Способ определения активности аминоацилазы Советский патент 1982 года по МПК C12N9/78 G01N31/00 

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ АМИНОАЦИЛАЗЫ

1

Изобретение относится к области аналитической химии, а именно к способу определения активности фермента аминоацилазы, который широко применяется для разделения рацемических смесей Н-ацетил-ОЬ-аминокислот. Полученные L-аминокислоты находят применение Е пищевой и химической промышленности, в сельском хозяйстве и медицине.

Известен спектрофотометрическнй метбд определения активности аминоацилазы. Способ основан на измерении изменения интенсивности поглощения субстрата и продукта реакции при 238 нм 1.

Недостатком этого способа являются ограничение концентрации субстрата (0,025 М) и необходимость использования дорогостоящей и сложной аппаратуры.

Известен также нингидриновый способ определения активности аминоацилазы, заключающийся в инкубации фермента с субстратом-Ы-ацетил-О, L-метионином при 37°С в течение 30 мин с последующим прекращением ферментативной реакции в результате выдерживания реакционной смеси в течение 30 мин при 100°С и определением количества выделившейся в. результате реакции L-аминокислоты. L-аминокислоту определяют по ее способности образовывать с нингидрином продукта фиолетово-синего цвета измерением оптической плотности при А 570 нм. Количество освободившейся L-аминокислоты находят по калибровочной кривой 2.

Известный метод достаточно чувствителен, однако его недостатками является большое количество промежуточных операций, в результате чего возрастает общая дли10тельность и трудоемкость анализа (время - 95 мин, количество операций - 9).

Кроме того, недостатком известного способа является ограниченность концентрации (не выше 1-10 М) определяемой L-амино15 кислоты, что обуславливает необходимость разбавления пробы в 50-100 раз и увеличивает ощябку определения.

Целью изобретения является упрощение процесса, сокращение времени анализа и расширение области применения способа.

20

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения активности аминоацилазы, включающему инкубацию фермента с Ы-ацетил-О,L-метионином, прекращение ферментативной реакции деацетилирования М-ацетил-О, L-аминокислоты и определение количества выделившейся L-аминокислоты, причем инкубацию фермеита проводят при содержании субстрата в смеси (5--25)-10 М/мг белка, прекращение реакции деацетилироваиия осуществляется добавлением в реакционную смесь 5-20-кратного избытка формалина, а количество выделивщейся L-аминокислоты определяют потенциометрическим титрованием до значения рН 8,5 ± 0,01.

Предлагаемый способ значительно сокращает время анализа (от 95 мин до 20 мин) и упрощает его (вместо 9 операций - 5).

На чертеже изображена кривая потенциометрического титрования реакционной смеси после гидролиза N-aцeтил-D, L-метионина аминоацилазной стандартным раствором гидроокиси калия.

Происходящее в результате реакции увеличение оптимальной концентрации аминокислоты в пробе дает возможность применять этот метод с точностью ± при контроле производственных процессов разделения рацемических смесей М-ацетил-О,Ь-аминокислот, где обычно применяются 0,5-1 М

0,25

0,25

0,25

В качестве титранта рекомендуется использовать примерно 0,01 н. водный раствор сильного основания, например гидроокиси калия и натрия.

Оптимальная концентрация аминокислоты в пробе от 0,05-0,25 М, что составляет расход титранта при титровании одного мл анализа примерно от 5 до 25 мл. В анализах с небольшим количестком L-аминокислоты следует увеличить объем анализа. Определение L-аминокислоты заключается в следующем: к 1 мл реакционной смеси, содержащей 5-25-102 М L-аминокислоты, добавляют 5-20 мл формалина, нейтрализованного до рН 7,0, и 20 мл дистиллированной воды.

субстраты. В результате исключается многократное ( раз) разбавление пробы. Определение L-аминокислоты предусматривает, что раствор, содержащий L-аминокислоту, обрабатывают формалином. Формалин разрущает беатиновую структуру L-аминокислоты и освобождаются карбоксильные группы, которые можно оттитровать щелочью.

сНгО R-CH-COO - R-CH-COOH

1 + NH,

NHj-

Но кривым потенциометрического титрования установлено, что L-ot-аминокислота количественно оттитруется до рН 8,5.

Для доказания пригодности метода сделана серия экспериментов с искусственными смесями, содержащими L-аминокислоту, натриевые соли Ы-ацетил-О,L-аминокислоты и Н-ацетил-О-аминокислоты и также ацетат натрия, что роответствует различным степеням гидролиза N-aцeтил-D, L-аминокислоты. Искусственные смеси с разными концентрациями компонентов обрабатывали формалином и оттитровали щелочью до рН 8,5. Результаты даны в таблице.

0,2it6 98,35

0,25

Титруют 0,01 М раствором гидроокиси калия до рН 8,5. Параллельно проводят холостой опыт (без фермента).

