпь -ья ; 5 оп мог бьп ь дапйс. очижЕ и rry-rei-i добазпепия к

10 - iM ;-; .- ГТГСф ; . / ПОДОГрв

ь:а p&c: v Kopc. ДО Ви И ;isii;.at:ржк -: Е i;.) тугхк; 1 р-з упь 1-пте такой

обработки все протеины Е. coli осаждаются и можно получить альфа-амила в исключительно чистой форме, фактически никакие другие ферменты не присутствуют.

Бьта определена специфичность алфа-амилазы: она активна к амилозе и крахмалу, продуктами гидролиза являются глюкоза, мальтоза и мальто- триоза со следами компонентов с бол молекулярным весом. Этот фермен не активен к,циклодектрину. Была также исследована теплостойкость фермента и оказалось, что она очень высока. Оптимальная температура активности с 0,5% амилозы находится в интервале 80-90 С. С 8%-ным растворимым крахмалом оптимальная температура составляет около 100 С.

Возможно, что микроорганизм Baci Tus coaguJaus фактически является Baci Elus lichenitormis.

Пример 2а. Субклонировани плазмиды рСР 2 в плазмиду рС 194 и экспрессия новой плазмиды в BaciTJu subtilis.

Рекомбинантная ДНК, полученная в соответствии с изобретением, может бь1ть экспрессирована в бактерии - хозяин, отличной от Е. соП а именно в mTaNfMe Bacillus subtiJis.

Плазмида рСР 2 (пример 2) содержит, фрагмент размерами 3,31 килобаз из донора В. coaguTaus; кроме того, плазмида характеризуется тем, что сообщает сопротивляемость к ампицил лину и тетрациклину и содержит два участка ограничения для каждого из Есо R I и Hind Iff. Плазмида рСР 2 бьша расщеплена на 4 фрагмента Есо P I и Hind П, обработана лигазой и применена для трансформации НВ101 как в предыдущих примерах,

Получились новые плазмиды, обозначенные нами рСР 2.3, имеющие фрагмент 2,64 килобаз ДНК В. coagulaus, причем указанный фрагмент содержит ген, кодирующий альфа-амилазз- . Плазмида рСР 2,3 имеет один участок для каждого Есо R I и Hind Ш и придает ампициллированную и терациклиновую сопротивляемость.

Для следующей стадии была выбрана плазмида рС 194, которая известна своей способностью к репликации в BacilTus RubtiTis. Плазмида рС 194 придает хлорамфеникольную сопротивляемость и И1.;еет один участок Hindffl,

338051-2

рСР 2.3 и рС 194 бьти открыты Hind Ш, смешаны и лигатированы для образования новой плазмиды, обозначенной рСН 1, содержащей кодирующий с альфа-амилазу ген и имеющей хлорамфеникольную и ампициллиновую сопротивляемость, хотя уровень хлорамфе-, никольной сопротивляемости в E, был низок. Препарат был применен

(О для трансформации Е. coEi НВ 01.

Штамм мутанта Bacillus sudtitis, обозначенный OB 1133, не проявляющий альфа-амилазной активности,бьш затем обработан в соответствии с известным

5 методом С. Чан и С. Когана для образования протопластов. Затем протопласты бьши трансформированы рСН 1 по методике трансформации в среде полиэтилеигликоля Чана и Когана

20 (I biol).

После зтого протопласты были ин- . кубированы в богатой среде в течение 1,5 ч, чтобы плазмида в бактерии экспреесировала сопротивляемость

25 к хлорамфениколу.

Затем протопласты были посеяны на регенерационную среду, к которой был добавлен хлорамфеникол в количестве 20 мкг/мл. После инкубации в те

ченне двух суток при 37 С появились колонии трансформированных клеток; эти колонии,проявляющие альфа-ами- активность, были обнаружены по методу окрашивания парами иода. Один клон, обозначенный В. subtilis CL 8001 (рСН 1), сдан на хранение 13 января 1981 г. под номером NC1B № 11629. Исходный штамм QB 1133 тоже сдан на хранение 13 января 1981 г. под номером NC1B № 11628. В. subtilis CL 8001 (рСН 1) стабилен только в присутствии хлорамфе- никола и может быть применен для продуцирования альфа-амилазы путем культивирования в среде, содержащей хлорамфеникол (20 мкг/мл). Альфа-амиаза может быть легко выделена -из культурной жидкости.

После культивирования в течение ночи в присутствии хлорамфеникола количество продуцированной альфа- милазы было следующим, ед./л: всплывающий слой 136; клетки 14,

Пример 3, Клонирование бета- амилазы.

