Способ получения альфа-амилазы Советский патент 1993 года по МПК C12N15/00 C12N15/00 C12R1/00 

Изобретение относится к области технической генетики, а именно к способу получения альфа-амилазы.

Целью изобретения является повышение эффективности способа получения альфа-амилазы.

. П р и м е,р 1. Клонирование гена альфа- амилазы.

Применяют следующие материалы: ограничивающая эндонулеаза Hindlll; лигаза ДНКТ4; фаг/лямбда NM 590. ДНК фага получают экстракцивй фенолом из высокочистых частиц фага; плазмида pBR322. ДНК плЭзмиды очищают из клеток E.coli, лизиро- ванных лизоцимом, в хлорид цезия-бромид этидия градиентах плотности; микроорга- .нидм-хозяин: E.coli; микроорганизм-донор штамм Bacillus megaterium со следующими микробиологическими признаками:

морфология: палочки (0,5-0,7 х 2,0-5,0 мкм), подвижные, грамположительные, споры терминальные и субтерминальные;

питательный бульон: хороший рост;

питательный бульон: хороший рост, колонии плотные посредине и более расплывчатые вокруг;

молоко: пептонизация без изменения рН;

желатин: не сжижает;

восстановление нитратов: отрицательная реакция;

каталазная реакция: отрицательная;

оксидазная реакций: отрицательная;

цитоэромоксидазная реакция: отрицательная;

продуцирование индола: отрицательная;

образование сероводорода: отрицательная;

потребление углеводов: потребляет арабинозу, ксил.озу, галактозу, глюкозу, левулезу, мальтозу, рафинозу, сахарозу, крахмал и кислоты, полученные из них, нарамнозу, маннозу, мелибиозу, инулин и салицин не потребляет;

потребление многоатомных спиртов: потребляетсорбитол и маннитол, не потребляет аденитол, дульцитол и ионозитол;

ел

с

., .1

00 СА) 00

4

СА)

декарбоксилазная реакция на лизии: отрицательная;

уреолиз: слабый;

сопротивляемость действию тяжелых металлов: растет непосредственно на 500 м.д.

бульон хлорид натрия: рост при концентрации хлорида натрия 3,5%;

оптимальная температура роста: 30- 37°С;

максимальная температура роста: 40- 50°С;

минимальная температура роста: 5- 20°С;

потребность в кислороде: аэробный микроорганизм.

Микроорганизм сдан на хранением Национальную коллекцию промышленных бактерий 12 февраля 1980 г под номером NCIB № 11568.

Ниже приводится описание применения способа его получения.

А. Рекомбинация in vitro между ДНК лямбда и B.megaterium.

Около 7 мкг ДЕК B.megaterium расщепляют 10 ед. Hindlll при температуре 37°С в течение 1 ч в объеме 25 мкл буферного раствора Трис при ,5. Около 2 мкг лямбда М 590 расщепляют аналогичным образом тем же ферментом. Реакции останавливают путем нагрева в течение 10 мин при температуре 75°С.

С целью определения эффективности расщепления образцы обеих реакционных смесей подвергают электрофорезу в геле агарозы в течение 20 ч при напряжении 20 В. После окрашивания геля этидийброми- дом должны получить две полосы ДНК лямбда, полученные в результате расщепления отдельного участка Hindlll на ДНК лямбда, и очень большое количество почти перекрещивающихся полос бактериальной ДНК, расщепленной на большое количество участков.

Расщепление ДНК смешивают и инкубируют в течение 5 ч при температуре 10°С 0,15 единиц ДНК лигазы Т4, чтобы могли, происходить произвольная повторная рена- турация и ковэлентное окружение фрагментов ДНК.

По окончании инкубации ДНК смешивают с препаратом, инкапсидированным in vitro, состоящим из смеси двух комплементарно-дефективных лизатов фага (лямбда Dam и лямбда Ват), индуцированных из неподавляющих штаммов.

