Способ определения активности лизирующих ферментов Советский патент 1983 года по МПК C12Q3/00 

:д

:р Изоэретение относится к микро&и логической промышленности, а именн к способам определения активности ферментов, обладающих способностью лизировать клеточные стенки микроорганизмов. Известен турЗодиметрический спо соб определения активности лизирую щих ферментов путем определения оптической плотности суспензии испытуемого субстрата до и после воз действия ферментов f . Недостатком данного способа явл ется значительная длительность опр деления активности лизирующих ферментов. Известен также способ определения активности лизирующих ферментов, предусматривающий подачу титранта в реакционную смесь, содержа щую субстрат и раствор лизирующего фермента, для поддержания заданног значения рН и измерение скорости подачи титранта в реакционную смесь 2 . Однако известный способ не обес печивает получения точного результата, так как не учитывает влияния автолиза субстрата. Кроме того, измерение активности проводится в атмосфере азота, что усложняет процесс измерения и практически способ трудно применим для экспрес анализов. Цель изобретения - повышение точ ности определения активности лизиру щих ферментов. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения активности лизирующих ферментов предусматривающему подачу титранта в реакционную смесь, содержащую субстрат и раствор лизирующего фермента, для поддержания заданного значения рН и измерение скорости подачи титранта в реакционную смесь предварительно перед получением реа ционной смеси раздельно нейтрализуют раствор лизирующего фермента и субстрат до заданного значения рН путем подачи титранта и измеряют скорость подачи последнего в субстрат, вводят раствор лизирующего фермента в субстрат для получения реакционной смеси при достижении скорости подачи титранта в субстрат постоянного значения, а определение активности лизирующих ферментов осуществляют по разности скоростей подачи титранта в реакционную смесь и в субстрат. На фиг. 1 изображена принципиаль ная схема установки рН-стата; на фиг. 2 -5 кривая титрования, где по оси абсцисс отложено время в минутах, а по оси ординат - показания прибора в миллиметрах. . Для автоматического измерения активности лизирующих ферментов используют установку рН-стата с автоматическим регистрированием кривых титрования (фиг, 1). Установка рН-стата включает термостатированную ультратермостатом УТ-10 кювету 1, смонтированную над магнитной мешалкой 2, в которую вставлены электроды 3, соединенные с универсальным ионометром типа ЭВ-74 4, с которого.сигнал, полученный от злектродов 3, подается на блок автоматического титрования типа БАТ-15 5 и далее на автоматическую бюреткудозатор типа Б-701 6. Автоматическая бюретка-дозатор 6 через блок дифференцирования 7 связана с самописцем типа КСП-4 8. Пример 1. Определение лизируквдей активности дрожжелитического ферментного препарата ГЗх. В 100 мл дистиллированной воды растворяют 0,2 г дрожжелитического ферментного препарата ГЗх. рН ферментного раствора доводят до значения рН 8,1 при помощи 0,1 N КОН. В качестве субстрата используют суспензию дрожжей Candida и til is, выращенны;х на сульфитных Щелоках. 4 г сухих дрожжей заливают 100 мл дистиллированной воды и 1 мл 0,4%ного раствора мертиолята для предотвращения роста посторонней микро флоры и термостатируют в суховоздушном термостате в течение 24 ч при З7с. В термостатированную кювету (при 40°С) объемом 14 мл наливают 8 мл ранее приготовленного субстрата и выдерживают 3 мин до достижения заданной температуры. При тщательном перемешивании рН субстрата доводят до 8,1 (IN КОН) и измеряют скорость автолиза субстра: та. Для этого включают самописец, автоматическую бюретку и блок дифференцирования. При помощи самописца записывают скорость подачи титран та 0,035 М КОН из бюретки в кювету 1. Достигнутая постоянная скорость подачи титранта в процессе автолиза субстрата (при рН 8,1) изображена кривой титрования аб (фиг. 2). После этого в ту хсе кювету вводят 2 мл ферментного раствора и продолжают титрование, и записывают скорость подачи титранта, используемого для нейтрализации образовавшихся кислотных эквивалентов в процессе ферментной реакции. По истечении 10-15 мин титрования остигают постоянную скорость подачи титранта и- процесс останавливают путем выключения бюретки, самописца и блока дифференцирования. Ферментная реакция соответствует участку кривой титрования вг (фиг. 2),