Микроорганизмом-донором был штамм cereus. Он сдан на хранение ферментативный исследовательский нститут в Чиба-ши, Япония, 20 декабря 1973 г нод номером FEIM-P

№ 2391, а также в Американскую коллекци1о культур под номером АТСС

№ 31102 26 декабря г. Известно

что он продуцирует как бета-амила;зу, так и альфа-1 S 6-глюкозидазу.

РСлонирование гена бета-амилазы в лямбда NM 781,

Принята такая же методика, ограничения, связьгоания и выделения, как Б примере 2., ДНК (2 мкг) В. cereus (зьша ограничена при обьтньж услози- ях ограничения ферментом Есо R I; ДНК переносчика фага (1,25 лямбда Ш 781) бьша разрезана тоже Есо R I (Связывание и упаковка были осушаст- плены., как описано выше.

Были обнарз,окены несколько реком- (5инантных фагов, проявляющих амилаз- ную активность (приблизительно 1 : ;JOO.) . Был отобран один из этих фагов (обозначенный лямбда NM 78 бета . uny ) и сдан на хранение в NC1B 2 февраля 1980 г под номером NC1B Р n57i.

Повторное клонирование гена бета- амилазы из лямбда NM 781 бета Amy а плазмиду pBR 322.

С целью повышения продуДирования фермента этот первый клон бета-амилазы был применен в качестве источника кодирующей бета-амилазу ДНК для субклонирования ее 3 мультикопию плаз- миды рВ8 322,

2 мкг ДпК лямбда NM 78 бета Amy 1 и 1 iMKr рВГ 322 были разрезаны Ксо R I, смешаны и обработаны Т4 ли- 1 азой. Связывание и трансформаци Е осуществлены,, как описано выше.

Одна колония на 200 устойчивы ; в: ампициллину колоний показала активность к разложению крахмала. Дру Г ая выделена и обозначена Е, CoEi C:L 7004 (pCF 3) и сдана на хранение 15 сентября 1980 г. под номером NCГВ № И 602.

Повторное клонирование гена ббта MИJтaзы в дериват фага лямбда способный к лизису Е. .

В качестве переносчика бьш пркмс - иен термочувствительный лямбда Т4 i ig фаг СЛ 857 Warn Earn Sam (Лямбда, KM 989), описанный в npJ-iMepe 2-, Около 1 мкг ДНК плазмиды рСР 3 и ЛНК фага были расщеплены затем фрагменты связаны вместе и полученные части ДПК упакованы in vitro Частицы фага 5 проявляющие амилазн ло актив ность,-, Пь ли выделены н примеиень для

33805i получения лизог еннкх колотили по описанному вьклё методу, Штамм F -о М . 500 лизогенный д:1я этого пекомби- нантного флга был выделен и обозняТ.ПЛ ;-т 7 .- f У Р | 7 ОГ1 f с г 1,- .. .-.С,,,.: оь . , лямода пета Агпу 1); 04 сдан на хранение 15 сентября 1980 г, п оп номером NC i R I 1603.

Амплификация гена амилгзь . 10 Во всех клонах и субклонах амклаз- ную активпостт: определяли по мет-олу пне. Яета-омипаапая активное , пол-- тверк :1;ена хроматограммамн ТСХ о присутствию единичного пятна мальтп- ji яы после усвоения амилозы,

Кыла ос лцествлена, по списанной м е-эдике,, акпли Ьикпция геид анилазы в различных клонах.

В г-абл, 2 представлена фёрмента- jQ тиг5иая активность исходных штаммон по сроЕненкю с активностью в трех клонах,

активность определена либо по лизату; либо по методу осмотического 25 уцара , описанному в примере 2,

П р н Е. е р U Клонирование гена пулланазы

Микроорганизмом-донором бьш Kleb- siella pi icuraoni;)l, сданный на хранение-в АТСС 6 июня 963 г, под номером 5- ; 5050,

2 5 25 йcг ДНК донора экст-рагированы и фрагментирова гь; Есо R I п обычных условиях и 1;25 мкг ДНК лямб ;а иМ 781 разрезаны этим jse ферментом в таких

- же условиях. Инкубация продолжалась 3 ч при 37 С; после чего реакцию остановили путем нагрева в течение iO мин при . Полноту ограничения олределя ли гак, как описано в при мере 2.

