ОЛИГОДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОТИДЫ И СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 1998 года по МПК C07H21/04 

Изобретение относится к биоорганической химии, а именно к получению олигодезоксирибонуклеотидов общей формулы:
RO-X-Y (I)
Y-X-OR (II)
Y-X-ORO-X-Y (III)
где
R - остатки олигодезоксирибонуклеотидов;

n = 2-12

которые могут использоваться для ковалентного присоединения к природным и синтетическим биополимерам с целью создания новых аналогов субстратов для изучения механизмов действия ферментов нуклеинового обмена в энзимологии; в антисенсовой биотехнологии для ингибирования экспрессии генетического материала в качестве потенциальных противовирусных и противоопухолевых препаратов в структурно-функциональных исследованиях белков и нуклеиновых кислот; в гибридизационном анализе нуклеиновых кислот; а также в других различных молекулярно-биологических исследованиях биополимеров.

Аналогами предложенных соединений, обладающими сходными структурой и свойством ковалентно присоединяться к биополимерам, являются олигонуклеотиды типа (IV):

где
R' - остаток олигодезоксирибонуклеотида.

Указанные соединения (IV) могут ковалентно присоединяться с помощью активной алкилирующей группировки к различным нуклеофилам в реакционной смеси, в том числе к нуклеофильным центрам ДНК, РНК и белков [1].

Недостатком этого типа соединений является их высокая реакционная способность. Это приводит к тому, что алкилированию могут подвергаться нуклеофильные центры буферов (ацетат, фосфат), самих реагентов (IV), а также к снижению селективности реакции ковалентного присоединения (IV) к биополимерам [2]. Активная группа в соединении (IV) представлена аналогом азотистого иприта, являющимся достаточно дорогостоящим и труднодоступным препаратом. Кроме того, отсутствие спейсерной группы ограничивает сферу применения (IV).

Способ получения соединения (IV) заключается в обработке N-метилимидазолидов олигодезоксирибонуклеотидов (IV) хлоргидратом 4-[N-(2-хлорэтил)-N-метиламиино]бензиламина [3]. Реакция протекает по следующей схеме:

Сами олигодезоксирибонуклеотиды
получают постадийной конденсацией мономерных компонентов олигонуклеотидного синтеза, осуществляемой по стандартной методике на модифицированном силикагеле. Для получения соединения (VI) олигодезоксирибонуклеотид (V) переводят в триэтиламмониевую (для дитетрануклеотидов) или цетилтриэтиламмониевую (для более длинных олигодезоксирибонуклеотидов с длиной нуклеозидных звеньев более 4) соли, поскольку реакцию проводят в безводных органических растворителях. Выход целевого соединения (IV) составляет 75-80%.

Недостатком описанного способа получения является то, что особенность конструкции модифицированного силикагеля, на котором проводятся постадийные конденсации мономерных компонентов олигонуклеотидного синтеза, не позволяет вводить активную группировку на 3'-концевую фосфатную группу олигодезоксирибонуклеотида, а также одновременно на 3'- и 5'-концевые фосфатные группы. Другим недостатком является наличие дополнительной стадии перевода олигодезоксирибонуклеотидов в триэтил- или цетилтриэтиламмониевые соли с целью получения их N-метилимидазолидов (V), поскольку эту реакцию проводят в безводной органической среде. Кроме того, ковалентное присоединение активной группировки осуществляется после синтеза олигодезоксирибонуклеотида с выходом 75-80%.

Задача изобретения - получение олигодезоксирибонуклеотидов общей формулы
RO-X-Y (I)
Y-X-OR (II)
Y-X-ORO-X-Y (III)
где
R - остатки олигодезоксирибонуклеотидов;

n = 2-12

в качестве активных зондов, отличающихся от аналога большей легкостью получения, более высокой гидролитической устойчивостью и наличием спейсерной группы, что делает эти зонды более доступными и удобными для практического использования и расширяет сферу их применения, и разработка способа их получения.

