ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение относится к области органической химии, в частности к новым олигонуклеотидным аналогам, которые проявляют антисенс-активность или антигенную активность, обладают превосходной стабильностью или проявляют превосходную активность в качестве детектирующего агента (зонда) для специфического гена или в качестве праймера для начальной амплификации, и к новым нуклеозидным аналогам, которые представляют собой промежуточные соединения для их получения.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Полагают, что олигонуклеотидные аналоги, обладающие превосходной антисенс- или антигенной активностью и стабильные в организме, могут оказаться полезными фармацевтическими препаратами. Кроме того, олигонуклеотидные аналоги, обладающие высокой способностью к образованию стабильного комплекса с ДНК или мРНК, являются полезными в качестве детектирующих агентов для специфических генов или в качестве праймеров для начальной амплификации.
Напротив, известно, что олигонуклеотиды природного происхождения быстро распадаются под действием различных нуклеаз, присутствующих в крови и клетках. В некоторых случаях, олигонуклеотиды природного происхождения не способны обеспечить достаточную чувствительность при использовании в качестве детектирующих агентов для специфических генов или в качестве праймеров для начальной амплификации из-за ограничений их сродства с комплементарными последовательностями.
Для того, чтобы преодолеть эти недостатки, были получены различные, не встречающиеся в природе олигонуклеотидные аналоги и были предприняты попытки их использования в качестве фармацевтических препаратов или детектирующих агентов для специфических генов. Известные примеры таких не встречающихся в природе олигонуклеотидных аналогов включают олигонуклеотиды, в которых атом кислорода, связанный с атомом фосфора фосфородиэфирной связью, замещен атомом серы; олигонуклеотиды, в которых указанный атом кислорода замещен метиленовой группой; олигонуклеотиды, в которых указанный атом кислорода замещен атомом бора, и олигонуклеотиды, в которых функциональная группа сахара или основная функциональная группа олигонуклеотида является химически модифицированной. Например, фирма ISIS Corp. разработала олигонуклеотид тиоатного типа ISIS2922 (Vitravene) в качестве терапевтического агента для лечения цитомегаловирусного воспаления сетчатки человека, и в США олигонуклеотид ISIS2922 поступил на свободный рынок.
Однако потенциальная эффективность антисенс-активности или антигенной активности указанных выше, не встречающихся в природе олигонуклеотидных аналогов, а именно способность к образованию стабильного комплекса с ДНК или мРНК, стабильность к различным нуклеазам и проявление нежелательных побочных эффектов из-за неспецифичного связывания с различными белками в организме, делает актуальной разработку в не встречающихся в природе олигонуклеотидных аналогах, обладающих большей стабильностью в организме, имеющих низкую вероятность нежелательных побочных эффектов и высокую способность к образованию стабильных комплементарных цепей.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Авторы настоящего изобретения в течение длительного периода времени провели интенсивное исследование не встречающихся в природе олигонуклеотидных аналогов, имеющих превосходную антисенс- или антигенную активность, превосходную стабильность в организме и низкую вероятность нежелательных побочных эффектов. В результате этого исследования, авторы обнаружили, что олигонуклеотидные аналоги или нуклеозидные аналоги, имеющие простую эфирную связь в указанных молекулах, являются полезными в качестве антисенс- или антигенных фармацевтических препаратов, имеющих превосходную стабильность, детектирующего агента (зонда) для специфического гена, праймера для начальной амплификации или в качестве промежуточного соединения для их получения, и выполнили настоящее изобретение.
В последующем настоящее изобретение будет подробно описано.
Новые нуклеозидные аналоги настоящего изобретения представляют собой соединения формулы (1)
в которой R1 и R2 являются одинаковыми или различными заместителями и представляют собой атом водорода, группу, защищающую гидроксил, группу фосфорной кислоты, защищенную группу фосфорной кислоты или группу -P(R3)R4 [в которой R3 и R4 являются одинаковыми или различными и представляют собой гидроксильную группу, защищенную гидроксильную группу, меркаптогруппу, защищенную меркаптогруппу, аминогруппу, алкоксигруппу, имеющую от 1 до 4 атомов углерода, алкилтиогруппу, содержащую от 1 до 4 атомов углерода, цианоалкоксигруппу, содержащую от 1 до 5 атомов углерода, или аминогруппу, замещенную алкильной группой, содержащей от 1 до 4 атомов углерода;
А представляет собой алкиленовую группу, имеющую от 1 до 4 атомов углерода, и
В представляет собой пурин-9-ильную группу, 2-оксо-пиримидин-1-ильную группу или замещенную пурин-9-ильную группу или замещенную 2-оксопиримидин-1-ильную группу, имеющую заместитель, выбранный из следующей альфа группы,
или их соли.
Олигонуклеотидные аналоги настоящего изобретения представляют собой олигонуклеотидные аналоги, которые имеют одну, или две, или более структур формулы (2)
в которой А представляет собой алкиленовую группу, имеющую от 1 до 4 атомов углерода, и В представляет собой пурин-9-ильную группу, 2-оксопиримидин-1-ильную группу, или замещенную пурин-9-ильную группу, или замещенную 2-оксопиримидин-1-ильную группу, имеющую заместитель, выбираемый из следующей альфа-группы,
или их фармакологически приемлемые соли.
(альфа-группа):
гидроксильная группа,
защищенная гидроксильная группа,
алкоксигруппа, имеющая от 1 до 4 атомов углерода,
меркаптогруппа,
защищенная меркаптогруппа,
алкилтиогруппа, имеющая от 1 до 4 атомов углерода,
аминогруппа,
защищенная аминогруппа,
аминогруппа, замещенная алкильной группой, имеющей от 1 до 4 атомов углерода,
алкильная группа, имеющая от 1 до 4 атомов углерода, и
атом галогена.
"Алкиленовая группа, имеющая от 1 до 4 атомов углерода" группы А в приведенных выше формулах (1) или (2), может включать метиленовые, этиленовые, триметиленовые и тетраметиленовые группы, предпочтительно метиленовую группу.
Защитная группа "группы, защищающей гидроксил", R1 и R2, и "защищенная гидроксильная группа", R3 и R4, или альфа-группа в приведенных выше формулах (1) или (2) относится к защитной группе, которая может отщепляться химическим способом, таким как гидрогенолиз, разложение, гидролиз, электролиз и фотолиз, или биологическим способом, таким как гидролиз в организме человека, и такие защитные группы могут включать
"алифатическую ацильную группу", такую как алкилкарбонильную группу, например формильную, ацетильную, пропионильную, бутирильную, изобутирильную, пентаноильную, пивалоильную, валерильную, изовалерильную, октаноильную, нонаноильную, деканоильную, 3-метилнонаноильную, 8-метилнонаноильную, 3-этилоктаноильную, 3,7- диметилоктаноильную, ундеканоильную, додеканоильную, тридеканоильную, тетрадеканоильную, пентадеканоильную, гексадеканоильную, 1-метилпентадеканоильную, 14-метилпентадеканоильную, 13,13-диметилтетрадеканоильную, гептадеканоильную, 15-метилгексадеканоильную, октадеканоильную, 1-метилгептадеканоильную, нонадеканоильную, эйкозаноильную и генэйкозаноильную, карбоксилированную алкилкарбонильную группу, например сукциноил, глутароил и адипоил, галоген(низший)алкилкарбонильную группу, например хлорацетил, дихлорацетил, трихлорацетил и трифторацетил, низшую алкокси(низший)алкилкарбонильную группу, например метоксиацетил, и ненасыщенную алкилкарбонильную группу, например (Е)-2-метил-2-бутеноил;
"ароматическую ацильную группу", такую как арилкарбонильную группу, например бензоил, альфа-нафтоил и бета-нафтоил, галогенарилкарбонильную группу, например 2-бромбензоил и 4-хлорбензоил, низшую алкилированную арилкарбонильную группу, например 2,4,6-триметилбензоил и 4-толуоил, низшую алкоксилированную арилкарбонильную группу, например 4-анизоил, карбоксилированную арилкарбонильную группу, например 2-карбоксибензоил, 3-карбоксибензоил и 4-карбоксибензоил, нитрованную арилкарбонильную группу, например 4-нитробензоил и 2-нитробензоил, низшую алкоксикарбонилированную арилкарбонильную группу, например 2-(метоксикарбонил)бензоил и арилированную арилкарбонильную группу, например 4-фенилбензоил;
"тетрагидропиранильную группу или тетрагидротиопиранильную группу", такую как тетрагидропиран-2-ильную, 3-бромтетрагидропиран-2-ильную, 4-метокситетрагидропиран-4-ильную, тетрагидротиопиран-2-ильную и 4-метокситетрагидротиопиран-4-ильную;
"тетрагидрофуранильную группу или тетрагидротиофуранильную группу", такую как тетрагидрофуран-2-ильную и тетрагидротиофуран-2-ильную;
"силильную группу", такую как три(низший)алкилсилильную группу, например триметилсилил, триэтилсилил, изопропилдиметилсилил, трет-бутилдиметилсилил, метилдиизопропилсилил, метилди-трет-бутилсилил и триизопропилсилил и три(низший)алкилсилильную группу, замещенную одной или двумя арильными группами, например дифенилметилсилил, дифенилбутилсилил, дифенилизопропилсилил и фенилдиизопропилсилил;
"низшую алкоксиметильную группу", такую как метоксиметил, 1,1-диметил-1-метоксиметил, этоксиметил, пропоксиметил, изопропоксиметил, бутоксиметил и трет-бутоксиметил;
"низшую алкоксилированную (низший)алкоксиметильную группу", такую как 2-метоксиэтоксиметил;
"галоид(низший)алкоксиметильную группу", такую как 2,2,2-трихлорэтоксиметил и бис(2-хлорэтокси)метил;
"низшую алкоксилированную этильную группу", такую как 1-этоксиэтил и 1-(изопропокси)этил;
"галоидированную этильную группу", такую как 2,2,2-трихлорэтил;
"метильную группу, замещенную от 1 до 3 арильными группами", такую как бензил, альфа-нафтилметил, бета-нафтилметил, дифенилметил, трифенилметил, альфа-нафтилдифенилметил и 9-антрилметил;
"метильную группу, замещенную от 1 до 3 арильными группами, в которых указанное арильное кольцо замещено низшим алкилом, низшей алкокси-, атомом галогена или цианогруппой", такую как 4-метилбензил, 2,4,6-триметилбензил, 3,4,5-триметилбензил, 4-метоксибензил, 4-метоксифенилдифенилметил, 4,4'-диметокситрифенилметил, 2-нитробензил, 4-нитробензил, 4-хлорбензил, 4-бромбензил и 4-цианобензил;
"низшую алкоксикарбонильную группу", такую как метоксикарбонил, этоксикарбонил, трет-бутоксикарбонил и изобутоксикарбонил;
"низшую алкоксикарбонильную группу, замещенную атомом галогена или три(низший)алкилсилильной группой", такую как 2,2,2-трихлорэтоксикарбонил и 2-триметилсилилэтоксикарбонил;
"алкенилоксикарбонильную группу", такую как винилоксикарбонил и аллилоксикарбонил, и
"аралкилоксикарбонильную группу, в которой указанное арильное кольцо может быть замещено одной или двумя низшими алкокси- или нитрогруппами", такую как бензилоксикарбонил, 4-метоксибензилоксикарбонил, 3,4-диметоксибензилоксикарбонил, 2-нитробензилоксикарбонил и 4-нитробензилоксикарбонил.
"Защитные группы гидроксила", R1 и R2, могут соответственно включать "алифатическую ацильную группу", "ароматическую ацильную группу", "метильную группу, замещенную от 1 до 3 арильными группами", "метильную группу, замещенную от 1 до 3 арильными группами, в которых указанное арильное кольцо замещено низшей алкильной, низшей алкокси-, атомом галогена или цианогруппой", или "силильной группой"; более предпочтительно ацетильную группу, бензоильную группу, бензильную группу, пара-метоксибензоильную группу, диметокситритильную группу, монометокситритильную группу или трет-бутилдифенилсилильную группу.
Защитная группа "защищенной гидроксильной группы", R3 и R4, или альфа-группа, может предпочтительно включать "алифатическую ацильную группу" или "ароматическую ацильную группу", более предпочтительно бензоильную группу.
Защитная группа "защищенной группы фосфорной кислоты", R1 и R2, в приведенной выше формуле (1) представляет собой защитную группу, которая может отщепляться химическим способом, таким как гидрогенолиз, гидролиз, электролиз и фотолиз, и биологическим способом, таким как гидролиз в организме человека, и такие защитные группы могут включать "низшую алкильную группу", такую как метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, н-пентил, изопентил, 2-метилбутил, неопентил, 1-этилпропил, н-гексил, изогексил, 4-метилпентил, 3-метилпентил, 2-метилпентил, 1-метилпентил, 3,3-диметилбутил, 2,2-диметилбутил, 1,1-диметилбутил, 1,2-диметилбутил, 1,3-диметилбутил, 2,3-диметилбутил и 2-этилбутил;
"цианированную низшую алкильную группу", такую как 2-цианоэтил и 2-циано-1,1-диметилэтил;
"этильную группу, замещенную силильной группой", такую как 2-метилдифенилсилилэтил, 2-триметилсилилэтил и 2-трифенилсилилэтил;
"галоидированную низшую алкильную группу", такую как 2,2,2-трихлорэтил, 2,2,2-трибромэтил, 2,2,2-трифторэтил и 2,2,2-трихлор-1,1-диметилэтил;
"низшую алкенильную группу", такую как этенил, 1-пропенил, 2-пропенил, 1-метил-2-пропенил, 1-метил-1-пропенил, 2-метил-1-пропенил, 2-метил-2-пропенил, 2-этил-2-пропенил, 1-бутенил, 2-бутенил, 1-метил-2-бутенил, 1-метил-1-бутенил, 3-метил-2-бутенил, 1-этил-2-бутенил, 3-бутенил, 1-метил-3-бутенил, 2-метил-3-бутенил, 1-этил-3-бутенил, 1-пентенил, 2-пентенил, 1-метил-2-пентенил, 2-метил-2-пентенил, 3-пентенил, 1-метил-3-пентенил, 2-метил-3-пентенил, 4-пентенил, 1-метил-4-пентенил, 2-метил-4-пентенил, 1-гексенил, 2-гексенил, 3-гексенил, 4-гексенил и 5-гексенил,
"циклоалкильную группу", такую как циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогептил, норборнил и адамантил;
"цианированную низшую алкенильную группу", такую как 2-цианобутенил;
"аралкильную группу", такую как бензил, альфа-нафтилметил, бета-нафтилметил, инденилметил, фенантренилметил, антраценилметил, дифенилметил, трифенилметил, 1-фенетил, 2-фенетил, 1-нафтилэтил, 2-нафтилэтил, 1-фенилпропил, 2-фенилпропил, 3-фенилпропил, 1-нафтилпропил, 2-нафтилпропил, 3-нафтилпропил, 1-фенилбутил, 2-фенилбутил, 3-фенилбутил, 4-фенилбутил, 1-нафтилбутил, 2-нафтилбутил, 3-нафтилбутил, 4-нафтилбутил, 1-фенилпентил, 2-фенилпентил, 3-фенилпентил, 4-фенилпентил, 5-фенилпентил, 1-нафтилпентил, 2-нафтилпентил, 3-нафтилпентил, 4-нафтилпентил, 5-нафтилпентил, 1-фенилгексил, 2-фенилгексил, 3-фенилгексил, 4-фенилгексил, 5-фенилгексил, 6-фенилгексил, 1-нафтилгексил, 2-нафтилгексил, 3-нафтилгексил, 4-нафтилгексил, 5-нафтилгексил и 6-нафтилгексил;
"аралкильную группу, в которой указанное арильное кольцо замещено нитрогруппой или атомом галогена", такую как 4-хлорбензил, 2-(4-нитрофенил)этил, орто-нитробензил, 4-нитробензил, 2,4-динитробензил и 4-хлор-2-нитробензил;
"арильную группу", такую как фенил, инденил, нафтил, фенантренил и антраценил, и
"арильную группу, замещенную низшей алкильной группой, атомом галогена или нитрогруппой", такую как 2-метилфенил, 2,6-диметилфенил, 2-хлорфенил, 4-хлорфенил, 2,4-дихлорфенил, 2,5-дихлорфенил, 2-бромфенил, 4-нитрофенил и 4-хлор-2-нитрофенил, предпочтительно "низшую алкильную группу", "низшую алкильную группу, замещенную цианогруппой", "аралкильную группу" или "аралкильную группу, в которой указанное арильное кольцо замещено нитрогруппой или атомом галогена", более предпочтительно 2-цианоэтильнню группу, 2,2,2-трихлорэтильную группу или бензильную группу.
"Алкоксигруппа, имеющая от 1 до 4 атомов углерода", R3 и R, или альфа-группа в приведенных выше формулах (1) или (2) может включать метокси, этокси, н-пропокси, изопропокси, н-бутокси, изобутокси, втор-бутокси или трет-бутокси, предпочтительно метокси- или этоксигруппу.
