Способ получения 5-или-3-фосфодиэфиров моно-или олигонуклеотидов Советский патент 1984 года по МПК C07H19/00 C07H21/00 

Изобретение относится к усовершен ствованному способу получения фосфоДИЭФИРОВ1 моно- или олигонуклеотидов которые используются в биоорганичес кой химии и молекулярной биологии дл аффинной модификации белков, нуклеиновых кислот и мембран, в энзимоло гии для вьщеления и изучения субстра ной специфичности ферментов нуклеицо вого обмена, в медицине для направленного воздействия на генетический аппарат клетки. Известно и несколько способов полу чения фосфодиэфиров моно- и олигонуклеотидов, однако имеющиеся способы сложны, низкозффективны и непригодны для работы с микроколичествами дорогостоящего олигонуклеотидного материала. Известен, например, способ получения 5-фосфодиэфиров рибо- и дезоксирибоолигонуклеотидов с помощью дифенилхлорфосфата, согласно которому получение фосфоди&фиров проводят в дв стадии: сначала из три-/г-алкиламмониевой соли олигонуклеотида при действии дифенилхлорфосфата в безводном диметилформам1ще получают активирован ный пирофосфат олигонуклеотида, затем при действии спирта в безводном диметилформамиде в течение 17-24 ч получают необходимьй фосфордиэфир. Выход фосфордиэфиров олигонуклеотидов составляет 18-25% С13. Низкая эффективность метода объясняется наличием побочных процессов расщепления олигонуклеотидов и изомеризации в случае рибо- олигонуклеотидов. Кроме того, перевод олигонуклеотидов сначала в три- п-алкиламмониевые, а затем обратно в водорастворимые соли осложняет осуществление процесса и снижает выход целевых соединений. Известен способ получения фосфордиэфиров через смешанные ангидриды с мезитиленкарбоновой кислотой, который также включает две стадии: получение смешанного ангидрида при действии хлорангидрида мезитиленкарбоновой кислоты на моно- или олигонуклеотид в безводном пиридине, получение целевого фосфордиэфира в пиридине при взаимодействйии смешанного ангидрида с безводным спиртом Г2. Недостатком этого способа является необходимость перевода моно- и олигонуклеотидов в форму, растворимую в органических растворителях, поскольку обе стадии процесса проводятся в безводной среде, а также большая длительность процесса от 2-4 сут. Существенным недостатком способа является также резкое уменьшение выходов фосфодиэфиров при увеличении длины йлигодезоксирибонуклеотида. Так, если в случае фосфордиэфиров мононуклеотидов выходы составляют в среднем 80% (в некоторых случаях 50-60%), то уже в случае динуклеотидов выходы соответствующих фосфордиэфиров падают до 60%. Для получения фосфодиэфиров олигонуклеотидов рибо-ряда способ непригоден, так как при действии хлорангидрида мезитиленкарбоновой кислоты на олигорибонуг клеотид происходит расщепление и изомеризация межнуклротидных связей. Известен способ получения фосЗ)Ордиэфиров олигонуклеотидов с применением фермента - полинуклеотидфосфорилазы, который состоит в том, что фосфордиэфир получают на мононуклеотиде и затем проводят наращивание олигонуклеотида ферментативным путем. Уже на первой стадии процесса при получении п-нитрофенилового эфира мононуклеотида в безводном пиридине при действии дициклогексилкарбодиимида в течение 8 сут, выход составляет 20-50%. После проведения ферментативных стадий процесса выход целевого фосфордиэфира олигонуклеотида не превьш ает 10% Сз 3. Недостатками данного способа являются низкая эффективность, необходимость использования большого числа дорогостоящих ферментов и невозможность получения таким путем фосфодиэфиров олигонуклеотидов дезокси-ряда. Наиболее близким к изобретению по технической сущности является способ получения 3- или 5-фосфодиэфиров моно- Или олигонуклеотидов, в частности 4-нитрофениладенозин-5 фосфата, 4-нитро ениладенилш1-3-5 гуанозин-5-фосфата, 4-нитрофениладенилил-3 -5-гуанилил-З -5-тимидин-5 -фосфата, заключакицийся в конденсации нуклеотидного компонента (пиридиниевой или три-м-алкиламмонийной соли моно- или олигонуклеотида) с безводным спиртом в безводном органическом растворителе (пиридин или диметилформамид) в присутствии производного карбодиимида (дициклогексилкарбодиимида). Выходы целевых продуктов 50-70%. Время процесса 2-8 сут. При получении метиловых эфи ров мононуклеотидов и коротких 2-4звенных олигодезоксирибонуклеотидов в безводном метаноле выходы фосфодиэфиров составляют 80-90% за 2 Недостатками указанного способа являются резкое уменьшение выхода фосфодиэфиров олигонуклеотидов при увеличении длины олигонуклеотидной цепи в результате параллельно протекающих процессов модификации нуклеодитного материала, которые приводят к необрат Шым потерям и деградации олигонукл отидов, необходимость проведения процесса в безводном органическом растворителе, что связано с трудоемкой и низкозффективной операцией перевода нуклеотидного мате,риала сначала в три-п-алкиламмониевую форму, а по окончании процесс - обратно в водорастворимую форму. Целью изобретения является упрощение процесса и увеличение выхода целевого продукта. Указанная цель достигается тем, что согласно способу получения З или 3- фосфодиэфиров МОНО- или ОЛИ- гонуклеотидов, конденсацию нуклеотид ного компонента со спиртом осуществляют в водной среде в присутствии производного карбодиимида, используя в качестве нуклеотидного компонента водорастворимые соли моно- и олигонуклеотидов и в качестве,производног карбодиимида 1-зтнл-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид. Выход целевых продуктов составляет 80-100%. Время процесса 1-20 ч в зависимости от природы спирта. Преимзщества предлагаемого способ состоят в использовании в качестве конденсирующего агента водорастворимого карбодиимида, что позволяет про водить процесс в воде и работать с водорастворимыми солями олигонуклеот дов. В результате этого отпадает необходимость дважды переводить олигонуклеотид из одной формы в другую, при этом исключаются неизбежные ране трудноконтролируемые потери дорогост ящего нуклеотидного материала и впер вые появляется возможность работать с микроколичествами олигонуклеотидов РНК и ДНК. Кроме того, способ позволяет высо коэффективно получать фосфоэфиры моно- и олигонуклеотидов любой длины и состава избирательного по концевым фосфатным группам, так как в водной среде не протекает никаких побочных процессов, связанных с модификацией гетероциклическчх оснований, межнуклеотидных фосфатных групп и изоМеризацией и расщеплением фосфодиэфирных связей. Предлагаемый способ позволяет получать фосфодиэфиры моно- или олигонуклеотидов со спиртами различной природы - фенолами, алифатическими, аралифатическими и многоатомными спиртами, т.е. является более общим по сравнению с известным. Преимуществом предлагаемого способа является также простота проведения процесса и простота выделения полученных соединений, поскольку исключаются такие операции, как экстракция, высаживание, неизбежно приводящие к некоторым потерям- дорогостоящего нуклеотидного материала. Пример 1. ККа-соли dpT (10 OEjgo, 1 мкмоль, коммерческий препарат в виде порошка) добавляют 100 мкл 4 М водного раствора метилового спирта и 10 мг (50 мкмоль) 1-этил-3(3-диметкламино-пропил) карбодиимида. Через 0,5 ч при 20 С полученную смесь фракционируют с помощью электрофореза на бумаге в 0,05 М триэтиламмонийном буфере с рН 7,5-8,0 (фиг. 1). Выход метилового эфира дезoкcитим щилoвoй кислоты практически количественный. Соответствукяцие фосфодиэфиры dpT с другими спиртами (см. таблицу) получены по аналогичной методике. Пример 2. Водный раствор d(pTCTAG) в виде NH -соли (1 , 0,02 мкмоль) упаривают до масла, добавляют 100 мкл 3 М водного раствора метилового спирта и 10 мг (50 мкмоль) 1-этил-З(3-диметиламинопропил) карбодиимида. Вьщерживают смесь в течение 1,5 ч при.20 С и затем метиловый эфир пентануклеотида выделяют колоночной анионообменной хроматографией с выходом 95% (фиг. 2). Фосфодиэфиры пентануклеотида с другими спиртами (см. таблицу) получены по аналогичной методике. Пример 3. Водный раствор (pA)-j в виде Na-соли (2 0,02 мк-моль) упаривают до масла и добавляют 100 мкл 4 М водного раствора метилового спирта и 10 мг . (50 мкмоль) 1-этил-З(3-диметиламино}112t266«