Соединения (I-III) получаются путем введения через спейсерное звено на 5'- либо (и) 3'-конец олигонуклеотида активированной фосфатной группы. Образующиеся активные олигонуклеотидные зонды превосходят по гидролитической устойчивости аналог (IV), что обеспечивает стабильность соединений при работе с ними. Наличие спейсерной группы увеличивает эффективность ковалентного присоединения активных зондов к биополимерам и позволяет осуществить их селективное взаимодействие с комплементарными участками нуклеиновых кислот, которое протекает с образованием ковалентной связи.

Способ получения соединений (I-III) заключается в постадийной конденсации 5'-0-диметокситритил-2'-дезоксинуклеозид-3'-0-β-цианэтил-N, N-диизопропиламидофосфитов, являющихся стандартными мономерными компонентами амидофосфитного синтеза олигодезоксирибонуклеотидов. Мономерные компоненты вводили в последовательности, заданной структурой олигодезоксирибонуклеотида. Синтез проводили в автоматическом режиме в автомате-синтезаторе по стандартной методике [4] , используя в качестве полимерного носителя специально сконструированный модифицированный полимер, содержащий способные к β -элиминированию в щелочной среде β -этилсульфоновые группы.

Спейсерное звено, содержащее концевую фосфатную группу, вводили либо (и) вначале постадийной конденсации, либо (и) в конце ее, также по стандартной методике, используя его в виде стандартного мономерного амидофосфитного компонента, полученного по следующей схеме:

Выходы на каждой стадии последовательных конденсаций составляли 96-99%.

После окончания конденсаций в процессе удаления защитных групп с синтезированных олигонуклеотидов происходит реакция β-элиминирования, приводящая к получению соединений (VIII), содержащих концевую фосфатную группу, присоединенную к олигонуклеотиду через спейсерное звено, например:

где
R - остатки олигодезоксирибонуклеотидов;

Активацию этой фосфатной группы, то есть собственно получение соединений (I-III), проводили путем обработки соединений (VIII) 1- этил-3(3'-диметиламинопропил)карбодиимидом, либо N-оксибензотриазолом в присутствии карбодиимида. Реакция протекает в водных буферных растворах (pH 5,0 - 6,0) с количественным выходом.

Предложенный способ отличается от известного тем, что в качестве модифицированного силикагеля используют специально сконструированный полимер, содержащий способные к β-элиминированию в щелочной среде β-этилсульфоновые группы, а в качестве мономерных компонентов олигонуклеотидного синтеза берут наряду с 5'-0-диметокситритил-2'-дезоксинуклеозид-3'-0-β-цианэтил-N,N-диизопропиламидофосфитами также и диметокситритильные производные 0-β-цианэтил-N, N-диизопропиламидофосфитов алифатических гликолей или 1,2-дидезокси-D-рибофуранозы, причем последние добавляют либо(и) вначале постадийной конденсации, либо(и) в конце ее, в качестве активирующих зон соединений используют 1-этил-3(3'-диметиламинопропил)карбодиимид или N-оксибензотриазол, которые присоединяют с количественными выходами в водной среде.

Использование специально сконструированного полимера, содержащего β-этилсульфоновые группы, позволяет вводить спейсерную группу, а, следовательно, и присоединять активирующие зонд соединения как на 3'-, так и одновременно на 3'-, 5'-концы олигодезоксирибонуклеотидов, что имеет важное значение дальнейшего использования активных олигодезоксирибонуклеотидных зондов в различных областях биоорганической химии и молекулярной биологии.