Защитная группа "защищенной меркаптогруппы" альфа-группы в приведенных выше формулах (1) или (2) может включать, кроме защитных групп гидроксила, упомянутых выше, "группу, которая образует дисульфид", такую как алкилтиогруппа, например метилтио, этилтио, трет-бутилтио и аралкилилтиогруппа, такую как бензилтио, предпочтительно "алифатическая ацильная группа" или "ароматическую ацильную группу", более предпочтительно бензоильную группу.
"Алкилтиогруппа, имеющая от 1 до 4 атомов углерода", R3 и R4, или альфа-группа в приведенных выше формулах (1) или (2) может включать метилтио, этилтио, пропилтио, изопропилтио, бутилтио, изобутилтио, втор-бутилтио и трет-бутилтио, предпочтительно метилтио- или этилтиогруппу.
Защитная группа "защищенной аминогруппы", альфа-группы в приведенных выше формулах (1) или (2) может включать "алифатическую ацильную группу", такую как алкилкарбонильную группу, например формил, ацетил, пропионил, бутирил, изобутирил, пентаноил, пивалоил, валерил, изовалерил, октаноил, нонаноил деканоил, 3-метилнонаноил, 8-метилнонаноил, 3-этилоктаноил, 3,7-диметилоктаноил, ундеканоил, додеканоил, тридеканоил, тетрадеканоил, пентадеканоил, гексадеканоил, 1-метилпентадеканоил, 14-метилпентадеканоил, 13,13-диметилтетрадеканоил, гептадеканоил, 15-метилгексадеканоил, октадеканоил, 1-метилгептадеканоил, нонадеканоил, эйкозаноил и генэйкозаноил, карбоксилированную алкилкарбонильную группу, например сукциноил, глутароил и адипоил, галоид(низший)алкилкарбонильную группу, например хлорацетил, дихлорацетил, трихлорацетил и трифторацетил, низшую алкокси(низший)алкилкарбонильную группу, например метоксиацетил, и ненасыщенную алкилкарбонильную группу, например (Е)-2-метил-2-бутеноил;
"ароматическую ацильную группу", такую как арилкарбонильная группа, например бензоил, альфа-нафтоил и бета-нафтоил, галоидарилкарбонильную группу, например 2-бромбензоил и 4-хлорбензоил, низшую алкилированную арилкарбонильную группу, например 2,4,6-триметилбензоил и 4-толуоил, низшую алкоксилированную арилкарбонильную группу, например 4-анизоил, карбоксилированную арилкарбонильную группу, например 2-карбоксибензоил, 3-карбоксибензоил и 4-карбоксибензоил, нитрованную арилкарбонильную группу, например 4-нитробензоил и 2-нитробензоил, низшую алкоксикарбонилированную арилкарбонильную группу, например 2-(метоксикарбонил)бензоил и арилированную арилкарбонильную группу, например 4-фенилбензоил;
"низшую алкоксикарбонильную группу", такую как метоксикарбонил, этоксикарбонил, трет-бутоксикарбонил и изобутоксикарбонил;
"низшую алкоксикарбонильную группу, замещенную атомом галогена или три(низший)алкилсилильной группой", такую как 2,2,2-трихлорэтоксикарбонил и 2-триметилсилилэтоксикарбонил;
"алкенилоксикарбонильную группу", такую как винилоксикарбонил и аллилоксикарбонил, и
"аралкилоксикарбонильную группу, в которой указанное арильное кольцо может быть замещено низшей алкокси или нитрогруппой", такой как бензилоксикарбонил, 4-метоксибензилоксикарбонил, 3,4-диметоксибензилоксикарбонил, 2-нитробензилоксикарбонил и 4-нитробензилоксикарбонил, предпочтительно "алифатической ацилгруппой или "ароматической ацилгруппой", более предпочтительно бензоилгруппой.
"Аминогруппа, замещенная алкильной группой, имеющей от 1 до 4 атомов углерода", R3 и R4, или альфа-группа в приведенных выше формулах (1) или (2) может включать метиламино, этиламино, пропиламино, изопропиламино, бутиламино, изобутиламино, втор-бутиламино, трет-бутиламино, диметиламино, диэтиламино, дипропиламино, диизопропиламино, дибутиламино, диизобутиламино, ди(втор-бутил)амино и ди(трет-бутил)амино, предпочтительно метиламино, этиламино, диметиламино, диэтиламино или диизопропиламино.
"Цианоалкоксигруппа, имеющая от 1 до 5 атомов углерода", R3 и R4, в приведенной выше формуле (1) представляет собой группу, в которой описанная выше "алкоксигруппа, имеющая от 1 до 4 атомов углерода", замещена цианогруппой, и такая группа может включать цианометокси, 2-цианоэтокси, 3-цианопропокси, 4-цианобутокси, 3-циано-2-метилпропокси или 1-цианометил-1,1-диметилметокси, предпочтительно 2-цианэтоксигруппу.
"Алкильная группа, имеющая от 1 до 4 атомов углерода" альфа-группы в приведенных выше формулах (1) или (2) может включать метил, этил, пропил, изопропил, бутил, изобутил, втор-бутил и трет-бутил, предпочтительно метильную или этильную группу.
"Атом галогена" альфа-группы в приведенных выше формулах (1) или (2) может включать атом фтора, атом хлора, атом брома или атом йода, предпочтительно атом фтора или атом хлора.
Предпочтительные группы "пурин-9-ильной группы" и "замещенной пурин-9-ильной группы" В в приведенной выше формуле (1) или (2) могут включать, в целом, 6-аминопурин-9-ильную (т.е. аденинил), 6-аминопурин-9-ильную, аминогруппа которой защищена, 2,6-диаминопурин-9-ильную, 2-амино-6-хлорпурин-9-ильную, 2-амино-6-хлорпурин-9-ильную, аминогруппа которой защищена, 2-амино-6-фторпурин-9-ильную, 2-амино-6-фторпурин-9-ильную, аминогруппа которой защищена, 2-амино-6-бромпурин-9-ильную, 2-амино-6-бромпурин-9-ильную, аминогруппа которой защищена, 2-амино-6-гидроксипурин-9-ильную (т.е. гуанинил), 2-амино-6-гидроксипурин-9-ильную, аминогруппа которой защищена, 2-амино-6-гидроксипурин-9-ильную, в которой амино- и гидроксигруппы защищены, 6-амино-2-метоксипурин-9-ильную, 6-амино-2-хлорпурин-9-ильную, 6-амино-2-фторпурин-9-ильную, 2,6-диметоксипурин-9-ильную, 2,6-дихлорпурин-9-ильную или 6-меркаптопурин-9-ильную, более предпочтительно 6-бензоиламинопурин-9-ильную, аденинил, 2-изобутириламино-6-гидроксипурин-9-ильную или гуанинильную группу.
Предпочтительные группы "2-оксопиримидин-1-ильной группы" и "замещенной 2-оксопиримидин-1-ильной группы" В в приведенной выше формуле (1) или (2) могут включать, в целом, 2-оксо-4-аминопиримидин-1-ильную (т.е. цитозинил), 2-оксо-4-аминопиримидин-1-ильную, аминогруппа которой защищена, 2-оксо-4-амино-5-фторпиримидин-1-ильную, 2-оксо-4-амино-5-фторпиримидин-1-ильную, аминогруппа которой защищена, 4-амино-2-оксо-5-хлорпиримидин-1-ильную, 2-оксо-4-метоксипиримидин-1-ильную, 2-оксо-4-меркаптопиримидин-1-ильную, 2-оксо-4-гидроксипиримидин-1-ильную (т.е. урацинил), 2-оксо-4-гидрокси-5-метилпиримидин-1-ильную (т.е. тиминил) или 4-амино-5-метил-2-оксопиримидин-1-ильную (т.е. 5-метилцитозинил) группу, более предпочтительно 2-оксо-4-бензоиламинопиримидин-1-ильную, цитозинил, тиминил, урацинил, 2-оксо-4-бензоиламино-5-метилпиримидин-1-ильную или 5-метилцитозинильную группу.
Термин "нуклеозидный аналог" относится к неестественному типу "нуклеозида", в котором пуриновая или пиримидиновая группа присоединена к сахару.
Термин "олигонуклеотидный аналог" относится к неестественному типу "олигонуклеотидной" производной, в которой от 2 до 50 "нуклеозидов", которые могут быть одинаковыми или различными, присоединяются посредством диэфирной связи фосфорной кислоты, и такие аналоги могут предпочтительно включать производные сахара, в которых функциональная группа сахара модифицирована; тиоатные производные, в которых диэфирная связь фосфорной кислоты тиотирована; сложноэфирные продукты, в которых концевая функциональная группа фосфорной кислоты этерифицирована, и амидные продукты, в которых аминогруппа при пуриновом основании является амидированной, более предпочтительно производные сахара, в которых функциональная группа сахара модифицирована, и тиоатные производные, в которых диэфирная функциональная группа фосфорной кислоты является тиотированной.
Термин "их соли" относится к солям соединения (1) настоящего изобретения поскольку они могут быть превращены в соли, и такие соли могут предпочтительно включать неорганические соли, например соли металлов, такие как соли щелочных металлов, например соли натрия, соли калия и соли лития, соли щелочноземельных металлов, например кальциевые соли и магниевые соли, соли алюминия, соли железа, соли цинка, соли меди, соли никеля и соли кобальта; аминные соли, такие как неорганические соли, например аммонийные соли, органические соли, например соли трет-октиламина, соли дибензиламина, соли морфолина, соли глюкозамина, соли сложного эфира алкилфенилглицина, соли этилендиамина, соли N-метилглюкамина, соли гуанидина, соли диэтиламина, соли триэтиламина, соли дициклогексиламина, соли N,N'-дибензилэтилендиамина, соли хлорпрокаина, соли прокаина, соли диэтаноламина, соли N-бензилфенетиламина, соли пиперазина, соли тетраметиламмония и соли трис(гидроксиметил)аминометана, соли неорганических кислот, такие как соли галоидводородных кислот, например соли фтористоводородной кислоты, соли хлористоводородной кислоты, соли бромистоводородной кислоты и соли иодистоводородной кислоты, соли азотной кислоты, соли перхлорной кислоты, соли серной кислоты и соли фосфорной кислоты; соли органических кислот, такие как соли низших алкансульфокислот, например соли метансульфокислоты, соли трифторметансульфокислоты и соли этансульфокислоты, соли арилсульфокислот, например соли бензолсульфокислоты и соли пара-толуолсульфокислоты, соли уксусной кислоты, соли яблочной кислоты, соли фумаровой кислоты, соли янтарной кислоты, соли лимонной кислоты, соли винной кислоты, соли щавелевой кислоты и соли малеиновой кислоты, и соли аминокислот, такие как соли глицина, соли лизина, соли аргинина, соли орнитина, соли глутаминовой кислоты и соли аспартиковой кислоты.
Поскольку модифицированные олигонуклеотиды или полинуклеотидные аналоги настоящего изобретения могут быть превращены в соли, термин "их фармакологически приемлемые соли" относится к их солям, и такие соли могут предпочтительно включать неорганические соли, например соли металлов, такие как соли щелочных металлов, например натриевые соли, калиевые соли, литиевые соли, соли щелочноземельных металлов, например кальциевые соли и магниевые соли, соли алюминия, соли железа, соли цинка, соли меди, соли никеля и соли кобальта; аминные соли, такие как неорганические соли, например аммонийные соли, органические соли, например соли трет-октиламина, соли дибензиламина, соли морфолина, соли глюкозамина, соли сложного эфира алкилфенилглицина, соли этилендиамина, соли N-метилглюкамина, соли гуанидина, соли диэтиламина, соли триэтиламина, соли дициклогексиламина, соли N,N'-дибензилэтилендиамина, соли хлорпрокаина, соли прокаина, соли диэтаноламина, соли N-бензилфенетиламина, соли пиперазина, соли тетраметиламмония, и соли трис(гидроксиметил)аминометана, соли неорганических кислот, такие как соли галоидводородных кислот, например соли фтористоводородной кислоты, соли хлористоводородной кислоты, соли бромистоводородной кислоты и соли иодистоводородной кислоты, соли азотной кислоты, соли перхлорной кислоты, соли серной кислоты и соли фосфорной кислоты; соли органических кислот, такие как соли низших алкансульфокислот, например соли метансульфокислоты, соли трифторметансуьфокислоты и соли этансульфокислоты, соли арилсульфокислот, например соли бензолсульфокислоты и соли пара-толуолсульфокислоты, соли уксусной кислоты, соли яблочной кислоты, соли фумаровой кислоты, соли янтарной кислоты, соли лимонной кислоты, соли винной кислоты, соли щавелевой кислоты и соли малеиновой кислоты, и соли аминокислот, такие как соли глицина, соли лизина, соли аргинина, соли орнитина, соли глутаминовой кислоты и соли аспартиковой кислоты.
Из соединений (1) и их солей настоящего изобретения предпочтительные соединения могут включать:
(1) соединения, в которых R1 представляет собой атом водорода, алифатическую ацильную группу, ароматическую ацильную группу, метильную группу, замещенную от 1 до 3 арильными группами, метильную группу, замещенную от 1 до 3 арильными группами, арильное кольцо которых замещено низшим алкилом, низшей алкоксигруппой, атомом галогена или цианогруппой, или силильную группу, и их соли;
(2) соединения, в которых R1 представляет собой атом водорода, ацетильную группу, бензоильную группу, бензильную группу, пара-метоксибензильную группу, диметокситритильную группу, моно-метокситритильную группу или трет-бутилдифенилсилильную группу, и их соли;
(3) соединения, в которых R2 представляет собой атом водорода, алифатическую ацильную группу, ароматическую ацильную группу, метильную группу, замещенную от 1 до 3 арильными группами, метильную группу, замещенную от 1 до 3 арильными группами, арильное кольцо которых замещается низшим алкилом, низшей алкокси-, атомом галогена или цианогруппой, силильную группу, фосфоамидитовую группу, фосфонильную группу, группу фосфорной кислоты или группу защищенной фосфорной кислоты, и их соли;
(4) соединения, в которых R2 представляет собой атом водорода, ацетильную группу, бензоильную группу, бензильную группу, пара-метоксибензильную группу, трет-бутилдифенилсилильную группу, -P(OC2H4CN)(NСН(СН3)2), -Р(ОСН3)(NCH(СН3)2), фосфонильную группу, или 2-хлорфенильную, или 4-хлорфенильную группу фосфорной кислоты, и их соли;
(5) соединения, в которых А представляет собой метиленовую группу, и их соли;
(6) соединения, в которых В представляет собой 6-аминопурин-9-ильную (т.е. аденинил), 6-аминопурин-9-ильную группы, аминогруппа которых защищена, 2,6-диаминопурин-9-ильную, 2-амино-6-хлорпурин-9-ильную, 2-амино-6-хлорпурин-9-ильную группу, аминогруппа которых защищена, 2-амино-6-фторпурин-9-ильную, 2-амино-6-фторпурин-9-ильную группу, аминогруппа которых защищена, 2-амино-6-бромпурин-9-ильную, 2-амино-6-бромпурин-9-ильную, аминогруппа которых защищена, 2-амино-6-гидроксипурин-9-ильную (т.е. гуанинил), 2-амино-6-гидроксипурин-9-ильную, аминогруппа которых защищена, 2-амино-6-гидроксипурин-9-ильную, аминогруппа и гидроксигруппа которых защищена, 6-амино-2-метоксипурин-9-ильную, 6-амино-2-хлорпурин-9-ильную, 6-амино-2-фторпурин-9-ильную, 2,6-диметоксипурин-9-ильную, 2,6-дихлорпурин-9-ильную, 6-меркаптопурин-9-ильную, 2-оксо-4-аминопиримидин-1-ильную (т.е. цитозинил), 2-оксо-4-аминопиримидин-1-ильную, аминогруппа которой защищена, 2-оксо-4-амино-5-фторпиримидин-1-ильную, 2-оксо-4-амино-5-фторпиримидин-1-ильную, аминогруппа которой защищена, 4-амино-2-оксо-5-хлорпиримидин-1-ильную, 2-оксо-4-метоксипиримидин-1-ильную, 2-оксо-4-меркаптопиримидин-1-ильную, 2-оксо-4-гидроксипиримидин-1-ильную (т.е. урацинил), 2-оксо-4-гидрокси-5-метилпиримидин-1-ильную (т.е. тиминил), 4-амино-5-метил-2-оксопиримидин-1-ильную (т.е. 5-метилцитозинильную) группу или 4-амино-5-метил-2-оксопиримидин-1-ильную группу, в которой аминогруппа защищена, и их соли, и
(7) соединения, в которых В представляет собой 6-бензоиламинопурин-9-ильную, аденинил, 2-изобутириламино-6-гидроксипурин-9-ильную, гуанинильную, 2-оксо-4-бензоиламинопиримидин-1-ильную, цитозинильную, 2-оксо-5-метил-4-бензоиламинопиримидин-1-ильную, 5-метилцитозинильную, урацинильную или тиминильную группу, и их соли.