Для оценки эффективности этого рпосо- ба выполняют два контрольных опыта.

1. Образец смеси был сведен в E.coli. В результате должно быть получено 3-10

пятен на 1 мкг введенной ДНК лямбда, что указывает на большую эффективность обработки лигазой.

2. Полученные таким образом плтнэ были исследованы визуально. Если из них 70% были прозрачные, а не мутные, то это указывает на присутствие фрагмента ДНК. B.megaterium, который стыкует и, следовательно, инактивирует лямбда ген CI, отвечающий за помутнение пятна.

В. Отделение деривата фага лямбда, несущего B.megateterium амилазу.

Остаток инкапсидационной смеси применяют для заражения E.coli в количестве

5 приблизительно 103 жизнеспособных частиц на посев. После роста зараженных E.coli и образования пятен посевы сортируют на присутствие пятен разложения крахмала. Это делают путем кратковременного дейст0 вия на посевы парами иода. При этом пятно, образованное таким фагом, будет окружено прозрачной зоной, образующейся в результате диффузии и действия амилазы из лизо- ванных клеток. Фаг, содержащий это пятно,

5 немедленно отбирают для субкультивирования (длительное действие паров иода убило бы фаг). Потомство этого пятна размножилось в чистоте (продуцируя амилазу) и обоз1 начено как лямбда NM 590 Amy. Фаг лямбда

0 мм 590 Amyl сдан на хранение в Национальную коллекцию промышленных бактерий 12 февраля 1980 г; под номером NCIB № 11569.

С,.Повторное клонирование гена амила5 зы в плазмиду pBR 322.

1 мкг ДНК из лямбда NM 590 Amy и 0,3 мкг плазмиды PBR 322 расщепляют, смешивают и обрабатывают лигазой, как описано в части А. Этот препарат, применяют для

0 трансформации (по обычной методике) штамма НВ 101. Отбор производят по сопротивляемости ампициллину (ар) - свойству, которое сообщается клеткам в присутствии этой плазмиды. Обычно эта

5 плазмида сообщает также сопротивляемость к тетрациклину (ТС). Однако введение посторонней ДНК в эту плазмиду расщепляют tet ген, таким образом, содержание чув- ствительныхк тетрациклину

0 трансформированных клонов отражает содержание содержащих плазмиды клонированных-ДНК-. В данном случае 16% клонов содержали новую плазмиду, которая придавала амилазе активность к E.coli. В соответ5 ствии с одновременной международной номенклатурой плазмид новые плазмиды, описываемые в настоящем описании, называются (рСР), а конкретная плазмида согласно настоящему примеру обозначена (РСР1).

Это показывает, что повторное «локирование гена тем же самым ферментом (в данном случае Hlndlll) является очень эф- фективным.слособом (16% вместо lilO5).

Плазмидосодержащий микроорганизм обозначен E.coli CL 7001 (рСР 1) и сдан на хранение в Национальную коллекцию промышленных бактерий (NCIB) 12 февраля 1980г. K3KNCIB Ns 11570.

Амплификация и продуцирование фермента.

Продуцирование фермента в содержащих плазмиду (рСР 1) клетках улучшают двумя следующими способами.

1Л Насыщенные культуры.

Культуры инкубируют в течение ночи при температуре 37°С на вращающемся вибраторе в пятилитровых колбах Эрлен- мейера, содержащих 1 л культуральной среды (LB; дрожжевой экстракт-триптон),

2, Хлорамфеникольная амплификация.

Культуры инкубируют при температуре 37°С на вращающемся вибраторе в пятилитровых колбах Эрленмейера, содержащих 1 л культуральной среды (LB), до достижения плотности 0,8 (650 нм), после чего добавляют 150 мкг/мл хлорамфеникола. Это предотвращает дальнейшую .репликацию хромосомной ДНК, но не репликацию содержащей ген амилазы плазмиды (рСР 1). После амплификации (до 3000 копий) плазмиды по сравнению с хромосомной ДНК хлорамфеникол был удален, чтобы мог продолжаться синтез протеина, а именно, после амплификации клетки отделяют от среды методом центрифугирования, промывают для удаления хлорамфеникола и повторно культивируют для продуцирования амилазы.