Использование в постадийной конденсации наряду с 5'-0-диметокситритил-2'-дезоксинуклеозид-3'-0-β-цианэтил-N, N-диизопропиламидофосфитами также и диметокситритильных производных 0-β-цианэтил-N, N-диизопропиламидофосфитов алифатических гликолей и 1,2-дидезокси-D-рибофуранозы дает возможность в процессе автоматического синтеза олигодезоксирибонуклеотидов вводить спейсерные полиметиленовые группы с различным числом метиленовых звеньев, а поскольку именно к спейсерному звену присоединяется активная группировка, то это придает дополнительную конформационную подвижность этой группировке и тем самым значительно расширяет спектр действия активных зондов (I-III). Использование в качестве активирующих зонд соединений 1-этил-3'(3'-диметиламинопропил)карбодиимида или N-оксибензотриазола позволяет получить активные зонды, отличающиеся от прототипа большей стабильностью и устойчивостью к нуклеофильным центрам буферных растворов и практически не взаимодействующие с нуклеофильными центрами самих реагентов. Кроме того, присоединение этих активирующих зонд соединений проводят в водной среде, что исключает трудоемкую стадию перевода олигодезоксирибонуклеотидов в безводную органическую среду. И, наконец, 1-этил-3(3'-диметиламинопропил)карбодиимид и N-оксибензотриазол присоединяются к олигодезоксирибонуклеотиду с количественным выходом (в случае прототипа выход составляет 75-80%).

Пример 1.

Синтез


18 мг модифицированного силикагеля, содержащего β-этилсульфоновые группы, обрабатывали 0,2 мл 0,1 М раствора 1-диметокситритил-3-0-β-цианэтил-N,N-диизопропиламидофосфита пропиленгликоля и 0,2 мл 0,5М раствора тетразола в ацетонитриле. Далее реакцию проводили в стандартном режиме [5] на автомате-синтезаторе "Виктория-4М". Затем осуществляли постадийные конденсации 5'-диметокситритил-2'-дезоксинуклеозид-3'-0-β-цианэтил-N, N-диизопропиламидофосфитов, используя их в порядке, обусловленном первичной структурой соединения (VII). Выход на каждой стадии конденсации составил 98%. После удаления защитных групп 5'-0-диметокситритильное производное синтезированного олигодезоксирибонуклеотида

выделяли обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) (хроматограф Altex, США; носитель Диасорб C16Б 7 мкм; размер колонки 4•250 мм, в градиенте концентрации (0-40%) ацетонитрила в 0,1 М ацетате аммония (pH 6,5) за 60 мин при температуре 45^oC). Удаление диметокситритильной группы проводили 80%-ным водным раствором уксусной кислоты (30 мин). Чистоту полученного соединения

подтверждали обращенно-фазовой и ион-парной ВЭЖХ. Хроматографические характеристики соединения (VIII) представлены в таблице. Чистота соединения (VIII) составила 97%. Его первичную структуру подтверждали секвенированием по методу Максама-Гилберта (анализ нуклеотидной последовательности октануклеотида (VII), электрофорез в 20% ПААГ в 7 М мочевине (фиг. 1). Наличие концевой фосфатной группы подтверждали путем ферментативного гидролиза (VIII) фосфомоноэстеразой. На фиг. 2 - хроматографический профиль элюции продуктов реакции гидролиза модифицированного октануклеотида (VIII) фосфомоноэстеразой (б); профиль элюции смеси продуктов реакции гидролиза (VIII) фосфомоноэстеразой с исходным соединением (VIII) (a). Анализ проводился методом ион-парной ВЭЖХ. Наличие спейсерного триметиленового звена подтверждали сравнением хроматографической подвижности продуктов исчерпывающего гидролиза соединения (VIII) смесью фосфомоноэстеразы ФМЭ (a) и фосфодиэстеразы змеиного яда (ФДЭ) с подвижностью специально синтезированного для этой цели модифицированного нуклеотида - оксипропилового эфира цитидин-3'-фосфата (dCp O(CH₂)₃OH); гидролизат октаннуклеотида (VIII) + dC^*(б); dC*-гидроксипропиловый эфир дезоксирибоцитизин-3'-фосфата. Анализ проводился методом обращено-фазовой ВЭЖХ (фиг. 3). Активированный олигонуклеотидный зонд (VII) получали обработкой олигонуклеотида (VIII) IM раствором N-оксибензотриазола в 40% диметилформамиде (pH 5,0) в присутствии 0,5М 1-этил-3(3'-диметиламинопропил)карбодиимида в течение 2,5 ч. при 10^oC. Соединение (VII) выделяли из реакционной смеси высаживанием перхлоратом лития в ацетоне. Выход его был практически количественным. На фиг. 4 - хроматографический профиль элюции реакционной смеси, образующейся при получении активного олигонуклеотидного зонда (VII) (a); профиль элюции исходного олигонуклеотидного зонда (VIII) (б). Анализ проводили методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.