В приведенных выше вариантах (1) и (2), (3) и (4) или (6) и (7) указаны более предпочтительные соединения, по мере увеличения номера, и в формуле (1) предпочтительными являются соединения, полученные путем необязательного выбора R1 из (1) и (2), необязательного выбора R2 из (3) и (4), необязательного выбора А из (5) и необязательного выбора В из (6) и (7) или путем необязательного сочетания этих соединений и их солей, и особенно предпочтительными являются соединения и их соли, выбранные из следующих групп.
Группа соединений:
2'-O,4'-С-этиленгуанозин,
2'-O,4'-С-этиленаденозин,
3',5'-ди-О-бензил-2'-О,4'-С-этилен-6-N-бензоиладенозин,
3',5'-ди-О-бензил-2'-О,4'-С-этилен-2-N-изобутирилгуанозин,
5'-О-диметокситритил-2'-О,4'-С-этилен-6-N-бензоиладенозин,
5'-О-диметокситритил-2'-О,4'-С-этилен-2-N-изобутирилгуанозин,
2'-О,4'-С-этилен-2-N-изобутирилгуанозин,
2'-О,4'-С-этилен-6-N-бензоиладенозин,
5'-О-диметокситритил-2'-О,4'-С-этилен-6-N-бензоиладенозин-3'-О-(2-цианэтил N,N-диизопропил)фосфоамидит,
5'-О-диметокситритил-2'-О,4'-С-этилен-2-N-изобутирилгуанозин-3'-О-(2-цианэтил-N,N-диизопропил)фосфоамидит,
2'-О,4'-С-этиленуридин,
2'-О,4'-С-этилен-5-метилуридин,
2'-О,4'-С-этиленцитидин,
2'-О,4'-С-этилен-5-метилцитидин,
3',5'-ди-О-бензил-2'-О,4'-С-этиленуридин,
5'-О-диметокситритил-2'-О,4'-С-этиленуридин,
3',5'-ди-О-бензил-2'-О,4'-С-этилен-5-метилуридин,
5'-О-диметокситритил-2'-О,4'-С-этилен-5-метилуридин,
3',5' -ди-О-бензил-2'-О,4'-С-этилен-4-N-бензоилцитидин,
5'-О-диметокситритил-2'-О,4'-С-этилен-4-N-бензоилцитидин,
3', 5'-ди-О-бензил-2'-О,4'-С-этилен-4-N-бензоил-5-метилцитидин,
5'-О-диметокситритил-2'-О,4'-С-этилен-4-N-бензоил-5-метилцитидин,
2'-О,4'-С-этилен-4-N-бензоилцитидин,
2'-О,4'-С-этилен-4-N-бензоил-5-метилцитидин,
5'-О-диметокситритил-2'-О,4'-С-этиленуридин-3'-О-(2-цианэтил-N,N-диизопропил)фосфоамидит,
5'-О-диметокситритил-2'-О,4'-С-этилен-5-метилуридин-3'-О-(2-цианэтил-N,N-диизопропил)фосфоамидит,
5'-О-диметокситритил-2'-О,4'-С-этилен-4-N-бензоилцитидин-3'-О-(2-цианэтил-N,N-диизопропил)фосфоамидит и
5'-О-диметокситритил-2'-О,4'-С-этилен-4-N-бензоил-5-метилцитидин-3'-О-(2-цианэтил-N,N-диизопропил)фосфоамидит.
Из олигонуклеотидных аналогов, содержащих одну, или две, или более структур формулы (2), и их фармакологически приемлемых солей настоящего изобретения предпочтительные соединения могут включать:
(8) олигонуклеотидные аналоги, в которых А представляет собой метиленовую группу, и их фармакологически приемлемые соли;
(9) олигонуклеотидные аналоги, в которых В представляет собой 6-аминопурин-9-ильную (т.е. аденинил), 6-аминопурин-9-ильную, аминогруппа которых защищена, 2,6-диаминопурин-9-ильную, 2-амино-6-хлорпурин-9-ильную, 2-амино-6-хлорпурин-9-ильную, аминогруппа которых защищена, 2-амино-6-фторпурин-9-ильную, 2-амино-6-фторпурин-9-ильную, аминогруппа которых защищена, 2-амино-6-бромпурин-9-ильную, 2-амино-6-бромпурин-9-ильную, аминогруппа которой защищена, 2-амино-6-гидроксипурин-9-ильную (т.е. гуанинил), 2-амино-6-гидроксипурин-9-ильную, аминогруппа которой защищена, 2-амино-6-гидроксипурин-9-ильную, аминогруппа и гидроксильная группа которой защищены, 6-амино-2-метоксипурин-9-ильную, 6-амино-2-хлорпурин-9-ильную, 6-амино-2-фторпурин-9-ильную, 2,6-диметоксипурин-9-ильную, 2,6-дихлорпурин-9-ильную, 6-меркаптопурин-9-ильную, 2-оксо-4-аминопиримидин-1-ильную (т.е. цитозинил), 2-оксо-4-аминопиримидин-1-ильную, аминогруппа которой защищена, 2-оксо-4-амино-5-фторпиримидин-1-ильную, 2-оксо-4-амино-5-фторпиримидин-1-ильную, аминогруппа которой защищена, 4-амино-2-оксо-5-хлорпиримидин-1-ильную, 2-оксо-4-метоксипиримидин-1-ильную, 2-оксо-4-меркаптопиримидин-1-ильную, 2-оксо-4-гидроксипиримидин-1-ильную (т.е. урацилил), 2-оксо-4-гидрокси-5-метилпиримидин-1-ильную (т.е. тиминил), 4-амино-5-метил-2-оксопиримидин-1-ильную (т.е. 5-метилцитозинил) группу или 4-амино-5-метил-2-оксопиримидин-1-ильную группу, аминогруппа которой защищена, и их фармакологически приемлемые соли
и (10) олигонуклеотидные аналоги, в которых В представляет собой 6-бензоиламинопурин-9-ильную, аденинильную, 2-изобутириламино-6-гидроксипурин-9-ильную, гуанинильную, 2-оксо-4-бензоиламинопиримидин-1-ильную, цитозинильную, 2-оксо-5-метил-4-бензоиламинопиримидин-1-ильную, 5-метилцитозинильную, урацинильную или тиминильную группу, и их фармакологически приемлемые соли.
В приведенных выше вариантах (9) и (10) указаны более предпочтительные олигонуклеотидные аналоги, по мере увеличения номера, и в формуле (2) предпочтительными являются олигонуклеотидные аналоги, полученные путем необязательного выбора А из (8) и необязательного выбора В из (9) и (10) или путем необязательного сочетания этих соединений и их фармакологически приемлемых солей.
Конкретные соединения, входящие в число соединений по приведенной выше формуле (1) настоящего изобретения, указаны в Таблицах 1 и 2. Однако соединения настоящего изобретения не ограничиваются этими соединениями.
В Таблице 1 и Таблице 2 № соед. представляет собой номер соединения, приведенного в качестве примера. Me представляет собой метильную группу, Вn представляет собой бензильную группу, Bz представляет собой бензоильную группу, РМВ представляет собой п-метоксибензильную группу, Тr представляет собой трифенилметильную группу, ММТr представляет собой 4-метокситрифенилметильную (монометокситритил) группу, DMTr представляет собой 4,4'-диметокситрифенилметильную (диметокситритил) группу, ТМТг представляет собой 4,4',4''-триметокситрифенилметильную (триметокситритил) группу, TMS представляет собой триметилсилильную группу, TBDMS представляет собой трет-бутилдиметилсилильную группу, TBDPS представляет собой трет-бутилдифенилсилильную группу и TIPS представляет собой триизопропилсилильную группу.
В приведенных выше таблицах 1 и 2 предпочтительные соединения представляют собой соединения (1-5), (1-7), (1-23), (1-24), (1-31), (1-35), (1-39), (1-43), (1-49), (1-51), (1-67), (1-68), (1-75), (1-79), (1-83), (1-87), (1-93), (1-95), (1-111), (1-112), (1-119), (1-123), (1-127), (1-131), (1-137), (1-139), (1-155), (1-156), (1-163), (1-167), (1-171), (1-175), (1-177), (1-178), (1-185), (1-186), (1-193), (1-194), (1-201), (1-202), (2-1), (2-2), (2-3), (2-4), (2-10), (2-15), (2-19), (2-22), (2-27), (2-31), (2-34), (2-39), (2-43), (2-46), (2-51), (2-55), (2-57), (2-58), (2-59), (2-60), (2-66), (2-71), (2-75), (2-78), (2-83), (2-87), (2-90), (2-95), (2-99), (2-102), (2-107), (2-111), (2-113), (2-114), (2-115), (2-116), (2-122), (2-127), (2-131), (2-134), (2-139), (2-143), (2-146), (2-151), (2-155), (2-158), (2-163), (2-167), (2-169), (2-170), (2-171), (2-172), (2-178), (2-183), (2-187), (2-190), (2-195), (2-199), (2-202), (2-207), (2-211), (2-214), (2-219), (2-223), (2-225), (2-226), (2-233), (2-234), (2-235) или (2-236),
более предпочтительные соединения могут включать:
2'-О,4'-С-этиленгуанозин (1-5),
2'-О,4'-С-этиленаденозин (1-7),
3',5'-ди-О-бензил-2'-О,4'-С-этилен-6-N-бензоиладенозин (1-23),
3',5'-ди-О-бензил-2'-О,4'-С-этилен-2-N-изобутирилгуанозин
(1-24),
5'-О-диметокситритил-2'-О,4'-С-этилен-6-N-бензоиладенозин
(1-31),
5'-О-диметокситритил-2'-О,4'-С-этилен-2-N-изобутирилгуанозин (1-35),
2'-О,4'-С-этилен-2-N-изобутирилгуанозин (1-177),
2'-O,4'-С-этилен-6-N-бензоиладенозин (1-178),
5'-О-диметокситритил-2'-О,4'-С-этилен-2-N-изобутирилгуанозин-3'-О-(2-цианэтил-N,N-диизопропил)фосфорамидит (1-185),
5'-О-диметокситритил-2'-О,4'-С-этилен-6-N-бензоиладенозин-3'-О-(2-цианэтил-N,N-диизопропил)фосфоамидит (1-186),
2'-О,4'-С-этиленуридин (2-1),
2'-О,4'-С-этилен-5-метилуридин (2-2),
2'-О,4'-С-этиленцитидин (2-3),
2'-O,4'-С-этилен-5-метилцитидин (2-4),
3',5'-ди-O-бензил-2'-О,4'-С-этиленуридин (2-10),
5'-О-диметокситритил-2'-О,4'-С-этиленуридин (2-15),
3',5'-ди-О-бензил-2'-О,4'-С-этилен-5-метилуридин (2-22),
5'-О-диметокситритил-2'-O,4'-С-этилен-5-метилуридин (2-27),
3',5'-ди-О-бензил-2'-О,4'-С-этилен-4-N-бензоилцитидин (2-34),
5'-О-диметокситритил-2'-О,4'-С-этилен-4-N-бензоилцитидин (2-39),
3',5'-ди-О-бензил-2'-О,4'-С-этилен-4-N-бензоил-5-метилцитидин (2-46),
5'-О-диметокситритил-2'-О,4'-С-этилен-4-N-бензоил-5-метилцитидин (2-51),
2'-О,4'-С-этилен-4-N-бензоилцитидин (2-225),
2'-О,4'-С-этилен-4-N-бензоил-5-метилцитидин (2-226),
5'-О-диметокситритил-2'-О,4'-С-этиленуридин-3'-О-(2-цианэтил-N,N-диизопропил)фосфоамидит (2-233),
5'-О-диметокситритил-2'-О,4'-С-этилен-5-метилуридин-3'-О-(2-цианэтил-N, N-диизопропил)фосфоамидит (2-234),
5'-О-диметокситритил-2'-О,4'-С-этилен-4-N-бензоилцитидин-3'-О-(2-цианэтил-N,N-диизопропил)фосфоамидит (2-235)
и 5'-О-диметокситритил-2'-О,4'-С-этилен-4-N-бензоил-5-метилцитидин-3'-О-(2-цианэтил-N, N-диизопропил)фосфоамидит (2-236).
Соединение (1) настоящего изобретения может быть получено в соответствии со способом А, описанным ниже.
В способе А Х представляет собой защитную группу; Y представляет собой защитную группу; А имеет то же самое значение, которое определено выше, в то время как В1 представляет собой пурин-9-ильную группу, замещенную пурин -9-ильную группу или замещенную 2-оксопиримидин-1-ильную группу, причем указанные заместители выбирают из приведенных выше R3 и R4, однако за исключением незащищенной аминогруппы "аминогруппы, которая может быть защищена"; в то время как В2 представляет собой пурин-9-ильную группу, замещенную пурин-9-ильную группу или замещенную 2-оксопиримидин-1-ильную группу, причем указанные заместители выбирают из приведенных выше R3 и R4, однако за исключением незащищенной аминогруппы "аминогруппы, которая может быть защищена"; R7 представляет собой группу, которая образует отщепляемую группу, и R8 представляет собой алифатическую ацильную группу, имеющую от 1 до 4 атомов углерода.
Защитная группа Х является той же самой группой, что и "защитная группа гидроксила" в приведенном выше R1.
Защитная группа Y является той же самой группой, что и "защитная группа гидроксила" в приведенном выше R2.
"Группа, которая образует отщепляемую группу", R7 может включать низшую алкилсульфонильную группу, такую как метансульфонил и этансульфонил; галогензамещенную низшую алкилсульфонильную группу, такую как трифторметансульфонил, и арилсульфонильную группу, такую как пара-толуолсульфонил, предпочтительно метансульфонильную группу или п-толуолсульфонильную группу.
"Алифатическая ацильная группа, содержащая от 2 до 4 атомов углерода," R8 может включать ацетильную, пропионильную, бутирильную группы и подобные, предпочтительно ацетильную группу.
В последующем каждая стадия способа А будет описана подробно.
Стадия А-1
Настоящая стадия предназначается для получения соединения (4) путем взаимодействия соединения (3), которое можно получить по способам от В до D, описанным ниже, с реагентом для введения отщепляемой группы в присутствии основного катализатора в инертном растворителе.
Используемые с этой целью растворители могут включать алифатические углеводороды, такие как гексан, гептан, лигроин и петролейный эфир; ароматические углеводороды, такие как бензол, толуол и ксилол; галоидированные углеводороды, такие как хлористый метилен, хлороформ, четыреххлористый углерод, дихлорэтан, хлорбензол и дихлорбензол; сложные эфиры, такие как этилформиат, этилацетат, пропилацетат, бутилацетат и диэтилкарбонат; простые эфиры, такие как диэтиловый эфир, диизопропиловый эфир, тетрагидрофуран, диоксан, диметоксиэтан и диметиловый эфир диэтиленгликоля; кетоны, такие как ацетон, метилэтилкетон, метилизобутилкетон, изофорон и циклогексанон; нитросоединения, такие как нитроэтан и нитробензол; нитрилы, такие как ацетонитрил и изобутиронитрил; амиды, такие как формамид, N,N-диметилформамид, N,N-диметилацетамид, N-метил-2-пирролидон, N-метилпирролидинон и гексаметилфосфоротриамид; сульфоксиды, такие как сульфолан, и производные пиридина, предпочтительно пиридин.
Применяемый здесь основной катализатор может предпочтительно включать основания, такие как триэтиламин, пиридин и диметиламинопиридин.
Реагент для введения отщепляемой группы может включать алкилсульфонилгалогениды, такие как метансульфонилхлорид и этансульфонилбромид, и арилсульфонилгалогениды, такие как п-толуолсульфонилхлорид, предпочтительно метансульфонилхлорид и п-толуолсульфонилхлорид.
Температура реакции изменяется в зависимости от исходного материала, растворителя, реагента для введения отщепляемой группы и основного катализатора, но обычно она составляет от 0 до 50°С, предпочтительно от 10 до 40°С.
Время взаимодействия изменяется в зависимости от исходного материала, растворителя, реагента для введения отщепляемой группы, основного катализатора и температуры реакции, но обычно оно составляет от 10 мин до 24 ч, предпочтительно от 1 до 10 ч.
После взаимодействия желаемое соединение (4) этой реакции получают, например, посредством нейтрализации реакционного раствора, концентрирования реакционной смеси, добавления органического растворителя, не смешивающегося с водой, такого как этилацетат, промывки водой, выделения органического слоя, содержащего желаемое соединение, сушки над безводным сульфатом магния и отгонки растворителя.
Полученный таким образом целевой продукт может быть дополнительно очищен, в случае необходимости, традиционным способом, например перекристаллизацией и хроматографически на колонке с силикагелем.
(Стадия А-2)
Настоящая стадия предназначается для получения соединения (5) путем взаимодействия соединения (4), полученного на стадии А-1, с ангидридом кислоты, в присутствии кислотного катализатора в растворителе.
Используемые с этой целью растворители могут включать простые эфиры, такие как диэтиловый эфир, тетрагидрофуран и диоксан; нитрилы, такие как ацетонитрил и изобутиронитрил; амиды, такие как формамид, N,N-диметилформамид, N,N-диметилацетамид, N-метил-2-пирролидон, N-метилпирролидинон и гексаметилфосфоротриамид, и органические кислоты, такие как уксусная кислота, предпочтительно уксусная кислота.