D. выделение фермента.

Клетки культивируют в течение ночи, после чего их суспендируют в 25%-ном растворе сахарозы в 0,5 объема культуры и подвергают вибрации в течение 10 мин при температуре 24°С, в результате такой обработки происходит плазмолиз клеток. Затем добавляют ЭДТК к 1 мМ конечного раствора (чтобы стенки клеток стали проницаемыми) и материал подвергают вибрации в течение еще 10 мин при температуре 24°С. Суспензию центрифугируют и клетки быстро по- „вторно суспендируют в холодной (приблизительно 0°С) воде и подвергают вибрации при этой же температуре еще 10 мин. Суспензию снова центрифугируют и из всплывшего слоя выделяют фермент.

Для сравнения культивируют микроорганизм-донор (Bacillus megaterium) и определяют ферментативную активность. Количество фермента на 1 мл культуральной

среды определяют по методу ДНС, причем одну ферментную единицу определяют как количество фермента, продуцирующее 1 мг восстановленного сахара (с применением 5 мальтозы в качестве эталона для сравнения) в 1 мин в течение 10 мин инкубационного времени. Субстрат был очень чистой амилазой.

Микроорганизм-донор продуцировал 0 66,0 ферментных единиц на литр культуры, Насыщенные культуры E.coliCL7001 (pCP1) продуцировали 116,6 единиц/л культуры, тогда как после культивирования (амплификации) в течение 5 ч с хлорамфениколом и с 5 последующим культивированием в течение 15ч без хлорамфеникола бактерии E.coli CL 7001 (рСР 1) продуцировали 84,5 единиц/л. Это показывает, что метод насыщенных культур обеспечивает достаточное повыше- 0 ние продуцирования фермента.

Фермент, продуцированный бактериями E.coli CL7001 (рСР1), идентифицированный как альфа-амилаза, имеет следующие свойства. Он расщепляет и амилазу и ами- 5 лопектин на глюкозу, мальтозу и мальтотри- озу, главным образом мальтозу, и он расщепляет циклодекстрин и мальтотриозу на глюкозу и мальтозу. Он расщепляет пул- лулан на панозу и/или изо-панозу. 0 Пример 2. Клонирование теплостойкого гена альфа-амилазы.

Микроорганизмом-донором был исходный штамм Bacillus, выделенный из компоста и идентифицированный как Bacillus 5 coagulans. Он продуцирует теплостойкую альфа-амилазу и отличается следующими микробиологическими признаками:

морфология: палочки (0,6-1 х 2,5-5,0 мкм), подвижные, грамположительные и 0 грамотрицательные, споры центральные или терминальные, не деформированные;

питательный бульн: хороший рост;

питательный скошенный агар: хороший рост, нитевидные, раскидистые, кремово- 5 белые;

потребление органических кислот: лимонной - положительная реакция, малоновой - отрицательная;

желатин; ожижение;

0 продуцирование ацетилметилкарбино- ла (ацетаина): положительная;

гидролиз о-нитрофенилагалактозида: положительная;

восстановление нитратов: положитель- 5 ная, может получать газ;

каталазная реакция: положительная;

продуцирование индола: отрицательная;

декарбоксилазная реакция: на лизин - отрицательная,1 орнитин - отрицательная, аргинин - отрицательная; .