Ограничечные JiFK бьши связаны; Еьщелгнк у, .тримекены для инфекции иггамма Е. со Pi KB 101 fсогласно примеру 2), Получено около 2х10 пОЕ и ятнообраз / ощи : едини:-:) к i f.(K ; ЧК лямбда „

М

KOTEjUbie лкт ia гюкаяали пу1г:гуланаз -iyiro актлвкость, т.е. сизл были окружены муткыгг- кс.пьпами, харэктер/1ьгми для чрезмерпо разросшихся: ба; т-; рий

15

хранение в NCI В 9 апреля 1980 г. под номером NC1B № 11593.

Пуллуланазную активность определяли по методу дне, и продукт гидролиза пуллулана лизатами фага идентифицировали как мальтотряозу методо тонкослой( хроматографии.

Лямбда NM 781 PuP 1 содержит большой фрагмент ДНК (из KTebsieTIa pneumonike) 13,5 килобаз; этот фрагмент был снова расщеплен Есо R I на два фрагмента 6,1 и 7,4 килобаз. Затем субфрагмент 6,1 килобаз бьш повторно клонирован в лямбда NM 781 и установлено, что он содержит ген пуллуланазы. Этот новый рекомбинант- ный фаг назван лямбда NM 781 2 и сдан на хранение 15 сентября 1980г

под номером NC1B № 11604.

Субсерия 6,1 килобаз была затем

еще клонирована в мультикопию плаз- миды рАСУС 184.(дериват pBR 322 с Т геном последнего и С геном с одним участком Есо R I). Этот новый клон назван Е. со 21 CL 7006 (рСР 4)

В. coaguJaus

Лямбда NM 781 альфа

Amy 1

Е. coli CL 7002 (рСН 2) с Cm ампли- фикапия

Е. со CL 7002 (рСН 2), культивирование в течение ночи

Е. соИ CL 7003

(лямРда альфа Amy 1 )

Одна единица определена как количество фермента, дающее 1 мл эквивалента мальтозы на 1 мл мин при 50 С с применением в качестве субстрата 0,5% амилозы.

лги

Метод осмотического шока не был применен, но был осуществлен лизис, так что это значение представляет сумму амилазной актив- поп и в периплазме и клетках.

05 6

и сдан на хранение 15 сентября 1980 г. под номером NC1B N 11605.

Третий субклон создан путем введения фрагмента 6,1 килобаз в фаг лямбда NM 989 согласно примеру 2. Этот клон назван Е. соН CI 7007 (лямбда Puf 2) и сдан на хранение 15 сентября 1980 г. под номером NC1B № 1 1606.

Уровень экспрессии и амплификации пуллуланазы был изучен у всех клонов.

В табл. 3 дана экспрессия пуллу- наназ Ь K ebsiella в клонах Е. coti ( активность выражена в единицах мальтозы, эквивалентных 1 л культуры) .

Как можно видеть из результатов, пуллуланаз ая активность индуцирует- ся мальтозой путем добавления 0,04% мальтозы в срезуt Кроме того, для выделения пуллуланазы необходима бработка Triton х 100 мембранной ракции, и это указывает на то, что ктивность локализована в мембранах.

Таблица 1

3,43

5700

14 ,2

:2960 232

320,6

162

26,1

Baci TTiisc preits ЛТСС 31102

Лямбда NM 78 бета Amy

Е. coTi CL 7004 (рСР 3)

59 (77,2) 17,4 (22,8) 76,4

19(44,2) 24 (55,8) 43

акт ивность: o6 a6oTva лизоцимом г лизисом клеток .

Культура выдержана в течение при 30 С (дрожжевой экстракт, %; бактотриптом 1%; хлори;;:, натрия 0,5%).

т- -,(-. ,

Культуры выдержань; в течение ночи при J7 (,, и ;з же

-f.-K

составе культуральной сре,п,ь,

Культивирование при 32- ---с ; активность определяли

в всплыви)ем слое Р: Р клетках после лизиса, как для Е. coli лямбда Ainy 1 3 2 .

Т а б л и ц а 3

Культура

Всплывший

Klehsiefl a маль- т оча

NM 7В1 Pul 1

NM 781 РчР + ма.льтта

ММ 781 PU 2

NH 781 Ри 2+ -;лльтоза

%:. rol i CL 7006 pCff 6)

ед./л (%)

Г

j Увеличение I продуниро- I вания фермента

Сос /аьи-.--;:)ь J., Чибисова

Texi jen L l .IIoriCi H-- Корректор M. MaKCi-гмишинец

Зака- 278//т9Тираж 490Иоппиское

ВИИИПИ ;судг1ргтвеино1 с ломк-уета СССР

пп лэпам изобретений и открыт;: И ЮЗт, Москва 5 Ж-35. Раукгская нас , д, ч/з

ПрОИЯБОх