Применяемые здесь кислотные катализаторы могут включать неорганические кислоты, такие как хлористоводородная кислота, серная кислота и азотная кислота, предпочтительно серная кислота (особенно концентрированная серная кислота).
Применяемые здесь ангидриды кислот могут включать ангидрид низшей алифатической карбоновой кислоты, такой как уксусный ангидрид и пропионовый ангидрид, предпочтительно уксусный ангидрид.
Температура реакции изменяется в зависимости от исходного материала, растворителя, кислотного катализатора и ангидрида кислоты и обычно она составляет от 0 до 50°С, предпочтительно от 10 до 40°С.
Время взаимодействия изменяется в зависимости от исходного материала, растворителя, кислотного катализатора, ангидрида кислоты и температуры реакции, но обычно оно составляет от 10 мин до 12 ч, предпочтительно от 30 мин до 3 ч.
После взаимодействия желаемое соединение (5) этой реакции получают, например, посредством концентрирования реакционной смеси, добавления органического растворителя, не смешивающегося с водой, такого как этилацетат, промывки водой, выделения органического слоя, содержащего желаемое соединение, сушки над безводным сульфатом магния и отгонки растворителя.
Полученный таким образом целевой продукт может быть дополнительно очищен, в случае необходимости, традиционным способом, например перекристаллизацией и хроматографически на колонке с силикагелем и т.п.
(Стадия А-3)
Настоящая стадия предназначается для получения соединения (6) путем взаимодействия соединения (5), полученного на стадии А-2, с триметилсилилированным соединением, соответствующим пурину или пиримидину, которые могут иметь желаемый заместитель, полученным в соответствии со ссылкой (Н. Vorbrggen, К. Krolikiewicz и В. Bennua, Chem. Веr., т. 114, с. 1234-1255 (1981)), в присутствии кислотного катализатора в инертном растворителе.
Используемые с этой целью растворители могут включать ароматические углеводороды, такие как бензол, толуол и ксилол; галоидированные углеводороды, такие как хлористый метилен, хлороформ, четыреххлористый углерод, 1,2-дихлорэтан, хлорбензол и дихлорбензол; нитрилы, такие как ацетонитрил и изобутиронитрил; амиды, такие как формамид, N,N-диметилформамид, N,N-диметилацетамид, N-метил-2-пирролидон, N-метилпирролидинон и гексаметилфосфоротриамид; сероуглерод; предпочтительно 1,2-дихлорэтан.
Применяемые здесь кислотные катализаторы могут включать катализаторы - кислоты Льюиса, такие как АlСl3, SnCl4, TiCl4, ZnCl2, BF3, триметилсилилтрифторметансульфонат, предпочтительно триметилсилилтрифторметансульфонат.
Температура реакции изменяется в зависимости от исходного материала, растворителя и кислотного катализатора, но обычно она составляет от 0 до 100°С, предпочтительно от 50 до 80°С.
Время взаимодействия изменяется в зависимости от исходного материала, растворителя, кислотного катализатора и температуры реакции, но обычно оно составляет от 1 до 24 ч, предпочтительно от 1 до 8 ч.
После взаимодействия желаемое соединение (6) этой реакции получают, например, посредством концентрирования реакционной смеси, добавления органического растворителя, не смешивающегося с водой, такого как этилацетат, промывки водой, выделения органического слоя, содержащего желаемое соединение, сушки над безводным сульфатом магния и отгонки растворителя.
Полученный таким образом целевой продукт может быть дополнительно очищен, в случае необходимости, традиционным способом, например перекристаллизацией и хроматографически на колонке с силикагелем и т.п.
(Стадия А-4)
Настоящая стадия предназначается для получения соединения (1а) настоящего изобретения путем циклизации соединения (6), полученного на стадии А-3, в присутствии основного катализатора в инертном растворителе.
Используемые с этой целью растворители могут включать воду; пиридиновые производные; ацетонитрилы, такие как ацетонитрил и изобутиронитрил; амиды, такие как формамид, N,N-диметилформамид, N,N-диметилацетамид, N-метил-2-пирролидон, N-метилпирролидинон и гексаметилфосфоротриамид, и их смеси, предпочтительно смесь воды и пиридина.
Применяемый здесь основной катализатор может включать гидроксиды щелочных металлов, такие как гидроксид натрия и гидроксид калия; карбонаты щелочных металлов, такие как карбонат натрия и карбонат калия; алкоксиды щелочных металлов, такие как метоксид натрия и этоксид натрия; водный аммиак, предпочтительно гидроксиды щелочных металлов (особенно гидроксид натрия).
Температура реакции изменяется в зависимости от исходного материала, растворителя и основного катализатора, но обычно она составляет от 0 до 50°С, предпочтительно от 10 до 30°С.
Время взаимодействия изменяется в зависимости от исходного материала, растворителя, основного катализатора и температуры реакции, но обычно оно составляет от 1 мин до 5 ч, предпочтительно от 1 до 30 минут.
После взаимодействия желаемое соединение (1а) этой реакции получают, например, посредством нейтрализации реакционного раствора, концентрирования реакционной смеси, добавления органического растворителя, не смешивающегося с водой, такого как этилацетат, промывки водой, выделения органического слоя, содержащего желаемое соединение, сушки над безводным сульфатом магния и отгонки растворителя.
Полученный таким образом целевой продукт может быть дополнительно очищен, в случае необходимости, традиционным способом, например перекристаллизацией и на хроматографической колонке с силикагелем и т.п.
(Стадия А-5)
Настоящая стадия предназначается для получения соединения (1b) путем взаимодействия соединения (1а), полученного на стадии А-4, с удаляющим защиту реагентом, в инертном растворителе.
Способ удаления защиты варьируют в зависимости от типа защитной группы и специально не ограничивается, если он не приводит к другим побочным реакциям и может быть осуществлен, например, по способу, описанному в книге "Protective Groups in Organic Synthesis" (Theodora W. Greene и Peter G. M. Wuts, 1999, опубликованной в A Wiley-Interscience Publication).
Конкретно, способ удаления защиты может быть осуществлен следующими способами, в случае, когда защитная группа представляет собой (1) "алифатическую ацильную группу или ароматическую ацильную группу", (2) "метильную группу, замещенную от 1 до 3 арильными группами" или "метильную группу, замещенную от 1 до 3 арильными группами, арильное кольцо которых замещено низшим алкилом, низшей алкокси-, атомом галогена или пианогруппой", или (3) "силильную группу".
(1) В случае, когда защитная группа представляет собой алифатическую ацильную группу или ароматическую ацильную группу, реакцию удаления защиты обычно проводят путем обработки соединения основанием в инертном растворителе.
Используемые с этой целью растворители специально не ограничиваются, если они легко смешиваются с водой, не замедляют реакцию и в некоторой степени растворяют исходный материал, и могут включать водные или безводные амиды, такие как диметилформамид и диметилацетамид; галоидированные углеводороды, такие как метиленхлорид, хлороформ, 1,2-дихлорэтан или четыреххлористый углерод; и простые эфиры, такие как тетрагидрофуран, диэтиловый эфир и диоксан; предпочтительно простые эфиры, более предпочтительно тетрагидрофуран.
Применяемое здесь основание может включать гидроксиды щелочных металлов, такие как гидроксид лития, гидроксид натрия и гидроксид калия; карбонаты щелочных металлов, такие как карбонат натрия и карбонат калия; алкоксиды щелочных металлов, такие как метоксид натрия и этоксид натрия, и аммиачный раствор, такой как водный аммиак и аммиак в растворе метанола.
Температура реакции составляет от 0 до 60°С, предпочтительно от 20 до 40°С.
Время взаимодействия составляет от 10 мин до 24 ч, предпочтительно от 1 до 3 час.
После взаимодействия желаемое соединение (1b) этой реакции получают, например, посредством нейтрализации реакционного раствора, концентрирования реакционной смеси, добавления органического растворителя, не смешивающегося с водой, такого как этилацетат, промывки водой, выделения органического слоя, содержащего желаемое соединение, сушки над безводным сульфатом магния и отгонки растворителя.
Полученный таким образом целевой продукт может быть дополнительно очищен, в случае необходимости, традиционным способом, например, перекристаллизацией и хроматографически на колонке с силикагелем и т.п.
(2) В случае, когда защитная группа представляет собой "метильную группу, замещенную одной - тремя арильными группами", или "метильную группу, замещенную одной - тремя арильными группами, арильное кольцо которых замещено низшим алкилом, низшей алкокси-, атомом галогена или цианогруппой", реакцию обычно проводят в инертном растворителе с использованием восстанавливающего агента.
Используемые с этой целью растворители предпочтительно могут включать спирты, такие как метанол, этанол и изопропанол; простые эфиры, такие как диэтиловый эфир, тетрагидрофуран и диоксан; ароматические углеводороды, такие как толуол, бензол и ксилол; алифатические углеводороды, такие как гексан и циклогексан; сложные эфиры, такие как этилацетат и пропилацетат; органические кислоты, такие как уксусная кислота, или смесь этих органических растворителей и воды.
Используемые с этой целью восстанавливающие агенты специально не ограничиваются, если они обычно применяются для каталитического восстановления, и они могут включать предпочтительно палладий на угле, никель Ренея, оксид платины, платиновую чернь, родий на оксиде алюминия, трифенилфосфинродийхлорид и палладий на сульфате бария.
Давление специально не ограничивается, но обычно оно составляет от 0,1 до 1 МПа (1-10 атм).
Температура реакции составляет от 0 до 60°С, предпочтительно от 20°С до 40°С.
Время взаимодействия составляет от 10 мин до 24 ч, предпочтительно от 1 до 3 ч.
После взаимодействия желаемое соединение (1b) этой реакции получают, например, путем удаления восстанавливающего агента из реакционной смеси, добавления органического растворителя, не смешивающегося с водой, такого как этилацетат, промывки водой, выделения органического слоя, содержащего желаемое соединение, сушки над безводным сульфатом магния и отгонки растворителя. Полученный таким образом целевой продукт может быть дополнительно очищен, в случае необходимости, традиционным способом, например, перекристаллизацией, хроматографически на колонке с силикагелем и т.п.
В случае, когда защитная группа представляет собой "метильную группу, замещенную тремя арильными группами", т.е. тритильную группу, реакцию удаления защиты можно проводить также с использованием кислоты.
В этом случае используемые здесь растворители могут включать ароматические углеводороды, такие как бензол, толуол и ксилол; галоидированные углеводороды, такие как хлористый метилен, хлороформ, четыреххлористый углерод, 1,2-дихлорэтан, хлорбензол и дихлорбензол; нитрилы, такие как ацетонитрил и изобутиронитрил; амиды, такие как формамид, N,N-диметилформамид, N,N-диметилацетамид, N-метил-2-пирролидон, N-метилпирролидинон и гексаметилфосфоротриамид, и органические кислоты, такие как уксусная кислота; предпочтительны органические кислоты (особенно уксусная кислота) или спирты (особенно трет-бутанол).
Применяемые здесь кислоты могут предпочтительно включать уксусную кислоту или трифторуксусную.
Температура реакции составляет от 0 до 60°С, предпочтительно от 20 до 40°С.
Время взаимодействия составляет от 10 мин до 24 ч, предпочтительно от 1 до 3 ч.
После взаимодействия желаемое соединение (1b) этой реакции получают, например, путем нейтрализации реакционной смеси, добавления органического растворителя, не смешивающегося с водой, такого как этилацетат, промывки водой, выделения органического слоя, содержащего желаемое соединение, сушки над безводным сульфатом магния и отгонки растворителя.
Полученный таким образом целевой продукт может быть дополнительно очищен, в случае необходимости, традиционным способом, например перекристаллизацией, хроматографически на колонке с силикагелем и т.п.
(3) В случае, когда защитная группа представляет собой "силильную группу", то обычно ее можно удалить путем обработки соединением, которое образует анион фтора, таким как тетрабутиламмонийфторид, фтористоводородная кислота, фтористоводородная кислота-пиридин и фторид калия, или органические кислоты, такие как уксусная кислота, метансульфоновая кислота, пара-толуолсульфоновая кислота, трифторуксусная кислота и трифторметансульфоновая кислота, или неорганические кислоты, такие как хлористоводородная кислота.
В случае, когда защитную группу удаляют под действием аниона фтора, эту реакцию иногда активируют путем добавления в смесь органических кислот, таких как муравьиная кислота, уксусная кислота и пропионовая кислота.
Используемые с этой целью растворители специально не ограничиваются, если они не замедляют реакцию и в некоторой степени растворяют исходный материал, и могут предпочтительно включать простые эфиры, такие как диэтиловый эфир, диизопропиловый эфир, тетрагидрофуран, диоксан, диметоксиэтан и диметиловый эфир диэтиленгликоля; нитрилы, такие как ацетонитрил и изобутиронитрил; вода; органические кислоты, такие как уксусная кислота, и их смеси.
Температура реакции составляет от 0 до 100°С, предпочтительно от 20 до 70°С.
Время взаимодействия составляет от 5 мин до 48 ч, предпочтительно от 1 до 24 час.
После взаимодействия желаемое соединение (1b) этой реакции получают, например, путем концентрирования реакционной смеси, добавления органического растворителя, не смешивающегося с водой, такого как этилацетат, промывки водой, выделения органического слоя, содержащего желаемое соединение, сушки над безводным сульфатом магния и отгонки растворителя. Полученный таким образом целевой продукт может быть дополнительно очищен, в случае необходимости, традиционным способом, например перекристаллизацией, хроматографически на колонке с силикагелем и т.п.
Стадия А-6
Настоящая стадия предназначается для получения соединения (1с) настоящего изобретения путем взаимодействия соединения (1b), полученного на стадии А-5, с удаляющим защиту реагентом, в инертном растворителе.
Способ удаления защиты варьируют в зависимости от типа защитной группы и специально не ограничивается, если он не приводит к другим побочным реакциям, и может быть осуществлен, например, по способу, описанному в книге "Protective Groups in Organic Synthesis" (Theodora W. Greene и Peter G. M. Wuts, 1999, опубликованной в A Wiley-Interscience Publication).
В частности, способ удаления защиты может быть осуществлен следующим способом, в случае, когда защитная группа представляет собой алифатическую ацильную группу или ароматическую ацильную группу.
Конкретно способ удаления защиты обычно осуществляют путем взаимодействия с основанием в инертном растворителе, в случае, когда защитная группа представляет собой алифатическую ацильную группу или ароматическую ацильную группу.
Используемые с этой целью растворители специально не ограничиваются, если они легко смешиваются с водой, не замедляют реакцию и в некоторой степени растворяют исходный материал, и могут включать водные или безводные спирты, такие как метанол и этанол; амиды, такие как диметилформамид и диметилацетамид; галоидированные углеводороды, такие как метиленхлорид, хлороформ, 1,2-дихлорэтан или четыреххлористый углерод, и простые эфиры, такие как тетрагидрофуран, диэтиловый эфир и диоксан; предпочтительны спирты, более предпочтителен метанол.
Применяемое здесь основание может включать гидроксиды щелочных металлов, такие как гидроксид лития, гидроксид натрия и гидроксид калия; карбонаты щелочных металлов, такие как карбонат натрия и карбонат калия; алкоксиды щелочных металлов, такие как метоксид натрия и этоксид натрия, и аммиак, предпочтительно аммиак.
Температура реакции составляет от 0 до 50°С, предпочтительно от 10 до 40°С.
Время взаимодействия составляет от 10 мин до 24 ч, предпочтительно от 10 мин до 15 часов. После взаимодействия желаемое соединение (1с) этой реакции получают, например, посредством концентрирования реакционной смеси, добавления органического растворителя, не смешивающегося с водой, такого как этилацетат, промывки водой, выделения органического слоя, содержащего желаемое соединение, сушки над безводным сульфатом магния и отгонки растворителя.
Полученный таким образом целевой продукт может быть дополнительно очищен, в случае необходимости, традиционным способом, например перекристаллизацией и на хроматографической колонке с силикагелем и т.п.
Описанное выше промежуточное соединение (3) может быть получено способами от В до D, приведенными ниже.
В способах В - D X и Y имеют те же самые значения, которые определены выше; R9 представляет собой группу, которая образует отщепляемую группу; Е представляет собой этиленовую, триметиленовую или тетраметиленовую группу, и Z является простой связью, метиленовой или этиленовой группой.
Группа, которая образует отщепляемую группу R9 может включать группу, описанную выше для R7, предпочтительно трифторметансульфонильную группу.
R11 и R12 являются одинаковыми и представляют собой атом водорода или, взятые вместе, образуют атом кислорода.