образование сероводорода: отрицательная;

потребление углеводородов: потребляет;

пуллуман потребляет на минимальной среде;

потребление многоатомных спиртов: потребляет глицерин, сорбитол, маннитол, инозитол, не потребляет адонитол, дульци- тол;

уреолиз: отрицательная; потребление лецитина: отрицательная; оптимальная температура роста: 50°С; максимальная температура роста: 55- 60°С:

минимальная температура роста: 15- 25°С;

потребность в кислороде: аэробный и анаэробный.

Штамм сдан на хранение о NCIB 12 февраля 1980 г как NCIB № 11571.

ДНК экстрагировали и подвергали действию E.coli Rl; Hindlll; PStl; Sail; BamHI и Bglll. Только Bgl и мог .произвести много фрагментов в широком диапазоне молекулярных весов. Однако, можно было, получить фрагменты с . E.coll RI при концентрации хлорида натрия менее 50 мМ. Поэтому применяют E.coli RI для получения фрагментов для клонирования в E.coli RI переносчика лямбда ДНК (лямбда NM 781). А. Ограничение ДНК B.coagulans и ДНК лямбда NM 781.

1,25 г ДНК лямбда NM 781 разрезают одной единицей E.coli RI в 25 мкл следующего буферного раствора: 10 мМ Трис-НС (,5), 10 мМ 2-серкаптоэтанола. 10 мМ сульфата магния и 100 мМ хлорида натрия. 1 мкг ДНК B.coagulans разрезают,тем же ферментом в аналогичном буферном растворе за тем исключением, что концентрацию хлорида натрия понижают до 50 мМ. Инкубацию продолжают 2 ч при температуре 37°С, и реакцию останавливают нагреванием при температуре 75°С в течение 10 мин. Полноту ограничения контролируют методом электрофореза в 1%-ных агароз- ных гелях.

В. Связывание и выделение рекомби- натных фагов. .

Ограниченные ДНК смешивают и связывают с применением двух единиц Т4 ДНК лигазы в смеси, содержащей 50 мМ Трис- НС (), 10 мМ сульфата магния, 10 мМ 2-меркаптоэтанола и 0,1 мМ АТФ. Реакцию продолжают 10-15ч при температуре 10°С. После связывания аликвотные части 0,2 мкг ДНК смешивают с АТФ для получения конечной концентрации 10 М. Эти аликвотные части подвергают инкапсидации In vitro и применяют для инфицирования штамма НВ 101 Ее.coll. Было получено около 1,6 х 10 ПОЕ (пятнообразующих единиц) на 1 мкг

лямбда ДНК. Некоторые из этих фагов проявляют амилазную активность (обнаружение амилазной активности на чашках Петри и выделение и очистку фаза - см. пример 1). Наблюдалось довольно большое содер0 жание продуцирующих амилазу фагов (1 в 400). Один был отобран и обозначен как лямбда NM 781 альфа Amyl. О и. сдан на хранение в Национальную коллекцию промышленных бактерий 12 февраля 1980 г. под

5 номером NCIB № 11572.

С. Повторное клонирование гена амилазы из лямбда NM781 альфа Amyl в плазмиду PBR322.

1 мкг ДНК лямбда NM 781 альфа Amyl и

0 такое же количество ДЕК из плазмиды pBR 322 разрезают E.coli R1 при обычных условиях. Связывание и трансформацию выполняют по методике, описанной в примере 1. Колонии Е. coll НВ 101. содержащие реком5 бинантную плазмиду, обнаруживают по амилазной активности. Одна такая колония отобрана и обозначена Е. coli CL 7002 (рСр2). Она сдана на хранение в Национальную коллекцию .промышленных бактерий .12

0 февраля 1980 г. под номером NCIB 11573.