пропил)карбодиимида, Вьщержяваютмасла и дооавляют 100 мкл 4 М водносмесь 2 ч при и полученный раствора метилового спирта и 10мг

ловый эфир гептадениловой кислоты(50 мкмоль) 1-этил-3(ЗгДимётиламиновыделяют колоночной анионообменнойпропил) карбодиим да. Выдерживают

хроматографией с выходом 97% (фиг.З). 5смесь 2,5 ч при и полученный

Фосфодиэфиры (рА), с другими спир-метиловый эфир декануклеотида вьщелятами (см. таблицу) получены по ана- ют колоночной анионообменной хроматологичной методике.графией с выходом 90% ,(Фиг. 4).

П р и м е р 4. Водный раствор Фосфодиэфиры декануклеотйда с друd(TGGCCAAGCTp) в виде ЫН -соли гими спиртами (см. таблицу) получены

(1 , 0,01 мкмоль) упаривают допо аналогичной методике. Ф(/А2 t/е.З ОВъе/ y /oeffma, 15го y focfffner, . 0.08 Ф(/е.1,г Ооъем sjtwfff//rTa, м/

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ зФОСФОДИЭФИРОВ МОНО- Ш1И ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ путем конденсации нуклеотидного компонента со спиртом в растворителе в присутствии производного карбодиимида, отличаю щи йс я тем, что, с целью упрощения прог: цесса и увеличения выхода целевого продукта, процесс осуществляют в водной среде, используя в качестве нуклеотидного компонента водорастворимые соли МОНО- или олигонуклеотидов и в качестве производного карбодиимида 1-э тил-3