В случае, когда R11 и R12, взятые вместе, образуют атом кислорода, R10 представляет собой алкильную группу, имеющую от 1 до 4 атомов углерода, такую как метил, этил, пропил, изопропил, бутил, изобутил, втор-бутил и трет-бутил, предпочтительно метильную группу. В случае, когда R11 и R12 являются одинаковыми и представляют собой атом водорода, R10 может включать аралкильную группу, такую как бензильная группа; алкоксиалкильную группу, такую как метоксиметильная группа; бензоилоксиметильную группу, такую как бензилоксиметильная группа, аралкилоксиметильную группу, такую как бензилоксиметильная группа; алкоксиалкоксиалкильную группу, такую как метоксиэтоксиметильную группу; силильную группу, такую как триметилсилильная, трет-бутилдиметилсилильная, дифенилметилсилильная, дифенилбутилсилильная, дифенилизопропилсилильная и фенилдиизопропилсилильная.
Соединение (7), т.е. исходный материал, используемый в способе В или способе С, можно получить следующим образом.
Конкретно соединение, соответствующее соединению (6), в котором функциональная группа X является атомом водорода, получают из 1,1,5,6-диизопропилиден-D-глюкозы (на распродаже) в соответствии с описанным в литературе способом (R.D. Youssefyeh, J.P.H. Verheyden, J.G. Moffatt. J. Org. Chem., 44, 1301-1309 (1979)) и затем соединение (6) может быть получено в соответствии с описанным в литературе способом (Т. Waga, Т. Nishizaki, I. Miyakawa, H. Ohrui, H. Meguro, Biosci. Biotechnol. Biochem., 57, 1433-1438 (1993)) (в случае, когда Х=бензил).
Способ В
Стадия В-1
Настоящая стадия предназначается для получения соединения (8) путем взаимодействия соединения (7), которое получено указанным выше способом, с реагентом для введения отщепляемой группы в присутствии основного катализатора в инертном растворителе.
Используемые с этой целью растворители могут включать амиды, такие как диметилформамид и диметилацетамид; галоидированные углеводороды, такие как метиленхлорид, хлороформ, 1,2-дихлорэтан или четыреххлористый углерод, и простые эфиры, такие как тетрагидрофуран, диэтиловый эфир и диоксан; предпочтителен метиленхлорид.
Применяемый здесь основный катализатор может предпочтительно включать основания, такие как триэтиламин, пиридин и диметиламинопиридин.
Реагент, используемый для введения отщепляемой группы, может включать предпочтительно хлорид трифторметансульфоновой кислоты или ангидрид трифторметансульфоновой кислоты.
Температура реакции изменяется в зависимости от исходного материала, растворителя и кислотного катализатора, но обычно она составляет от -100 до -50°С, предпочтительно от -100 до -70°С.
Время взаимодействия изменяется в зависимости от исходного материала, растворителя, кислотного катализатора и температуры реакции, но обычно оно составляет от 30 мин до 12 ч, предпочтительно от 30 мин до 3 ч.
После взаимодействия желаемое соединение (8) этой реакции получают, например, посредством концентрирования реакционной смеси, добавления органического растворителя, не смешивающегося с водой, такого как этилацетат, промывки водой, выделения органического слоя, содержащего желаемое соединение, сушки над безводным сульфатом магния и отгонки растворителя.
Полученный таким образом целевой продукт может быть дополнительно очищен, в случае необходимости, традиционным способом, например перекристаллизацией и хроматографически на колонке с силикагелем.
Стадия В-2
Настоящая стадия предназначается для получения соединения (9) путем взаимодействия соединения (8), полученного на стадии В-1, с цианирующим реагентом, в инертном растворителе.
Используемые с этой целью растворители могут включать амиды, такие как диметилформамид и диметилацетамид; галоидированные углеводороды, такие как метиленхлорид, хлороформ, 1,2-дихлорэтан или четыреххлористый углерод; простые эфиры, такие как тетрагидрофуран, диэтиловый эфир и диоксан; ацетонитрил; диметилсульфоксид и т.п.; предпочтительны амиды (диметилформамид).
Используемый здесь цианирующий реагент может включать KCN, NaCN и триметилсиланцианид, предпочтительно NaCN.
Температура реакции изменяется в зависимости от исходного материала, растворителя и цианирующего реагента, но обычно она составляет от 0 до 100°С, предпочтительно от 30 до 70°С.
Время взаимодействия изменяется в зависимости от исходного материала, растворителя, цианирующего реагента и температуры реакции, но обычно оно составляет от 30 мин до 12 ч, предпочтительно от 1 до 3 часов.
После взаимодействия желаемое соединение (9) этой реакции получают, например, посредством концентрирования реакционной смеси, добавления органического растворителя, не смешивающегося с водой, такого как этилацетат, промывки водой, выделения органического слоя, содержащего желаемое соединение, сушки над безводным сульфатом магния и отгонки растворителя.
Полученный таким образом целевой продукт может быть дополнительно очищен, в случае необходимости, традиционным способом, например перекристаллизацией и на хроматографической колонке с силикагелем и т.п.
Стадия В-3
Настоящая стадия предусмотрена для получения соединения (10) путем взаимодействия соединения (9), полученного на стадии В-2, с восстанавливающим агентом в инертном растворителе.
Используемые с этой целью растворители могут включать галоидированные углеводороды, такие как хлористый метилен, хлороформ, 1,2-дихлорэтан или четыреххлористый углерод; алифатические углеводороды, такие как гексан, гептан, лигроин и петролейный эфир; ароматические углеводороды, такие как бензол, толуол и ксилол; простые эфиры, такие как диэтиловый эфир, диизопропиловый эфир, тетрагидрофуран, диоксан, диметоксиэтан и диметиловый эфир диэтиленгликоля, и кетоны, такие как ацетон, метилэтилкетон, метилизобутилкетон, изофорон и циклогексанон; предпочтительны галоидированные углеводороды (особенно хлористый метилен).
Используемый здесь восстанавливающий агент может включать диизобутилалюминийгидрид и триэтоксиалюминийгидрид, предпочтительно диизобутилалюминийгидрид.
Температура реакции изменяется в зависимости от исходного материала, растворителя и восстанавливающего агента, но обычно она составляет от -100 до -50°С, предпочтительно от -90 до -70°С.
Время взаимодействия изменяется в зависимости от исходного материала, растворителя, восстанавливающего агента и температуры реакции, но обычно оно составляет от 30 мин до 12 ч, предпочтительно от 1 до 5 ч.
После взаимодействия желаемое соединение (10) этой реакции получают, например, посредством концентрирования реакционной смеси, добавления органического растворителя, не смешивающегося с водой, такого как этилацетат, промывки водой, выделения органического слоя, содержащего желаемое соединение, сушки над безводным сульфатом магния и отгонки растворителя.
Полученный таким образом целевой продукт может быть дополнительно очищен, в случае необходимости, традиционным способом, например перекристаллизацией и на хроматографической колонке с силикагелем и т.п.
Стадия В-4
Настоящая стадия предназначается для получения соединения (За), одного из исходных материалов способа А, путем взаимодействия соединения (10), полученного на стадии В-3, с восстанавливающим агентом в инертном растворителе.
Используемые здесь растворители могут включать спирты, такие как метанол, этанол, н-пропанол, изопропанол, н-бутанол, изобутанол, трет-бутанол, изоамиловый спирт, диэтиленгликоль, глицерин, октанол, циклогексанол и метилцеллозольв, и уксусную кислоту, предпочтительны спирты (особенно этанол).
Используемый здесь восстанавливающий агент может включать борогидриды щелочных металлов, такие как борогидрид натрия и борогидрид лития; алюминийгидридные соединения, такие как литийалюминийгидрид и литийтриэтоксиалюминийгидрид, и бораны, предпочтительнен борогидрид натрия.
Температура реакции изменяется в зависимости от исходного материала, растворителя и восстанавливающего агента, но обычно она составляет от 0 до 50°С, предпочтительно от 10 до 40°С.
Время взаимодействия изменяется в зависимости от исходного материала, растворителя, восстанавливающего агента и температуры реакции, но обычно оно составляет от 10 мин до 12 ч, предпочтительно от 30 мин до 5 ч.
После взаимодействия желаемое соединение (3а) этой реакции получают, например, посредством разложения восстанавливающего агента, концентрирования реакционной смеси, добавления органического растворителя, не смешивающегося с водой, такого как этилацетат, промывки водой, выделения органического слоя, содержащего желаемое соединение, сушки над безводным сульфатом магния и отгонки растворителя.
Полученный таким образом целевой продукт может быть дополнительно очищен, в случае необходимости, традиционным способом, например перекристаллизацией и на хроматографической колонке с силикагелем и т.п.
Способ С
Стадия С-1
Настоящая стадия предназначается для получения соединения (11) путем взаимодействия соединения (7), полученного в приведенном выше способе, с окисляющим агентом в инертном растворителе.
Используемые здесь растворители могут включать алифатические углеводороды, такие как гексан, гептан, лигроин и петролейный эфир; ароматические углеводороды, такие как бензол, толуол и ксилол; галоидированные углеводороды, такие как метиленхлорид, хлороформ, четыреххлористый углерод, дихлорэтан, хлорбензол и дихлорбензол; сложные эфиры, такие как этилформиат, этилацетат, пропилацетат, бутилацетат и диэтилкарбонат; простые эфиры, такие как диэтиловый эфир, диизопропиловый эфир, тетрагидрофуран, диоксан, диметоксиэтан и диметиловый эфир диэтиленгликоля, и кетоны, такие как ацетон, метилэтилкетон, метилизобутилкетон, изофорон и циклогексанон; предпочтительны галоидированные углеводороды (особенно хлористый метилен).
Окисляющий агент, применяемый здесь, может включать реактив Шверна (Swern) для окисления, реактив Dess-Martin для окисления, комплекс триоксида хрома, такой как комплекс пиридин гидрохлорид/триоксид хрома (хлорхромат пиридиния и дихромат пиридиния), предпочтительно реактив Шверна для окисления (а именно, диметилсульфоксид-оксалил хлорид).
Температура реакции изменяется в зависимости от исходного материала, растворителя и окисляющего агента, но обычно она составляет от -100 до -50°С, предпочтительно от -100 до -70°С.
Время взаимодействия изменяется в зависимости от исходного материала, растворителя, окисляющего агента и температуры реакции, но обычно оно составляет от 30 мин до 12 ч, предпочтительно от 1 до 5 ч.
После взаимодействия, желаемое соединение (11) этой реакции получают, например, посредством разложения окисляющего агента, концентрирования реакционной смеси, добавления органического растворителя, не смешивающегося с водой, такого как этилацетат, промывки водой, выделения органического слоя, содержащего желаемое соединение, сушки над безводным сульфатом магния и отгонки растворителя.
Полученный таким образом целевой продукт может быть дополнительно очищен, в случае необходимости, традиционным способом, например перекристаллизацией и на хроматографической колонке с силикагелем и т.п.
Стадия С-2
Настоящая стадия предназначается для получения соединения (12) путем взаимодействия соединения (11), полученного на стадии С-1, с реагентом, наращивающим углеродную цепь, в инертном растворителе.
Используемые здесь растворители могут включать алифатические углеводороды, такие как гексан, гептан, лигроин и петролейный эфир; ароматические углеводороды, такие как бензол, толуол и ксилол; галоидированные углеводороды, такие как метиленхлорид, хлороформ, четыреххлористый углерод, дихлорэтан, хлорбензол и дихлорбензол; сложные эфиры, такие как этилформиат, этилацетат, пропилацетат, бутилацетат и диэтилкарбонат; простые эфиры, такие как диэтиловый эфир, диизопропиловый эфир, тетрагидрофуран, диоксан, диметоксиэтан и диметиловый эфир диэтиленгликоля, и кетоны, такие как ацетон, метилэтилкетон, метилизобутилкетон, изофорон и циклогексанон; предпочтительны галоидированные углеводороды (особенно хлористый метилен).
Используемые здесь реагенты могут включать реактив Виттига (Wittig), реактив Horner-Emmons, реактив Петерсона (Peterson), системный реактив TiCl4-CH2Cl2-Zn и реактив Теббе (Tebbe), предпочтительно реактив Виттига, реактив Horner-Emmons и реактив Теббе.
Температура реакции изменяется в зависимости от исходного материала, растворителя и реагента, наращивающего углеродную цепь, но обычно она составляет от -20 до 20°С, предпочтительно 0°С.
Время взаимодействия изменяется в зависимости от исходного материала, растворителя, реагента, наращивающего углеродную цепь, и температуры реакции, но обычно оно составляет от 30 мин до 12 ч, предпочтительно от 1 до 5 ч.
После взаимодействия желаемое соединение (12) этой реакции получают, например, посредством концентрирования реакционной смеси, добавления органического растворителя, не смешивающегося с водой, такого как этилацетат, промывки водой, выделения органического слоя, содержащего желаемое соединение, сушки над безводным сульфатом магния и отгонки растворителя.
Полученный таким образом целевой продукт может быть дополнительно очищен, в случае необходимости, традиционным способом, например перекристаллизацией и на хроматографической колонке с силикагелем и т.п.
Стадия С-3
Настоящая стадия предназначается для получения соединения (3а) путем селективного введения гидроксильной группы при концевом атоме углерода по двойной связи соединения (12), полученного на стадии С-2, в инертном растворителе.
Используемые здесь растворители могут включать алифатические углеводороды, такие как гексан, гептан, лигроин и петролейный эфир; ароматические углеводороды, такие как бензол, толуол и ксилол; галоидированные углеводороды, такие как метиленхлорид, хлороформ, четыреххлористый углерод, дихлорэтан, хлорбензол и дихлорбензол; сложные эфиры, такие как этилформиат, этилацетат, пропилацетат, бутилацетат и диэтилкарбонат; простые эфиры, такие как диэтиловый эфир, диизопропиловый эфир, тетрагидрофуран, диоксан, диметоксиэтан и диметиловый эфир диэтиленгликоля, и кетоны, такие как ацетон, метилэтилкетон, метилизобутилкетон, изофорон и циклогексанон; предпочтительны простые эфиры (особенно тетрагидрофуран).
Реагент, применяемый в этой реакции, может включать боран, диизоамилборан, трет-гексилборан, 9-BBN (9-борабицикло[3.3.1]нонан), предпочтительно 9-BBN.
Температура реакции изменяется в зависимости от исходного материала, растворителя и реагента, но обычно она составляет от 0 до 50°С, предпочтительно от 10 до 40°С.
Время взаимодействия изменяется в зависимости от исходного материала, растворителя, реагента и температуры реакции, но обычно оно составляет от 6 до 48 ч, предпочтительно от 12 до 24 часов.
После взаимодействия желаемое соединение (3а) этой реакции получают, например, посредством концентрирования реакционной смеси, добавления органического растворителя, не смешивающегося с водой, такого как этилацетат, промывки водой, выделения органического слоя, содержащего желаемое соединение, сушки над безводным сульфатом магния и отгонки растворителя.
Полученный таким образом целевой продукт может быть дополнительно очищен, в случае необходимости, традиционным способом, например перекристаллизацией и на хроматографической колонке с силикагелем и т.п.
Способ D
Стадия D-1
Настоящая стадия предназначается для получения соединения (13) путем взаимодействия соединения (11), полученного на стадии С-1, с реагентом, наращивающим углеродную цепь, в инертном растворителе.
Используемые здесь растворители могут включать алифатические углеводороды, такие как гексан, гептан, лигроин и петролейный эфир; ароматические углеводороды, такие как бензол, толуол и ксилол; галоидированные углеводороды, такие как метиленхлорид, хлороформ, четыреххлористый углерод, дихлорэтан, хлорбензол и дихлорбензол; сложные эфиры, такие как этилформиат, этилацетат, пропилацетат, бутилацетат и диэтилкарбонат; простые эфиры, такие как диэтиловый эфир, диизопропиловый эфир, тетрагидрофуран, диоксан, диметоксиэтан и диметиловый эфир диэтиленгликоля, и кетоны, такие как ацетон, метилэтилкетон, метилизобутилкетон, изофорон и циклогексанон; предпочтительно простые эфиры (особенно тетрагидрофуран), более предпочтительно галоидированные углеводороды (особенно хлористый метилен).
Используемые здесь реагенты могут включать реактив Виттига и реактив Horner-Einmons.
Температура реакции изменяется в зависимости от исходного материала, растворителя и реагента но обычно она составляет от -20 до 40°С, предпочтительно от 0 до 20°С.
Время взаимодействия изменяется в зависимости от исходного материала, растворителя, реагента и температуры реакции, но обычно оно составляет от 30 мин до 12 ч, предпочтительно от 1 до 5 ч.
После взаимодействия желаемое соединение (13) этой реакции получают, например, посредством концентрирования реакционной смеси, добавления органического растворителя, не смешивающегося с водой, такого как этилацетат, промывки водой, выделения органического слоя, содержащего желаемое соединение, сушки над безводным сульфатом магния и отгонки растворителя.
Полученный таким образом целевой продукт может быть дополнительно очищен, в случае необходимости, традиционным способом, например перекристаллизацией и на хроматографической колонке с силикагелем и т.п.
Стадия D-2
Настоящая стадия предназначается для получения соединения (14) путем взаимодействия соединения (13), полученного на Стадии D-1, с восстанавливающим агентом в инертном растворителе.