Амплификация гена. Амплификация кодирующего амилазу гена лямбда NM 781 альфа Amyl и продуци5 рование амилазы осуществляют следующим образом. Бактерию-хозяина (E.coli НВ 101) культивируют в LB среде с 2 мМ хлорида . магния при температура 37°С до достижения оптической 0,3 (650 им). Затем добавля0 ют лямба NM 781 альфа Amyl, при этом количество фагов было рассчитано так, чтобы множественность заражения составляла приблизительно 1-2, т.е. один или два фага на одну бактериальную клетку. Затем про5 должают культивирование при энергичном перемешивании при температуре 37°С до понижения оптической плотности. Когда оптическая плотность понижаегся ниже 0,5, культуру собирают и помещают на лед. Куль- 0 туру центрифугируют и всплывший слой испытывают на амилазную активность.

Амплификацию и продуцирование фермента E.coli 7002 (рСр 2) осуществляют по методам насыщенной культуры и амплифи5 кации хлорамфениколом, как описано в примере 1.

Амилазную активность определяют по методу ДНС и в лизате фага, и в культурах E.coli, содержащих рекомбинантные плаз.МИДЫ.

В случае применения фага (лямбда NM 781 альфа Amyl) весь фермент выделяется вследствие лизиса клеток и, следовательно, находится в культуральной среде. В случае применения плазмиды большая часть фермента (96%) находится в клетке.

D, Повторное клонирование в дериват фага лямбда, способный к лизогенизации E.coll

Применяют бактериофаг лямбда Т4 lig CL 857 warn bam sam (лямбда NM 989).

Этот фаг содержит ген ДНК лигазы бактериофага Т4 и способен к лизису E.coti. Кроме того, он содержит теплочувствитель- ный ген иммунитета и две амбер-мутации в гене Е и гене S соответственно. Мутация гена не дает бактерии лизоваться под-действием инфекции этим фагом. Целью суб- клонирования была замена гена ДНК лигазы геном, кодирующим амилазу.

ДНК фага и плазмиды (рСР 2) были разрезаны Е. coli Ri и фрагменты были связаны. ДНК фага, полученная в результате лигации, была затем упакована in vitro и пятна иссле- .довали визуально путем посева на штамм E.coii Sup E. Sup F. Пятна, показывающие амилазную активность, собирают и фаг очищают по вышеописанной методике.

Затем этот фаг применяют для лизоге- Низации штамма Е.соП CL 600 (CL 1205) по обычной методике. Лизогенные колонии проверяют визуально на крахмалсодержа- щей среде с применением метода окрашивания иодом. Полученный при этом штамм обозначен Е.coli CL 7003 (лямбда альфа Amyl) и сдан на хранение в Национальную коллекцию промышленных бактерий 6 марта 1980 года под номером MCIB № 11586.

Амплификацию гена осуществляют следующим образом. Лизоген выращивают при температуре 32°С в среде LB до плотности 0,8 при 650 нм, затем его центрифугируют и клетки суспендируют в свежей среде LB, предварительно нагретой до температуры 45°С. Потом культуру инкубируют в водяной бане притемпературе45°С в течение 15 мин с целью индуцирования литического цикла (так как ген иммунитета является теплочув- ствительН Ым).

Затем продолжают инкубацию при. энергетичном перемешивании при температуре 37°С в течение 3 ч, после чего определяют амилазную активность во всплывшем слое и в клетках.

Выделение и характеристика амилазы, полученной из лямбда NM 781 альфа Amyl, E.coii CL7002 (рСР 2) и E/coli CL 7003 (лямбда альфа Amyl).

Как в примере 10 применяют метод осмотического удара для выделения фермента. Кроме того, так как фермент согласно этому примеру является термостабильным. он мог быть далее очищен путем добавления к водному 10 мМ раствору , подо- 5 грева раствора до 80°С и выдержки в течение 10 мин. в результате такой обработки все протеины E.coii осаждаются и можно получить альфа-амилазу в исключительно чистой форме, фактически никакие другие

ферменты не присутствуют.