Для подсчета активности фермента определяют титр используемой щелочи, выреокенной в микрограмм-эквивалентак на 1 мм (Т .мкг-экв ОН

мм

вету наливают 10 мл 1 М КС1 , устанавливают рН 8,1 и при перемешивании добавляют 0,5 мл 0,01 N НС1 , что равняется 510 г-экв кислоты. При . недвижущейся бумаге самописца оттитровывают введенную кислоту до заданного значения рн (8,1), при этом ре-гистрируют расстояние в миллиметрах,, пройденное пером Сс1мописца ,152,

Активность лизирующего ферментного препарата определяют по формуле

Т( tgot -tgotg) К

ЛА

0,152(6-1)-500

190 ед/г.

где Т

-титр используемой щелочи; мм

-угол наклона кривой титрог мин вания при ферментативной : реакции;

мм

-угол наклона кривой титро- мин вания при самопроизвольном гидролизе субстрата; .

Y -. объем внесенного в субстрат

ферментного раствора, (мл|; К - разведение.

За единицу активности принимают такое количество фермента, которое вьщеляет 1. мкмоль титруемых щелочью кислот в 1 мин.

Пример 2. Определение лизирующей активности культуральной жидкости Streptomyces .albus 176.

Ферментом служит неразведенная . культуральная жидкость S trep to my.ces albus 176. рН культуральной жидкост доводят до 8,5 при помощи 0,1 .N КОЙ В качестве субстрата используют дроки Candida qu i 1 } ie rmo nd i i .

Ход приготовления субстрата п6 примеру 1. В термостатированную ;

кювету при 45°С объемом 14 мл нали вают 8 мл ранее приготовленного субстрата и вьодерживают 3 мин до достижении заданной температуры.

При тщательном перемешивании рН, субстрата доводят до 8,5 (1 N КОН) и измеряют скорость автолиза субстрата. Температура и рН проведеНИИ реакции подобраны оптимальными для действия данного фермента на

субстрат. Ход определения лизи- . рующей а ктивности по примеру 1. Скорость автолиза субстрата C.quilliermbndli tg(i2 мм/мин i Скорость ферментной реакции tgc 4 мм/мин..

визирующая активность культуральной жидкости S. albus 176, вьлчислена по формуле, указанной в примере 1.

(4-1)-1-0,152 3-0.152 2

ЛА

0,228 ед/мл

При проверке достоверности определения проведены сравнительные испытания по определению лизирующей активности ферментных препаратов и культуральной жидкости S. albus 176. В таблице приведены результаты г-рах серий определения активности лизирующих ферменттлх препаратов на субстрат дрожжи Candida uti lis и трех серий определений активности с использованием культуральной жидкости S, а 176 на субстрат дрожжи Candida аиi1Iierm оndii. :

Как видно из приведенных данюлх разброс результатов в параллельных определениях активности лизирующих ферментов соответствует среднему значению коэффициента вариации - 1,33% для предлагаемого метода и 1,93% для метода по прототипу (вьвие известного на 0,7%).

Годовой экономический эффект при внедрении предлагаемого изобретения

12000 руб. в год.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ЛМЗИРУЮЦИХ ФЕРМЕНТОВ, предусматриваклций подачу титранта в реакционную смесь, содержащую субстрат и раствор лизиругадего фермента, для поддержания заданного значения рН и измерение скорости подачи тИтранта в реакционную смесь, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью повышения точности, предварительно перед получением реакционной смеси раздельно нейтрализуют раствор лизирующего фермента и субстрат до заданного значения рН путем подачи титранта и измеряют скорость подачи последнего ,в субстрат, вводят раствор лизирукидего фермента в субстрат для получения реакционной смеси при достижении скорости подачи титранта в субстрат постоянного значения, а определение активности лизирую(Л щих ферментов осуществляют по разности скоростей подачи титранта в реакционную смесь и в субстрат.

едлагаемый

1,3

10,732 252 1,3 6,76 200 1Д 1.2 3,334 166 0,000049 0,661

7ипрант(КОН)

Продолжениа та6л1щы

Фиг.1

т

t.

i

I 38

I

2ff

10-

W1520 2S

иг.2

Врем мм.