Аналогично были получены, выделены и охарактеризованы олигонуклеотиды (IX-XIII, XVIII-XX), хроматографические и некоторые другие характеристики которых представлены в таблице, а также их активные N-оксибензотриазоловые эфиры.

Активный олигонуклеотидный зонд (VII') получали обработкой олигонуклеотида (VIII) 0,2М 1-этил-3(3'-диметиламинопропил)карбодиимидом. Реакцию проводили в 0,05М морфолиноэтансульфонатном буфере (pH 6,0), содержащем 0,02М MgCl₂ в течение 3 ч. при 10^oC. Аналогично получали активные производные с карбодиимидом соединений (IX-XIII, XVIII-XX).

Пример 2.

Синтез


На 10 мг полимера проводили синтез указанного олигонуклеотида по стандартной методике, используя в постадийных конденсациях мономерные компоненты амидофосфитного синтеза в порядке, обусловленном первичной структурой соединений (XXI и XXI'). На последней стадии конденсации для введения спейсерного триметиленового звена полимер с олигонуклеотидом обрабатывали по стандартной методике 0,2 мл 0,1М раствором 1-диметокситритил-3-0-β-цианэтил-N,N-диизопропиламидофосфита пропиленгликоля и 0,2 мл 0,5М раствором тетразола в ацетонитриле. Далее введение фосфатной группы проводили аналогично с 2-[2-(4-метокситротилокси)этилсульфонил] этил-0-β-цианэтил-N,N-диизопропиламидофосфитом. После удаления защитных групп по стандартной методике олигонуклеотид (XIV) выделяли обращенно-фазовой ВЭЖХ (хроматограф Altex, США; носитель Диасорб C16, 7 мкм; размер колонки 4•250 мм, в градиенте концентрации (0-40%) ацетонитрила в 0,1 М ацетате аммония (pH 6,5) за 60 мин при температуре 45^oC).

Хроматографические и некоторые другие характеристики соединения

представлены в таблице.

Активные олигонуклеотидные зонды (XXI) и (XXI') получали путем обработки этого соединения N-оксибензотриазолом и 1-этил-3(3'-диметиламинопропил)карбодиимидом, как описано в примере 1.

Пример 3.

Синтез


18 мг модифицированного силикагеля, содержащего β-этилсульфоновые группы, обрабатывали 0,2 мл 0,1 M раствора 1-диметокситритил-3-N,N-дизопропиламидофосфита пропиленгликоля в ацетонитриле. Реакцию поводили в стандартном режиме [5] на автомате-синтезаторе "Виктория 4M". Затем осуществляли постадийные конденсации 5'-0-диметокситритил-2'-дезоксинуклеозид-3'-N, N- диизопропиламидофосфитов, используя их в порядке, обусловленном первичной структурой соединений (XXII и XXII'). На последней стадии конденсации проводили повторную обработку 0,2 мл 0,1 M раствора 1-диметокситритил-3-0-β-цианэтил-N,N-диизопропиламидофосфита пропиленгликоля в ацетонитриле. Выход на каждой стадии конденсации составил 97%.

Чистота олигонуклеотида

после удаления защитных групп и последующего выделения методом ВЭЖХ составила 95%. Его структуру подтверждали аналогично тому, как описано в примере 1. В таблице представлены хроматографические и некоторые другие свойства соединения (XV). Аналогично были получены, выделены и охарактеризованы олигонуклеотиды (XVI) и (XVII), характеристики которых также представлены в таблице.

Активные олигонуклеотидные зонды (XXII) и (XXII') были получены с количественным выходом путем обработки соединения (XV) N-оксибензотриазолом и 1-этил-3(3'-диметиламинопропил)-карбодиимидом соответственно, как описано в примере 1.