Настоящая стадия может быть проведена в соответствии с вариантом (2) стадии А-5. В случае, когда R10 представляет собой необязательно замещенную бензильную группу, а R11 и R12 являются атомами водорода, соединение (3b) может быть получено непосредственно на этой стадии.
Стадия D-3
Настоящая стадия предназначается для получения соединения (3b), одного из исходных материалов способа А, путем взаимодействия соединения (14), полученного на стадии D-2, с восстанавливающим агентом.
(а) В случае, когда R11 и R12, взятые вместе, образуют атом кислорода.
Используемые здесь растворители могут включать спирты, такие как метанол, этанол, н-пропанол, изопропанол, н-бутанол, изобутанол, трет-бутанол, изоамиловый спирт, диэтиленгликоль, глицерин, октанол, циклогексанол и метилцеллозольв, и уксусную кислоту; предпочтительны спирты (особенно этанол).
Используемый здесь восстанавливающий агент может включать борогидриды щелочных металлов, такие как боргидрид лития; алюминийгидридные соединения, такие как литийалюминийгидрид и литийтриэтоксиалюминийгидрид, и бораны; предпочтительны боран и литийалюминийгидрид.
Температура реакции изменяется в зависимости от исходного материала, растворителя и восстанавливающего агента, но обычно она составляет от 0 до 50°С, предпочтительно от 10 до 40°С.
Время взаимодействия изменяется в зависимости от исходного материала, растворителя, восстанавливающего агента и температуры реакции, но обычно оно составляет от 10 мин до 12 ч, предпочтительно от 30 мин до 5 ч.
После взаимодействия желаемое соединение (3b) этой реакции получают, например, посредством разложения восстанавливающего агента, концентрирования реакционной смеси, добавления органического растворителя, не смешивающегося с водой, такого как этилацетат, промывки водой, выделения органического слоя, содержащего желаемое соединение, сушки над безводным сульфатом магния и отгонки растворителя.
Полученный таким образом целевой продукт может быть дополнительно очищен, в случае необходимости, традиционным способом, например перекристаллизацией и на хроматографической колонке с силикагелем и т.п.
(b) В случае, когда R11 и R12 представляют собой атомы водорода и R10 является группой, отличающейся от бензильной группы.
В случае, когда R10 является силильной группой, настоящая стадия может быть проведена в соответствии со способом (3) стадии А-5.
В случае, когда R10 является аралкильной группой, такой как бензильная группа; алкоксиалкильной группой, такой как метоксиметильная группа; арилкарбонилоксиметильной группой, такой как бензоилоксиметильная группа, или аралкилоксиметильной группой, такой как бензилоксиметильная группа, и алкоксиалкоксиалкильной группой, такой как метоксиэтоксиметильная группа, используется кислотный катализатор, причем используемый в этом случае кислотный катализатор может включать органическую кислоту, такую как п-толуолсульфоновая кислота, трифторуксусная кислота и дихлоруксусная кислота, и кислоты Льюиса, такие как ВF3 и АlСl3.
Используемые здесь растворители могут включать ароматические углеводороды, такие как бензол, толуол и ксилол; галоидированные углеводороды, такие как хлористый метилен, хлороформ, четыреххлористый углерод, 1,2-дихлорэтан, хлорбензол и дихлорбензол; нитрилы, такие как ацетонитрил и изобутиронитрил; амиды, такие как формамид, N,N-диметилформамид, N,N-диметилацетамид, N-метил-2-пирролидон, N-метилпирролидинон и гексаметилфосфоротриамид, и сероуглерод.
Температура реакции изменяется в зависимости от исходного материала, растворителя и кислотного катализатора, но обычно она составляет от 0 до 50°С, предпочтительно от 10 до 40°С.
Время взаимодействия изменяется в зависимости от исходного материала, растворителя, кислотного катализатора и температуры реакции, но обычно оно составляет от 10 мин до 12 ч, предпочтительно от 30 мин до 5 часов.
После взаимодействия желаемое соединение (3b) этой реакции получают, например, путем нейтрализации реакционной смеси, добавления органического растворителя, не смешивающегося с водой, такого как этилацетат, промывки водой, выделения органического слоя, содержащего желаемое соединение, сушки над безводным сульфатом магния и отгонки растворителя.
Полученный таким образом целевой продукт может быть дополнительно очищен, в случае необходимости, традиционным способом, например, перекристаллизацией, на хроматографической колонке с силикагелем и т.п.
Олигонуклеотиды, содержащие модифицированный нуклеозид или его тиоатную производную, могут быть получены по способу Е, который описан ниже, с использованием соединения (1) настоящего изобретения.
В способе Е А имеет то же самое значение, что приведено выше; R13 представляет собой защитную группу гидроксила (в частности, тритильную группу, которая может быть замещена метоксигруппой); R13 представляет собой фосфонильную группу или группу, образовавшуюся при взаимодействии монозамещенных хлор(алкокси)фосфинов или дизамещенных алкоксифосфинов, описанных ниже.
Способ Е
Стадия Е-1
Настоящая стадия предназначается для получения соединения (15) путем взаимодействия соединения (1с), полученного в способе А, с защитным реагентом в инертном растворителе.
Используемые здесь растворители предпочтительно могут включать ароматические углеводороды, такие как бензол, толуол и ксилол; галоидированные углеводороды, такие как хлористый метилен, хлороформ, четыреххлористый углерод, дихлорэтан, хлорбензол и дихлорбензол; сложные эфиры, такие как этилформиат, этилацетат, пропилацетат, бутилацетат и диэтилкарбонат; простые эфиры, такие как диэтиловый эфир, диизопропиловый эфир, тетрагидрофуран, диоксан, диметоксиэтан и диметиловый эфир диэтиленгликоля; кетоны, такие как ацетон, метилэтилкетон, метилизобутилкетон, изофорон и циклогексанон; нитросоединения, такие как нитроэтан и нитробензол; нитрилы, такие как ацетонитрил и изобутиронитрил; амиды, такие как формамид, диметилформамид (ДМФ), диметилацетамид и гексаметилфосфоротриамид; сульфоксиды, такие как диметилсульфоксид и сульфолан; алифатические третичные амины, такие как триметиламин, триэтиламин и N-метилморфолин, и ароматические амины, такие как пиридин и пиколин; более предпочтительны галоидированные углеводороды (особенно хлористый метилен) и ароматические амины (особенно пиридин).
Используемый здесь защитный реагент конкретно не ограничивается, пока он может селективно защитить только положение 5' и он может быть удален в условиях кислотной или нейтральной среды, однако предпочтительно он может включать триарилметилгалогениды, такие как тритилхлорид, монометокситритилхлорид и диметокситритилхлорид.
В случае, когда в качестве защитного реагента используются триарилметилгалогениды, обычно применяют основание.
В таком случае применяемое основание может включать гетероциклические амины, такие как пиридин, диметиламинопиридин и пирролидинопиридин, и алифатические третичные амины, такие как триметиламин и триэтиламин; предпочтительны пиридин, диметиламинопиридин и пирролидинопиридин.
В случае, когда в качестве растворителя используется жидкая фаза, поскольку само основание играет роль агента, связывающего кислоту, то нет необходимости добавлять другое основание.
Температура реакции изменяется в зависимости от исходного материала, растворителя и реагента, но обычно она составляет от 0 до 150°С, предпочтительно от 20 до 100°С.
Время взаимодействия изменяется в зависимости от исходного материала, растворителя и температуры реакции, но обычно оно составляет от 1 до 100 ч, предпочтительно от 2 до 24 часов.
После взаимодействия желаемое соединение (15) этой реакции получают, например, путем концентрирования реакционной смеси, добавления органического растворителя, не смешивающегося с водой, такого как этилацетат, промывки водой, выделения органического слоя, содержащего желаемое соединение, сушки над безводным сульфатом магния и отгонки растворителя.
Полученный таким образом целевой продукт может быть дополнительно очищен, в случае необходимости, традиционным способом, например перекристаллизацией, на хроматографической колонке с силикагелем и т.п.
Стадия Е-2
Настоящая стадия предназначается для получения соединения (16) путем взаимодействия соединения (15), полученного на Стадии Е-1, с монозамещенными хлор(алкокси)фосфинами или дизамещенными алкоксифосфинами, которые обычно используются для амидирования в инертном растворителе.
Используемые с этой целью растворители специально не ограничиваются, если они не замедляют реакцию и предпочтительно могут включать простые эфиры, такие как тетрагидрофуран, диэтиловый эфир и диоксан, и галоидированные углеводороды, такие как метиленхлорид, хлороформ, четыреххлористый углерод, дихлорэтан, хлорбензол и дихлорбензол.
Используемые здесь монозамещенные хлор(алкокси)фосфины могут включать фосфиновые производные, такие как хлор(морфолино)метоксифосфин, хлор(морфолино)цианэтоксифосфин, хлор(диметиламино)метоксифосфин, хлор(диметиламино)цианэтоксифосфин, хлор(диизопропиламино)метоксифосфин и хлор(диизопропиламино)цианэтоксифосфин, предпочтительно хлор(морфолино)метоксифосфин, хлор(морфолино)цианэтоксифосфин, хлор(диизопропиламино)метоксифосфин и хлор(диизопропиламино)цианэтоксифосфин.
В случае, когда используются монозамещенные хлор(алкокси)фосфины, применяется связывающий кислоту агент, и в таком случае связывающий кислоту агент, применяемый здесь, может включать гетероциклические амины, такие как пиридин и диметиламинопиридин, и алифатические амины, такие как триметиламин, триэтиламин и диизопропиламин; предпочтительны алифатические амины (особенно диизопропиламин).
Используемые здесь дизамещенные алкоксифосфины могут включать фосфиновые производные, такие как бис(диизопропиламино)цианэтоксифосфин, бис(диэтиламино)метансульфонилэтоксифосфин, бис(диизопропиламино)(2,2,2-трихлорэтокси)фосфин и бис(диизопропиламино)(4-хлорфенилметокси)фосфин, предпочтителен бис(диизопропиламино)цианэтоксифосфин.
В случае, когда используются дизамещенные алкоксифосфины, применяется кислота, и в таком случае применяемая кислота предпочтительно может включать тетразол, уксусную кислоту или п-толуолсульфоновую кислоту.
Температура реакции не ограничивается, но обычно она составляет от 0 до 80°С, предпочтительна комнатная температура.
Время взаимодействия изменяется в зависимости от исходного материала, реагента и температуры реакции, но обычно оно составляет от 5 мин до 30 ч, предпочтительно от 30 мин до 10 часов, в случае, когда реакцию проводят при комнатной температуре.
После взаимодействия желаемое соединение (16) этой реакции получают, например, путем соответствующей нейтрализации реакционной смеси, удаления нерастворимых веществ фильтрацией, в случае если они присутствуют, добавления органического растворителя, не смешивающегося с водой, такого как этилацетат, промывки водой, выделения органического слоя, содержащего желаемое соединение, сушки над безводным сульфатом магния и отгонки растворителя. Полученный таким образом целевой продукт может быть дополнительно очищен, в случае необходимости, традиционным способом, например перекристаллизацией, повторным осаждением или хроматографически и т.п.
Альтернативно настоящая стадия предназначается для получения соединения (16) путем взаимодействия соединения (15), полученного на Стадии Е-1, с трис-(1,2,4-триазолил)фосфитом в инертном растворителе, предпочтительно в галоидированных углеводородах, таких как метиленхлорид, с последующим добавлением воды для того, чтобы вызвать Н-фосфонирование.
Температура реакции конкретно не ограничивается, но обычно она составляет от -20 до 100°С, предпочтительно от 10 до 40°С.
Время взаимодействия изменяется в зависимости от исходного материала, реагента и температуры реакции, но обычно оно составляет от 5 мин до 30 ч, предпочтительно 30 мин, в случае, когда реакцию проводят при комнатной температуре.
После взаимодействия желаемое соединение (16) этой реакции получают, например, путем соответствующей нейтрализации реакционной смеси, удаления нерастворимых веществ фильтрацией, в случае если они присутствуют, добавления органического растворителя, не смешивающегося с водой, такого как этилацетат, промывки водой, выделения органического слоя, содержащего желаемое соединение, сушки над безводным сульфатом магния и отгонки растворителя. Полученный таким образом целевой продукт может быть дополнительно очищен, в случае необходимости, традиционным способом, например перекристаллизацией, повторным осаждением или хроматографически и т.п.
Стадия Е-3
На этой стадии целевой олигонуклеотидный аналог получают с помощью автоматического ДНК-синтетизатора с использованием по меньшей мере одного соединения (16), полученного на стадии Е-2, и имеющихся в продаже фосфоамидитных реагентов, необходимых для получения олигонуклеотидного аналога с желаемой нуклеотидной последовательностью, в соответствии с традиционными способами.
Олигонуклеотидный аналог, имеющий желаемую нуклеотидную последовательность, может быть синтезирован с помощью ДНК-синтетизатора, такого как Perkin-Elmer, модель 392, с использованием фосфоамидитного способа, в соответствии с методом, описанным в литературе (Nucleic Acids Research, т. 12, с. 4539 (1984)).
Кроме того, в случае превращения в тиоат, по желанию, тиоатная производная может быть получена согласно методу, который описан в литературе (Tetrahedron Letters, т. 32, с. 3005 (1991), J. Am. Chem. Soc., т. 112, с. 1253 (1990)), с использованием, кроме серы, реагента, который образует тиоат, посредством взаимодействия с трехвалентной фосфорной кислотой, такого как тетраэтилтиурамдисульфид (TETD, фирма Applied Biosystems Inc.) или реагент Beaucage (фирма Millipore Corp.).
Полученный олигонуклеотидный аналог может быть очищен с помощью колонки OligoPak (хроматографическая колонка с обращенной фазой), причем чистота продукта может быть подтверждена с помощью HPLC (ВЭЖК).
Длина цепи полученного олигонуклеотидного аналога обычно составляет от 2 до 50, предпочтительно от 10 до 30 нуклеотидов.
Способность к образованию комплементарной цепи и устойчивость к нуклеазам полученного олигонуклеотидного аналога можно определить в соответствии с описанными ниже методами.
Тест-метод 1
Способность к образованию гибрида олигонуклеотидного аналога настоящего изобретения с комплементарными ДНК и/или РНК может быть определена путем отжига различных синтезированных олигонуклеотидных аналогов с олигонуклеотидными аналогами, состоящими из ДНК или РНК природного происхождения, имеющих комплементарную последовательность, и измерения температуры плавления (величина Тm).
Раствор образца, содержащий равные количества олигонуклеотидного аналога и комплементарного олигонуклеотида природного происхождения в натрийфосфатном буферном растворе, помещают в кипящую водяную баню и затем медленно охлаждают до комнатной температуры в течение определенного времени (отжиг). Затем раствор помещают в кювету спектрофотометра (например, Shimadzu UV-2100PC), постепенно повышают температуру от 20 до 90°С с последующим измерением поглощения при 260 нм.
Тест-метод 2. Определение устойчивости к нуклеазам
К олигонуклеотиду в буферном растворе добавляют нуклеазу и смесь нагревают. В качестве примера использовали фосфодиэстэразу змеиного яда, эндонуклеазу Р1 и эндонуклеазу S1. Тестирование можно проводить в любом буферном растворе, однако предпочтительно использовать буферный раствор, подходящий для конкретного фермента; так в случае фосфодиэстэразы змеиного яда используют Tris-HCl, а в случае эндонуклеазы Р1 используют ацетат натрия. Кроме того, по необходимости, в буферный раствор добавляют ионы металлов. Примеры используемых ионов металла включают Мg2+ в случае фосфодиэстэразы змеиного яда и Zn2+ в случае эндонуклеаз. Температура реакции предпочтительно составляет от 0 до 100°С, более предпочтительно от 30 до 50°С.
Спустя определенный промежуток времени добавляют этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA) и смесь нагревают 2 минуты при 100°С для остановки реакции.
Для оценки количества оставшегося олигонуклеотида используют меченный радиоизотопом олигонуклеотид с последующим анализом продукта реакции расщепления с использованием какого-либо анализатора, например HPLC или с окрашиванием красителем (таким как этидийбромид) с анализом с помощью компьютера.