Была определена специфичность альфа-амилазы, она активна к амилазе и крахмалу, продуктами гидролиза являются глюкоза, мальтоза и мальтотриоза со следа5 ми компонентов с большим молекулярным весом. Этот фермент не активен к циклодек- , стрину. Была также исследована теплостойкость фермента и оказалось, что она очень высока. Оптимальная температура активно0 сти с 0,5% амилозы находится в интервале 80-90°С. С 8%-ным растворимым крахмалом оптимальная температура составляет около 100°С;

Пример 3. Субклонирование плазми5 Д.ы рСР 2 в плазмиду рС 194 и экспрессия новой плазмиды в Bacillus subtiiis.

Настоящий пример иллюстрирует методику, по которой рекомбинантной ДНК, пол- ученная в соответствии с настоящим

0 изобретением, может быть экспрессирова- на в бактерии-хозяине, отличной от E.coii, a именно в штамме Bacillus subtiiis.

Плазмида рСР 2 (из примера 2) содержит фрагмент размерами 3,31 килобаз из

5 донора. B.coagulans, кроме того, плазмида характеризуется тем, что сообщает сопротивляемость к ампициллину и тетрациклину и содержит два участка ограничения для каждого из R.coli RI и Hindlll. Плазмиду рСР

0 2 расщепляют на 4 фрагмента E/coli RI и Hindlll, обрабатывают лигазой и применяют для трансформации НВ 101, как в предыду- щих примерах.

Полученные новые плазмиды, обозна5 ченные как р СР 2,3, имеют фрагмент 2,64 килобаз ДНК B.coagulans, причем указанный фрагмент содержит ген, кодирующий альфа-амилазу. Плазмида рСР 2,3 имеет один участок для каждого E.coii RI и Hindlll

0 и придают им ампициллиновую и тетрацик- линовую сопротивляемость.

Для следующей стадии выбирают плазмиду рС 194, которая известна своей способностью к репликации себя в Bacillus

5 subtiiis. Плазмида рС 194 придает хлорам- феникольную сопротивляемость и имеет один участок Hindlll.

рСР 2,3 и рС 194 были обработаны Hindlil смешаны и легированы для образования новой плазмиды, обозначенной рСН

1, содержащей кодирующий альфа-амилазу теп и имеющей хлорамфеникольную и а 1пициллиновую сопротивляемость, хотя уровень хлорамфеииколыюй сопротивляемости E.coll был низок. Как и прежде, препарат был применен для трансформации E.coll НВ 101.

Штамм мутанта B.subtills, обозначенный В 1133, не проявляющий альфа-амилаз- ной активности, был затем обработан в соответствии с методом для образования протопластов. Затем протопласты трансформируют рСН 1 по методике трансформации D среде полизтиленгликоля Чана и Когана.

После этого протопласты инкубируют в богатой среде в течение 1,5 ч, чтобы плазми- да в бактерии экспрессировала сопротивляемость к хлорамфениколу.

Затем протопласты сеют на регенера- ционную среду, к которой добавляют хло- рамфеникол в количестве 20 мкг/мл. После инкубации в течение двух суток при температуре 37°С появляются колонии трансфор0

мированных клеток, это колонии, проявляющие альфа-амилаЗиую активность, которые могут быть обнаружены окрашиванием парами иода. Один клон, обозначенный B.subtills CL8001 (рСН 1), сдан на хранение 13 января 1981 г. под номером NCB № 116929. Исходный штамм QB 1133 тоже сдан на хранение 13 января 1981 г. под номером NCIB № 11628.

B.subtills CL8001 (рСН 1) стабилен только в присутствии хлорамфеникола. Он может быть применен для продуцирования альфа-амилазы путем культивирования в среде, содержащей хлторамфеникол (20 5 мкг/мл). Альфа-амилаза может быть легко выделена из культуральной жидкости.

После культивирования в течение ночи в присутствии хлорамфеникола количество продуцированной альфа-амилазы было следующим:

Всплывший слой КлеткиИтого

(ед/л)(ед/л) (ед/л) 136 14 150

0