Испытания активных олигонуклеотидных зондов.

Проведенные исследования по изучению гидролитической устойчивости синтезированных активных олигонуклеотидных зондов показали, что эти соединения устойчивы в водных буферных растворах (pH 6,0-8,5), не содержащих сильных нуклеофилов, по крайней мере в течение 48 ч. Они не вступают во взаимодействие с нуклеофильными группами самих реагентов и компонентов буферных растворов. В то же время в присутствии таких нуклеофилов как первичные, вторичные и третичные амины, фосфат-анион, эти соединения фосфорилируют последние с образованием соответствующих фосфоамидов и пирофосфатов. В качестве нуклеофилов могут выступать функциональные группы аминокислот, пептидов и белков (как N- и C-концы, так и нуклеофильные группы боковых радикалов), нуклеиновых кислот в том случае, когда реагирующие группировки стерически сближены. В результате реакции активный олигонуклеотидный зонд ковалентно присоединяется к биополимерам. Это свойство активных зондов может быть использовано в энзимологии для изучения механизма действия ферментов нуклеинового обмена; в антисенсовой биотехнологии для ингибирования экспрессии генетического материала в качестве потенциальных противовирусных и противоопухолевых препаратов; в структурных исследованиях белков и нуклеиновых кислот; в гибридизационном анализе нуклеиновых кислот, а также в других молекулярно-биологических исследованиях биополимеров.

Свойства активных олигонуклеотидных зондов иллюстрируются следующими примерами.

Пример 4. К 1 о.е. соединения (VII) добавили 50 мкл 1 M водного раствора лизина (pH 9,6). Реакцию проводили при 8^oC в течение 6 ч.

Реакционную смесь анализировали ион-парной ВЭЖХ после предварительной гель-фильтрации на биогеле P-2 (200-400 меш). Выход лизинового производного олигонуклеотидного зонда составил 85% (фиг. 5). Природу образующейся фосфоамидной ковалентной связи между зондом и лизином подтверждали путем избирательного гидролиза фосфоамидной связи (15% CH₃COOH, 50^oC, 40 мин) с последующим сравнением хроматографической подвижности гидролизата с подвижностью исходного олигонуклеотида (VIII). На фиг. 5 - хроматографический профиль элюции реакционной смеси, образующейся при получении лизинового производства олигонуклеотидного зонда (VIII)(а); профиль элюции исходного олигонуклеотидного зонда (VIII)(б); Анализ проводили методом ион-парной ВЭЖХ.

Пример 5. 1 о.е. олигонуклеотидного зонда (VIII) растворили в 50 мкл 0,7 M раствора N-α-бензоил-L-аргиниламида в 35%-ном водном диметилформамиде (pH 6,0), добавили 7 мг 1-этил-3(3'-диметиламинопропил)-карбодиимида. Реакцию проводили при 8^oC в течение 10 ч. Реакционную смесь анализировали так же, как в примере 4. Выход производного аргинина с олигонуклеотидным зондом составил 36% (фиг. 6). Природу образующейся ковалентной связи подтверждали, как в примере 4.

На фиг. 6 - хроматографический профиль элюции реакционной смеси, образующейся при взаимодействии N-α-бензоил-L-аргиниламида с зондом (VIII)(а); профиль элюции исходного зонда (VIII)(б); анализ методом ион-парной ВЭЖХ.

Пример 6. К 1 о.е. соединения (VIII) добавили 50 мкл 1 M раствора лейцилглицина в 40%-ном водном диметилформамиде (pH 7,0). Реакцию проводили при 8^oC в течение 10 ч. Реакционную смесь анализировали так же, как в примере 4. Выход производного олигонуклеотидного зонда с лейцилглицином составил 98% (фиг. 7). Природу образующейся ковалентной связи подтверждали, как в примере 4.

На фиг. 7 - хроматографический профиль элюции реакционной смеси, образующейся при получении дипептидного производного зонда (VIII)(а); профиль элюции исходного зонда (VIII)(б); анализ - методом ион-парной ВЭЖХ.