Лекарственные формы олигонуклеотидного аналога, имеющего одну, или две, или более структур формулы (2) настоящего изобретения, могут представлять собой таблетки, капсулы, гранулы, порошки или сиропы для перорального применения, или инъекций, или суппозитории для парэнтерального применения. Такие лекарственные формы получают хорошо известными способами с применением добавок, таких как наполнители (например, органические наполнители, такие как производные сахаров, например лактозы, сахарозы, глюкозы, маннита и сорбита; производные крахмала, например кукурузного крахмала, картофельного крахмала, альфа-крахмала и декстрина; производные целлюлозы, например кристаллической целлюлозы; аравийская камедь; декстран; и Pullulan; и неорганические наполнители, такие как производные силикатов, например, легкий кремниевый ангидрид, синтетический алюмосиликат, силикат кальция и метасиликат алюмината магния; фосфаты, например гидрофосфат кальция; карбонаты, например карбонат кальция; и сульфаты, например, сульфат кальция), лубриканты (например, стеариновая кислота, металлические соли стеариновой кислоты, такие как стеарат кальция и стеарат магния; тальк; коллоидный диоксид кремния; воски, такие как пчелиный воск и спермацет; борная кислота; адипиновая кислота; сульфаты, например сульфат натрия; гликоль; фумаровая кислота; бензоат натрия; DL-лейцин; натриевые соли жирных кислот; лаурилсульфаты, такие как лаурилсульфат натрия и лаурилсульфат магния; кремниевые кислоты, такие как кремниевый ангидрид и гидрат кремниевой кислоты; и приведенные выше производные крахмала), связующие агенты (например, гидроксипропилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, поливинилпирролидон, Macrogol и соединения, аналогичные приведенным выше наполнителям), измельчители (например, производные целлюлозы, такие как низкозамещенная гидроксипропилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза, кальцийкарбоксиметилцеллюлоза и натрийкарбоксиметилцеллюлоза с внутренним мостиком; и химически модифицированные крахмал-целлюлозы, такие как карбоксиметилкрахмал, карбоксиметилкрахмал натрия и мостиковый поливинилпирролидон), консерванты (пара-оксибензоаты, такие как метилпарабен и пропилпарабен; спирты, такие как хлорбутанол, бензиловый спирт и фенилэтиловый спирт; бензальконийхлорид; производные фенола, такие как фенол и крезол; тимерозал; дегидроуксусная кислота; и сорбиновая кислота), корректирующие добавки (например, обычно используются подсластители, подкисляющие агенты, ароматизаторы и др.), разбавители и т.д.
Хотя эти формы могут изменяться в зависимости от состояния болезни, возраста пациента, способов применения и т.д., например, в случае перорального применения, желательно вводить активный компонент в количестве от 0,01 мг/кг массы тела (предпочтительно 0,1 мг/кг массы тела) до 1000 мг/кг массы тела (предпочтительно 100 мг/кг массы тела) и в случае внутривенного назначения, желательно вводить активный компонент в количестве от 0,001 мг/кг массы тела (предпочтительно 0,01 мг/кг массы тела) до 100 мг/кг массы тела (предпочтительно 10 мг/кг массы тела), в виде единичной суточной дозы или в виде дозы, распределенной для приема несколько раз в день соответственно.
В спектрах ЯМР: шир. - широкий, с - синглет, д - дублет, т - триплет, м - мультиплет, кви - квинтет, ДМСО-d6 -пердейтеродиметилсульфоксид; FAB-MAS - Масс-спектр (бомбардировка быстрыми атомами); UV - УФ-спектр.
СВЕДЕНИЯ, ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ ВОЗМОЖНОСТЬ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Пример 1. 3',5'-ди-О-Бензил-2'-О,4'-С-этилен-4-N-бензоилцитидин (номер иллюстративного соединения 2-34)
Добавляют водный 2N раствор гидроксида натрия (68 мл) в раствор соединения, полученного в сравнительном примере 11 (6,80 г, 8,86 ммоль) в пиридине (136 мл) при 0°С и смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 1 часа. Реакционную смесь нейтрализуют, добавляя по каплям водную 20% уксусную кислоту, и экстрагируют хлороформом. Промывают хлороформовый слой насыщенным водным раствором хлористого натрия и концентрируют в вакууме. Остаток очищают хроматографически на колонке с силикагелем (используя смесь дихлорметан : метанол = 100:3 в качестве элюента) для того, чтобы получить указанное в заголовке соединение (3,3 г, 6,02 ммоль, 68%).
Спектр ЯМР 1H (400 МГц, СDСl3): 8,64(2Н, шир. с), 7,89 (2Н, д, 7,6 Гц), 7, 64-7, 60 (1Н, м), 7,54-7,51 (2Н, м), 7, 48-7, 37 (3Н, м), 7,36-7,26 (8Н, м), 6,18 (1Н,с), 4,70 (1Н, д, 11 Гц), 4,60 (1Н, д, 11 Гц), 4,55(1Н, д, 11 Гц), 4,46 (1Н, д, 2,9 Гц), 4,42 (1Н, д, 11 Гц), 4,10-4,02 (2Н, м), 3,89(1Н, д, 2,9 Гц), 3,75(1Н, д, 11 Гц), 3,62 (1Н, д, 11Гц), 2,34-2,26 (1H, м), 1,39-1,36 (1Н, м).
Масс-спектр (бомбардировка быстрыми атомами) FAB-MAS (mNBA): 554 (М+Н)+.
Пример 2. 2'-О,4'-С-Этилен-4-N-бензоилцитидин
(номер иллюстративного соединения 2-225)
Раствор (31,7 мл) 1,0 М трихлорборана в дихлорметане добавляют по каплям в раствор соединения, полученного в примере 1 (2,06 г, 3,72 ммоль) в безводном метиленхлориде (317 мл) при -78°С, и смесь перемешивают при этой температуре в течение 1 часа. Реакционную смесь медленно нагревают до -20°С, реакционную колбу помещают в баню со льдом и хлоридом натрия и смесь перемешивают при температуре между -20 и -10°С в течение 2 часов. Медленно добавляют в смесь метанол (12 мл) и смесь перемешивают в течение 10 мин. Значение рН реакционной смеси устанавливают равным 7-8, добавляя по каплям насыщенный водный раствор гидрокарбоната натрия. Смесь нагревают до комнатной температуры и концентрируют в вакууме. Остаток очищают хроматографически на колонке с силикагелем (используя смесь дихлорметан : метанол = 100:5 в качестве элюента) для того, чтобы получить указанное в заголовке соединение (1,21 г, 3,24 ммоль, 87%) в виде белого твердого вещества.
Спектр ЯМР 1H (500 МГц, ДМСО-d6): 11,23 (lH, шир. с), 8,70 (1Н, д, 7,2 Гц), 8,00 (2Н, д, 7,5 Гц), 7,3-6 (4Н, м), 5,97 (1Н, с), 5,35 (1Н, дд, 5 и 10 Гц), 4,10 (1Н, дд, 5 и 10 Гц), 4,03 (1Н, д, 3,2 Гц), 3,95-3,85 (2Н, м) 3,83 (1Н, д, 3,2 Гц), 3,65-3,51 (2Н, м), 2,06-1,98 (1Н, м), 1,26 (1Н, м).
FAB-MAS (mNBA): 374 (М+Н)+.
Пример 3. 2'-О,4'-С-Этиленцитидин (номер иллюстративного соединения 2-3)
Раствор соединения, полученного в примере 2 (0,1 г, 0,268 ммоль) в метаноле, насыщенном аммиаком (12 мл), выдерживают в течение ночи. Смесь концентрируют досуха для того, чтобы получить указанное в заголовке соединение (0,054 г, 75%) в виде белого твердого вещества.
Спектр ЯМР 1H (500 МГц, ДМСО-d6): 8,18 (1Н, д, 7,4 Гц), 7,10 (2Н, шир.), 5,84 (1Н, с), 5,69 (1Н, д, 7,6 Гц), 5,27-5,24 (2Н, м), 3,86 (1Н, д, 3,2 Гц), 3, 90-3, 78 (2Н, м), 3,76 (1Н, д, 3,2 Гц), 3,56 (1Н, дд, 5,5 и 12 Гц), 3,49 (1Н, дд, 5, 5 и 12 Гц), 2,01-1,93 (1Н, дт, 7,5 и 12 Гц), 1,22 (1Н, дд, 3,6 и 13 Гц).
FAB-MAS (mNBA): 270(М+Н)+.
Пример 4. 5'-О-Диметокситритил-2'-О,4'-С-этилен-4-N-бензоилцитидин
(номер иллюстративного соединения 2-39)
Раствор соединения, полученного в примере 2 (1,29 г, 3,46 ммоль), в безводном пиридине подвергают азеотропной перегонке для того, чтобы удалить воду. Продукт растворяют в безводном пиридине (26 мл) в атмосфере азота и добавляют в раствор 4,4'-диметокситритилхлорид (1,76 г, 5,18 ммоль), и смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. К реакционной смеси добавляют небольшое количество метанола и затем растворитель выпаривают в вакууме. Остаток распределяют между водой и хлороформом, и органический слой промывают насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия и насыщенным водным раствором хлорида натрия, и концентрируют в вакууме. Остаток очищают хроматографически на колонке с силикагелем (используя смесь дихлорметан : метанол = 100:5 в качестве элюента) для того, чтобы получить указанное в заголовке соединение (2,10 г, 3,11 ммоль, 90%) в виде бесцветного аморфного твердого вещества.
Спектр ЯМР 1H (270 МГц, ДМСО-d6): 11,27 (1H, шир. с), 8,59 (1Н, м), 6,92-8, 01 (19Н, м), 6,03 (1Н, с), 5,56 (1Н, м), 4,17 (1Н, м), 4,08 (1Н, м), 3,86 (2Н, м), 3,77 (6Н, с), 3,24 (2Н, м), 1,98 (1Н, м), 1,24 (1Н, м).
FAB-МАS (mNBA): 676 (М+Н)+.
Пример 5. 5'-О-Диметокситритил-2'-О,4'-С-этилен-4-N-бензоилцитидин-3'-О-(2-цианэтил-N,N-диизопропил)фосфоамидит (номер иллюстративного соединения 2-235)
Раствор соединения, полученного в примере 4 (6,53 г, 9,66 ммоль), в безводном пиридине подвергают азеотропной перегонке для того, чтобы удалить воду. Продукт растворяют в атмосфере азота в безводном дихлорметане (142 мл). В раствор добавляют N,N-диизопропиламин (2,80 мл, 16,1 ммоль) и затем 2-цианэтил-N,N-диизопропилхлорфосфоамидит (2,16 мл, 9,66 ммоль) добавляют по каплям в бане со льдом. Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 6 час. Реакционную смесь промывают насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия и насыщенным водным раствором хлорида натрия и концентрируют в вакууме. Остаток очищают хроматографически на колонке с силикагелем (используя смеси дихлорметан : триэтиламин = 50:1 – дихлорметан : этилацетат : триэтиламин = 60: 30: 1 в качестве элюента) для того, чтобы получить указанное в заголовке соединение (7,10 г, 8,11 ммоль, 84%) в виде бледно-желтого соединения.
Спектр ЯМР 1H(400 МГц, CDCl3): 1,1-1,2 (12 Н, м), 1,35(1Н, м), 2,11 (1Н, м), 2,3 (2Н, м), 3,35-3,7 (6Н, м), 3,8(6Н, м), 3,9-4,1 (2Н, м), 4,33 (1Н, м), 4,45 (1Н, м), 6,23 (1Н, с), 6,9 (4Н, м), 7,3-7,9 (15Н, м), 8,7-8,8 (1Н, м).
Пример 6. 3',5'-Ди-О-бензил-2'-О,4'-С-этилен-5-метилуридин (номер иллюстративного соединения 2-22)
Водный раствор (2N) гидроксида натрия и смешанный раствор (5 мл), указанный смешанный раствор имеет состав пиридин : метанол : вода = 65:30:5, добавляют к соединению, полученному в сравнительном примере 10 (418 мг, 0,62 ммоль), в смеси пиридин : метанол : вода = 65: 30: 5 (5 мл) при 0°С, и смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 15 мин. Реакционную смесь нейтрализуют 1N соляной кислотой и экстрагируют этилацетатом (приблизительно 30 мл). Органический слой промывают насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия (приблизительно 30 мл) и насыщенным водным раствором хлорида натрия (приблизительно 30 мл), сушат над безводным сульфатом магния и затем концентрируют в вакууме. Остаток очищают хроматографически на колонке с силикагелем (используя смесь гексан : этилацетат = 1:1 в качестве элюента) для того, чтобы получить бесцветное аморфное твердое вещество (228 мг, 0,49 ммоль, 79%).
Спектр ЯМР 1H (400 МГц, СDСl3): 1,35 (1Н, д, 13 Гц), 1,41 (3Н, с), 2,28 (1Н, дт, 9,4 и 13 Гц), 3,60 (1Н, д, 11 Гц), 3,76 (1Н, д, 11 Гц), 3,94 (1Н, д, 3,0 Гц), 4,10 (1Н, д, 7,0 Гц), 4,14 (1Н, д, 7,0 Гц), 4,31 (1Н, д, 3,0 Гц), 4,51 (1Н, д, 12 Гц), 4,54 (1Н, д, 12 Гц), 4,58 (1Н, д, 12 Гц), 4,75 (1Н, д, 12 Гц), 6,06 (1Н, с), 7,3 (10Н, м), 7,91 (1Н, с), 8,42 (1Н, шир. с).
FAB-MAS (mNBA): 465 (M+H)+.
Пример 7. 2'-O,4'-С-Этилен-5-метилуридин (номер иллюстративного соединения 2-2)
Раствор соединения, полученного в примере 6 (195 мг, 0,42 ммоль), в метаноле (10 мл) перемешивают в среде водорода при атмосферном давлении в течение 5 час. Реакционную смесь фильтруют для того, чтобы удалить катализатор и фильтрат концентрируют в вакууме. Остаток очищают хроматографически на колонке с силикагелем (используя смесь дихлорметан: метанол =10:1 в качестве элюента) для того, чтобы получить бесцветный порошок (76 мг, 0,268 ммоль, 64%).
Спектр ЯМР 1H (400 МГц, CD3OD): 1,33 (1Н, дд, 3,8 и 13 Гц), 1,86 (3Н, д, 0,9 Гц), 1,94 (1Н, ддд, 7,5, 11,7 и 13 Гц), 3,68 (1Н, д, 12 Гц), 3,75 (1Н, д, 12 Гц), 3,9-4,0 (2Н, м), 4,05(1Н, д, 3,2 Гц), 4,09 (1Н, д, 3,2 Гц), 6,00 (1Н, с), 8,28 (1Н, д, 1,1 Гц).
FAB-MAS (mNBA): 285(М+Н)+.
Пример 8. 5'-О-Диметокситритил-2'-О,4'-С-этилен-5-метилуридин (номер иллюстративного соединения 2-27)
Раствор соединения, полученного в примере 7 (1,45 г, 5,10 ммоль), в безводном пиридине подвергают азеотропной перегонке для того, чтобы удалить воду. Продукт растворяют в безводном пиридине (44 мл) в атмосфере азота и в раствор добавляют 4,4'-диметокситритилхлорид (2,59 г, 7,65 ммоль), и смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Добавляют небольшое количество метанола к реакционной смеси и затем растворитель выпаривают в вакууме. Остаток распределяют между водой и хлороформом, и органический слой промывают насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия и насыщенным водным раствором хлорида натрия, и концентрируют в вакууме. Остаток очищают хроматографически на колонке с силикагелем (используя смесь дихлорметан : метанол = 100:10 в качестве элюента) для того, чтобы получить указанное в заголовке соединение (2,42 г, 4,13 ммоль, 81%) в виде бесцветного аморфного твердого вещества.
Спектр ЯМР 1Н (270 МГц, ДМСО-d6): 11,36 (1Н, с), 7,68 (1Н, с), 6,90-7,44 (13Н, м), 5,89 (1Н, с), 5,55 (1Н, д), 4,09 (1Н, м), 4,04 (1Н, д), 3,82 (2Н, м), 3,74 (6Н, с), 3,19 (2Н, м), 1,99 (1Н, м), 1,36 (1Н, м), 1,17 (3Н, с).
FAB-MAS (mNBA): 587 (М+Н)+.
Пример 9. 5'-О-Диметокситритил-2'-О,4'-С-этилен-5-метилуридин-3'-О-(2-цианэтил-N,N-диизопропил)фосфоамидит (номер иллюстративного соединения 2-234)
Раствор соединения, полученного в примере 8 (4,72 г, 8,05 ммоль), в безводном пиридине подвергают азеотропной перегонке для того, чтобы удалить воду. Продукт растворяют в атмосфере азота в безводном дихлорметане (142 мл). Добавляют N,N-диизопропиламин (2,80 мл, 16,1 ммоль) в раствор и затем добавляют по каплям 2-цианэтил-N,N-диизопропилхлорфосфоамидит (2,16 мл, 9,66 ммоль) в ледяной бане. Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 6 час. Реакционную смесь промывают насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия, насыщенным водным раствором хлорида натрия и концентрируют в вакууме. Остаток очищают хроматографически на колонке с силикагелем (используя смеси гексан : этилацетат : триэтиламин = 50:50:1 - гексан : этилацетат: триэтиламин = 30: 60: 1 в качестве элюента) для того, чтобы получить указанное в заголовке соединение (5,64 г, 7,17 ммоль, 89%) в виде бесцветного аморфного твердого вещества.
Спектр ЯМР 1H (400 МГц, СDСl3): 1,1-1,2 (15Н, м), 1,4 (1Н, м), 2,08 (1Н, м), 2,4 (2Н, м), 3,2-4,0 (14Н, м), 4,38 (2Н, м), 4,47 (1Н, м), 6,06 (1Н, с), 6,8-6,9 (4Н, м), 7,2-7,5 (9Н, м), 7,91 (1Н, м).
FAB-MAS (mNBA): 787 (M+H) +.