Активность ацилазы в мкМ-мин/мг вычисляют по формуле

(Vy-Vo)-n-Vp-lo

.СГ)

где А - активность, ед/мг (за единицу активности аминоцилазы принимают количество фермента, катализирующего деацетилирование одного микромоля Ы-ацет-ил-О, L-метионина в одну минуту при температуре 37°С и рН 7,2 в 0,1 М фосфатном буфере); YK - объем КОН, израсходованный для титрования в опыте, мл; VQ -объем КОН, израсходованный для титрования холостого опыта, мл; п - точная концентрация КОН, М; VP - общий объем реакционной смеси, мл t - время инкубации, мин; (| - количество фермента, мг. Пример 1. В термостатированную ячейку к 10 мл 0,1 М Ы-ацетил-О,Ь-метионина, нагретого до 37°С, при перемешивании добавляют 0,2 мл раствора ацилааы (содержание белка 2,06 мг) в 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,2), выдерживают в течение 10 мин. Автоматической пипеткой отбирают 1 мл реакционной смеси и помещают в стакан для тнтрования (V 50 мл), содержащий 5 мл формалина и 20 мл дистиллированной воды. Перемещивают и через 1 мин титруют 0,0099 М раствором гидроокиси калия до рН 8,5, используя блок автоматического титрования БАМ5. Расход титранта (Ук ) составляет 5,9 мл. Холостой опыт (без фермента) проводят аналогично. Расход титранта (V,) составляет 0,5 мл. Активность аминоацилазы вычислили по формуле (I) (5,90-0,50}-0,0099-10,2-10 10- 2,06 NfK/l мин Пример 2. В термостатированную ячейку к 10 мл 0,5 М Ы-ацетил-Ц L-метионина, нагретого до 37°С, при перемещивании добавляют 0,2 мл раствора аминоацилазы (содержание белка 3,20 мг) в 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,2) и выдерживают в течение 10 мин. Автоматической пипеткой отбирают 1 мл реакционной смеси и помещают в стакан для титрования (V 50 мл), содержащий 10 мл формалина и 20 мл дистиллированной воды, перемешивают и через минуту титруют 0,0099 М раствором . гидроокиси калия до рН 8,5. Расход титранта (Vx) составляет 9,25 мл. Холостой опыт (субстрат без фермента) проводят аналогично. Расход титранта (V) 0,72 мл. По формуле (I) вычисляют активность аминоацилазы (9,25-0,72) 0,0099 10,2 10 Ю-3,2 „,-.- мкММин -26, Пример 3. В термостатированную ячейку к 10 мл 1 М Ы-ацетил-О,L-метионина, нагретого до 37°С, при перемешивании добавляют 0,2 мл раствора ацилазы (содержание белка 4,25 мг) в 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,2) и выдерживают в течение 10 мин. Автоматической пипеткой отбирают 1 мл реакциониой смеси и помещают в стакан для титрования (V 50 мл), содержащий 20 мл формалина и 20 мл дистиллированной воды. Перемешивают и- через минуту титруют 0,0099 М раствором гидроокиси калия до рН 8,7 Расход титранта (Vx) составляет 12,15 мл. Холостой опыт (без фермента) проводят аналогично. Расход титранта (Vo) составляет 0,90 мл. Активность ацилазы вычисляют по формуле (I) (12,15 -0,90) 0,0099-10,2 -10 10 4,25 мкМ мин мг Пример 4. В термостатированную ячейку к 10 мл 1 М Ы-ацетил-О,Ь-метионина, нагретого до 37°С, добавляют 1 г ацилазы, иммобилизованной на силохроме, и выдерживают при перемешивании в течение 10 мин. Автоматической пипеткой, отбирают 1 мл реакционной смеси и помещают в стакан для титрования (V 50 мл), содержащий 20 мл формалина и 20 мл дистиллированной воды. Перемешивают и через 1 мин титруют 0,0099 М раствором гидрооксикалия до рН 8,5. Расход титранта (V) составляет 7,9 мл. Холостой опыт (без иммобилизованной ацилазы) проводят аналогично. Расход титранта (Vo) составляет 0,9 мл. Активность иммобилизованной ацилазы вычисляют по формуле (I) (7,90-0,90)-0,0099-Ю-10 10-1 .-„ мкМ мин 46, . Пример 5. В термостатированную ячейку к 10 мл 0,5 М Ы-ацетил-О,L-метионина, нагретого до 37°С, при перемешивании добавляют 0,2 мл раствора аминоацилазы (содержание 2,5 мл) в 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,2) и выдерживают в течение 10 мин. Автоматической пипеткой отбирают 1 мл реакционной смеси и помещают в стакан для титрования (V 50 мл), содержащий 10 мл формалина и 20 мл дистиллированной воды, перемешивают и через минуту титруют 0,0099 М раствором гидроокиси калия до рН 8,5. Расход титранта (V) составляет 7,8 мл. Холостой опыт (субстрат без фермента) проводят аналогично. Расход титранта (Vo) 0,72 мл. Активность аминоацилазы (7,8-0,72)-0,0099-10,2-10 10-2,5 OQ г МК/Ч мин -28,6Технико-экономический эффект -изобретения заключается в сокращении времени анализа в 4 раза и упрощении предлагаемого способа.

Предлагаемый способ позволяет контролировать степень гидролиза Ы-ацетил-О,Ь-аминокислот в случаях, когда известными способами нельзя провести а.наяиз без многократного разведения (50-100 раз).

Формула изобетения

Способ определения активности аминоацилазы, включающий инкубацию фермента с субстратом-Ы-ацетил-О,Ь-метионином, прекращение ферментативной реакции и определение количества выделившейся L-аминокислоты, отличающийся тем, что, с целью упрощения и ускорения процесса и расширения области применения способа, инкубацию осуществляют при содержании субстрата в

рЯ - .

смеси (5-25)10 М/мг белка, ферментативную реакцию прекращают добавлением в реакционную смесь 5-20-кратного избытка формалина, а количество выделившейся L-аминокислоты определяют потенциометрическим титрованием до значения рН 8,5 ± ±0,01.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

bond: Application to the determination of acylase I, Biochim. Biophys. Acta, 1958, vol. 27, 168-172.

2.M. Weetall, C. Detar «Studies of Amino-acylase Immobilized on Porous Ceramic Carriers, Biotechnol. and Bioeng., 1974, vol. 16, 1537,