Пример 7. 0,249 о.е. олигонуклеотидного зонда (VII) смешивали с эквимолярным количеством комплементарного олигонуклеотида 5'd(GTAAAACGACGGCCAGT)3', смесь растворяли в 90 мкл 0,2 M водного раствора N-(2-гидроксиэтил)пиперазин-N'-2-этаносульфоната (pH 8,2), содержащего 0,1 M MgCl₂. Реакцию проводили при 10^oC в течение 48 ч, реакционную смесь осаждали из раствора 2% перхлоратом лития в ацетоне и анализировали электрофорезом в 20% полиакриламидном геле, содержащем 7 M мочевину при постоянном напряжении 1000 B. Выход ковалентно-связанного комплекса зонд-олигонуклеотид составил 40%.

На фиг.8 - электрофореграмма реакционных смесей, образующихся в результате ковалентного присоединения октануклеотида TGGCCGTCp-X к гептадекануклеотиду GTAAAACGACGGCCAGT.

1 - ³²pGTAAAACGACGGCCAGT,
2 - реакционная смесь, образующаяся при активации фосфатной группы октануклеотида с помощью 1-этил-3(3'-диметиламинопропил)карбодиимида

3 - реакционная смесь, образующаяся при активации фосфатной группы октануклеотида с помощью N-оксибензотриазола

Реакцию проводили в течение 2 сут.

Таким образом, предлагаемое изобретение не известно из уровня техники, явным образом не следует из него и может быть без изменения использовано в отраслях народного хозяйства.

Использование: в качестве активных зондов в структурно-функциональных исследованиях белков и нуклеиновых кислот, в гибридизационном анализе нуклеиновых кислот или в молекулярно-биологических исследованиях биополимеров. Сущность изобретения: продукт - олигодезоксирибонуклеотиды ф-лы Y'-X'ORO-X-Y, где R - остаток олигодезоксирибонуклеотида, имеющего от 8 до 30 звеньев, X', X - ф-ла 1, 2 или H, n - 2-12, Y', Y - ф-ла 3, 4, причем X и X' не могут одновременно H, и если X(X') - H, то Y(Y') - отсутствует. Реагент 1: 5'-О-диметокситритил-2'-дезоксинуклеозид-3'- О-бета-цианэтил-N,N-диизопропиламидофосфит. Реагент 2: диметокситритильное производное О-бета-цианэтил-N, N-диизопропиламидофосфит алифатических гликолей HO(CH₂)_nOH. Реагент: 3: 1,2-дидезокси-D-рибофураноза. Условия: постадийные конденсации в присутствии активирующих соединений - 1-этил-3(3'-диметиламмонийпропил)карбодиимида или 1-оксибензотриазола. Структура ф-л 1, 2, 3 и 4

n=2-12

2 с.п. ф-лы, 8 ил., 1 табл.

1. Олигодезоксирибонуклеотиды общей формулы I
Y¹-X¹-ORO-X-Y,
где R - олигодезоксирибонуклеотид, имеющий от 8 до 30 звеньев,
X', X -

n = 2 - 12;
Y¹, Y -


причем X¹ и X не могут быть одновременно H и если X (X¹) - H, то Y (Y¹ отсутствует. 2. Способ получения олигодезоксирибонуклеотидов по п.1, отличающийся тем, что на модифицированном силикагеле, содержащем β-этилсульфоновые группы, проводят постадийные конденсации 5'-O-диметокситритил-2'-дезоксинуклеодиз-3'-O-β-цианэтил-N,N-диизопропиламинофосфитов и диметокситритильных производных O-β-цианэтил-N,N-диизопропиламидофосфитов алифатических гликолей общей формулы
HO(CH₂)_nOHOH,
где n = 1 - 12,
и 1,2-дизезокси-D-рибофуранозы, причем последние добавляют и/или в начале постадийной конденсации и/или в конце ее, а в качестве активирующих зонд соединений, используют 1-этил-3(3'-диметиламинопропил)карбодиимид или 1-оксибензотриазол.