Пример 10. 3', 5'-Ди-О-бензил-2'-O,4'-С-этилен-6-N-бензоиладенозин
(номер иллюстративного соединения 1-23)
Водный 2N раствор гидроксида натрия и смешанный раствор (5 мл), указанный смешанный раствор содержит смесь пиридин : метанол : вода = 65:30:5, добавляют к соединению, полученному в сравнительном примере 12 (238 мг, 0,30 ммоль), в смеси пиридин : метанол : вода = 65:30:5 (5 мл) при 0°С и смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 15 мин. Реакционную смесь нейтрализуют 1N соляной кислотой и экстрагируют этилацетатом (приблизительно 30 мл).
Органический слой промывают насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия (приблизительно 30 мл) и насыщенным водным раствором хлорида натрия (приблизительно 30 мл), сушат над безводным сульфатом магния и затем концентрируют в вакууме. Остаток очищают хроматографически на колонке с силикагелем (используя смесь дихлорметан : метанол = 50:1 в качестве элюента) для того, чтобы получить бесцветное аморфное твердое вещество (133 мг, 0,23 ммоль, 78%).
Спектр ЯМР 1H (400 МГц, CDCl3): 1,44 (1Н, д, 13 Гц), 2,31 (1Н, дд, 13 и 19 Гц), 3,56 (1Н, д, 11 Гц), 3,70 (1Н, д, 11 Гц), 4,10 (2Н, м), 4,24 (1Н, с), 4,45 (1Н, д, 12 Гц), 4,53-4,67 (4Н, м), 6,52 (1Н, с), 7,3 (10Н, м), 7,53 (2Н, м), 7,62 (1Н, м), 8,03 (2Н, д, 7,6 Гц), 8,66 (1Н, с), 8,78 (1Н, с), 9,00 (1Н, шир. с).
FAB-MAS(mNBA): 578(М+Н)+.
Пример 11. 2'-О,4'-С-Этилен-6-N-бензоиладенозин (номер иллюстративного соединения 1-178)
Медленно добавляют по каплям 1М раствор трихлорида бора (1,5 мл, 1,5 ммоль) в дихлорметане к раствору соединения, полученного в примере 10 (116 мг, 0,20 ммоль), в безводном метиленхлориде (5 мл) при -78°С и смесь перемешивают при этой температуре в течение 3 час. К реакционной смеси добавляют 1М раствор трихлорида бора (1,5 мл, 1,5 ммоль) в дихлорметане и смесь перемешивают в течение 2 час. Смесь медленно нагревают до комнатной температуры, затем быстро охлаждают до -78°С и затем добавляют к смеси метанол (5 мл). Реакционную смесь медленно нагревают до комнатной температуры и концентрируют в вакууме. Остаток очищают хроматографически на колонке с силикагелем (используя смесь дихлорметан : метанол = 9:1 в качестве элюента) для того, чтобы получить белый порошок (49 мг, 0,17 ммоль, 84%).
Спектр ЯМР 1H (400 МГц, СD3ОD): 1,45 (1Н, дд, 4,3 и 13 Гц), 2,12 (1Н, м), 3,72 (1Н, д, 12 Гц), 3,79 (1Н, д, 12 Гц), 4,04 (1Н, дд, 7,3 и 12 Гц), 4,15 (1Н, дт, 4,3 и 9,4 Гц), 4,36 (1Н, д, 3,2 Гц), 4,43 (1Н, д, 3,2 Гц), 6,57 (1Н, с), 7,57 (2Н, м), 7,66 (1Н, м), 8,09 (2Н, д, 8,0 Гц), 8,72 (1Н, с), 8,85 (1Н, с).
FAB-MAS (mNBA): 398 (М+Н)+.
Пример 12. 2.' -O,4'-С-Этиленаденозин (номер иллюстративного соединения 1-7)
Раствор соединения, полученного в примере 11 (14 мг, 0,035 ммоль), в метаноле, насыщенном аммиаком (1 мл), выдерживают в течение ночи. Смесь концентрируют и остаток очищают хроматографически на колонке с силикагелем (используя смесь дихлорметан : метанол =10:1 в качестве элюента), получая белый порошок (10 мг, 0,034 ммоль, 98%).
Спектр ЯМР 1H(400 МГц, CD3OD): 1,32 (1Н, дд, 4 и 13 Гц), 2,04 (1Н, дт, 7,4 и 12 Гц), 3,53 (1Н, дд, 5 и 12 Гц), 3,61 (1Н, дд, 5,2 и 12 Гц), 3,90 (1Н, дд, 7,4 и 12 Гц), 3,97 (1Н, дт, 4 и 12 Гц), 4,15 (1Н, д, 3,1 Гц), 4,21 (1Н, д, 3,1 Гц), 5,27 (1Н, т, 5,2 Гц), 5,39 (1Н, д, 3,1 Гц), 6,33 (1Н, с), 7,29 (2Н, с), 7,66 (1Н, м), 8,14(1Н, с), 8,42(1Н, с).
FAB-MAS (mNBA): 294(М+Н)+.
УФ-спектр (λмакс): 260 (рН7), 260 (рН1), 258 (рН13).
Пример 13. 5'-О-Диметокситритил-2'-О,4'-С-этилен-6-N- бензоиладенозин
(номер иллюстративного соединения 1-31)
Раствор соединения, полученного в примере 11 (14 мг, 0,035 ммоль), в безводном пиридине подвергают азеотропной перегонке для того, чтобы удалить воду. Продукт растворяют в безводном пиридине (1 мл) в атмосфере азота, к раствору добавляют 4,4'-диметокситритилхлорид (18 мг, 0,053 ммоль) и смесь перемешивают при 40°С в течение 5 час. К реакционной смеси добавляют небольшое количество метанола, затем растворитель выпаривают в вакууме. Остаток распределяют между водой и хлороформом, органический слой промывают насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия и насыщенным водным раствором хлорида натрия и концентрируют в вакууме. Остаток очищают хроматографически на колонке с силикагелем (используя смесь дихлорметан : метанол =100:5 в качестве элюента) для того, чтобы получить указанное в заголовке соединение (18 мг, 0,026 ммоль, 73%) в виде бесцветного аморфного твердого вещества.
Спектр ЯМР 1H (400 МГц, СDСl3): 1,63 (1Н, м), 2,14 (1Н, 7,5,12 и 13 Гц), 3, 37 (1Н, д, 11 Гц), 3,41 (1Н, д, 11 Гц), 3,79 (6Н, с), 4,10 (2Н, м), 4,48 (1Н, д, 3,3 Гц), 4,59 (1Н, д, 3,3 Гц), 6,54 (1Н, с), 6,85 (4Н, м), 7,2-7,6 (12Н, м), 8,02 (2Н, м), 8,45 (1Н, с), 8,82 (1Н, с), 9,02 (1Н, шир. с).
FAB-MAS (mNBA): 700 (М+Н)+.
Пример 14. 5'-О-Диметокситритил-2'-О,4'-С-этилен-6-N-бензоиладенозин-3'-О-(2-цианэтил-N,N-диизопропил)фосфоамидит
(номер иллюстративного соединения 1-186)
Раствор соединения, полученного в примере 13 (16 мг, 0,023 ммоль), в безводном пиридине подвергают азеотропной перегонке, чтобы удалить воду. Продукт растворяют в безводном дихлорметане (0,5 мл) в атмосфере азота. Тетразоловую соль N,N-диизопропиламина (10 мг) добавляют к этому раствору и затем добавляют по каплям 2-цианэтил-N,N,N',N'-тетраизопропилфосфоамидит (приблизительно 20 мкл) в ледяной бане. Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь промывают насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия и насыщенным водным раствором хлорида натрия и концентрируют в вакууме. Остаток очищают хроматографически на колонке с силикагелем (используя смесь дихлорметан : этилацетат = 2:1 в качестве элюента), чтобы получить указанное в заголовке соединение (20 мг, 0,022 ммоль, 97%) в виде белого твердого вещества.
Спектр ЯМР 1H (400 МГц, СDСl3): 1,0-1,2 (12Н, м), 1,54 (1Н, м), 2,15 (1Н, м), 2,33 (2Н, м), 3,3-3,6 (6Н, м), 3,80 (6Н, с), 4,08 (2Н, м), 4,65 (1Н, м), 4,75 (1Н, м), 6,53 (1Н, с), 6,84 (4Н, м), 7,2-7,6 (12Н, м), 8,01 (2Н, м), 8,53 (1Н, с), 8,83(1Н, с), 9,01 (1Н, шир. с).
FAB-MAS(mNBA): 900(M+H)+.
Пример 15. 3',5'-Ди-О-бензил-2'-О,4'-С-этиленуридин (номер иллюстративного соединения 2-10)
Водный 1N раствор гидроксида натрия (2 мл) добавляют к раствору соединения, полученного в сравнительном примере 13 (194 мг, 0,292 ммоль), в пиридине (3 мл) при 0°С и смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 30 мин. Реакционную смесь нейтрализуют 1N соляной кислотой и экстрагируют этилацетатом (10 мл). Органический слой промывают насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия и насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушат над безводным сульфатом магния и затем концентрируют в вакууме. Остаток очищают хроматографически на колонке с силикагелем (используя смесь дихлорметан : метанол=100:3 в качестве элюента), получая бесцветное масло (105 мг, 0,233 ммоль, 80%).
Спектр ЯМР 1H (400 МГц, CDCl3): 1,36 (1Н, м), 2,29 (1Н, м), 3,63 (1Н, д, 11 Гц), 3,74 (1Н, д, 11 Гц), 3,87 (1Н, д, 2,9 Гц), 4,03 (2Н, м), 4,29 (1Н, д, 2,9 Гц), 4,49 (1Н, д, 12 Гц), 4,50 (1Н, д, 11 Гц), 4,53 (1Н, д, 11 Гц), 4,73 (1Н, д, 12 Гц), 5,20 (1Н, дд, 2 и 8 Гц), 6,04 (1Н, с), 7,2-7,4 (10Н, м), 8,13 (1Н, д, 8,2 Гц), 8,57 (1Н, шир. с).
FAB-MAS (mNBA): 451 (М+Н)+.
Пример 16. 2'-О,4'-С-Этилкенуридин (номер иллюстративного соединения 2-1)
Раствор соединения, полученного в примере 15 (100 мг, 0,222 ммоль), в метаноле (4 мл) перемешивают в среде водорода при атмосферном давлении в присутствии катализатора гидрирования в течение 5 час. Реакционную смесь фильтруют для того, чтобы удалить катализатор, и фильтрат концентрируют в вакууме. Остаток очищают хроматографически на колонке с силикагелем (используя смесь дихлорметан : метанол = 10: 1 в качестве элюента) для того, чтобы получить бесцветное масло (45 мг, 0,167 ммоль, 75%).
Спектр ЯМР 1H (400 МГц, СD3OD): 1,35 (1Н, дд, 4 и 13 Гц), 2,13 (1Н, ддд, 7, 11 и 13 Гц), 3,66 (1Н, д, 12 Гц), 3,73 (1Н, д, 12 Гц), 3,91-4,08 (2Н, м), 4,01 (1Н,д, 3,2 Гц), 4,12(1Н, д, 3,2 Гц), 5,66 (1Н, д, 8,2 Гц), 6,00 (1Н, с), 8,37 (1Н, д, 8,2 Гц).
FAB-MAS (mNBA): 271 (М+H)+.
Пример 17. 5'-О-Диметокситритил-2'-О,4'-С-этиленуридин (номер иллюстративного соединения 2-15)
Раствор соединения, полученного в примере 16 (28 мг, 0,104 ммоль), в безводном пиридине подвергают азеотропной перегонке для того, чтобы удалить воду. Продукт растворяют в безводном пиридине (3 мл) в атмосфере азота, добавляют в раствор 4,4'-диметокситритилхлорид (50 мг, 0,15 ммоль) и смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. К реакционной смеси добавляют небольшое количество метанола и затем растворитель выпаривают в вакууме. Остаток распределяют между водой и хлороформом, органический слой промывают насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия и насыщенным водным раствором хлорида натрия и концентрируют в вакууме. Остаток очищают хроматографически на колонке с силикагелем (используя смесь дихлорметан : метанол = 100:3 в качестве элюента) для того, чтобы получить указанное в заголовке соединение (25 мг, 0,044 ммоль, 42%) в виде бесцветного масла.
Спектр ЯМР 1H (400 МГц, СD3OD): 1,35 (1Н, дд, 3 и 14 Гц), 2,03 (1Н, ддд, 8, 11 и 14 Гц), 2,46 (1Н, д, 8 Гц), 3,36 (1H, д, 11 Гц), 3,41 (1Н, д, 11 Гц), 3,80 (3Н, с), 3,81 (3Н, с), 3,97 (2Н, м), 4,21 (1Н, д, 3,2 Гц), 4,33 (1Н, шир. м), 5,31 (1Н, м), 6,10 (1Н, с), 6,86 (4Н, м), 7,2-7,5 (9Н, м), 8,27 (1Н, д, 8,2 Гц), 8,43 (1Н, шир. с).
FAB-MAS (mNBA): 573(M+H)+.
Пример 18. 5'-О-Диметокситритил-2'-О,4'-С-этиленуридин-3'-О-(2-цианэтил-N,N-диизопропил)фосфоамидит (номер иллюстративного соединения 2-233)
Раствор соединения, полученного в примере 17 (6 мг, 0,0105 ммоль), в безводном пиридине подвергают азеотропной перегонке, чтобы удалить воду. Продукт растворяют в безводном дихлорметане (0,5 мл) в атмосфере азота. Тетразоловую соль N,N-диизопропиламина (3 мг) добавляют в раствор и затем добавляют по каплям 2-цианэтил-N,N,N',N'-тетраизопропилфосфоамидит (приблизительно 5 мкл) в ледяной бане. Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь промывают насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия и насыщенным водным раствором хлорида натрия и концентрируют в вакууме. Остаток очищают хроматографически на колонке с силикагелем (используя смесь дихлорметан : этилацетат = 2:1 в качестве элюента) для того, чтобы получить указанное в заголовке соединение (8 мг) в виде белого твердого вещества.
Спектр ЯМР 1H (400 МГц, CDCl3): 1,1-1,2 (13Н, м), 2,09 (1Н, м), 2,4 (2Н, м), 3,3-3,6 (6Н, м), 3,81 (6Н, м), 3,94 (2Н, м), 4,35 (1Н, м), 4,47 (1Н, м), 5,18 (1Н, д, 8,2 Гц), 6,08 (1Н, с), 6,86 (4Н, м), 7,2-7,4 (9Н, м), 8,31 (1Н, д, 8,2 Гц).
FAB-MAS (mNBA): 773(M+H)+.
Пример 19. 3',5'-Ди-О-бензил-2'-О,4'-С-этилен-4-N-бензоил-5-метилцитидин (номер иллюстративного соединения 2-46)
Водный 1N раствор гидроксида натрия (5 мл) добавляют к раствору соединения, полученного в сравнительном примере 14 (310 мг, 0,396 ммоль), в пиридине (5 мл) при 0°С и смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 20 мин. Реакционную смесь нейтрализуют, добавляя по каплям водный 20% раствор уксусной кислоты, и экстрагируют дихлорметаном. Дихлорметановый слой промывают насыщенным водным раствором хлорида натрия и концентрируют в вакууме. Остаток очищают хроматографически на колонке с силикагелем (используя смесь дихлорметан : метанол = 100:2 в качестве элюента) для того, чтобы получить указанное в заголовке соединение (190 мг, 0,334 ммоль, 84%).
Спектр ЯМР 1H (400 МГц, CDCl3): 1,37 (1Н, м), 1,58 (3Н, с), 2,30 (1Н, дт, 10 и 13 Гц), 3,64 (1Н, д, 11 Гц), 3,79 (1Н, д, 11 Гц), 3,95 (1Н, д, 3,0 Гц), 4,04 (2Н, дд, 2,3 и 10 Гц), 4,37 (1Н, д, 3,0 Гц), 4,50 (1Н, д, 12 Гц), 4,56 (1Н, д, 11 Гц), 4,61 (1Н, д, 11 Гц), 4,76 (1Н, д, 12 Гц), 6,11 (1Н, с), 7,2-7,5 (13Н, м), 8,09 (1Н, с), 8,29 (2Н, м).
FAB-MAS (mNBA): 568(M+H)+.
Пример 20. 2'-О,4'-С-Этилен-4-N-бензоил-5-метилцитидин (номер иллюстративного соединения 2-226)
Добавляют по каплям 1М раствор трихлорида бора (1,6 мл) в дихлорметане в раствор соединения, полученного в примере 19 (120 мг, 0,211 ммоль), в безводном дихлорметане (5 мл) при температуре -78°С и смесь перемешивают при -78°С 4 час. Медленно, по каплям добавляют метанол (1 мл) в смесь и эту смесь перемешивают 10 мин. Значение рН реакционной смеси доводят до 7-8, добавляя по каплям насыщенный водный раствор гидрокарбоната натрия. Реакционную смесь нагревают до комнатной температуры и концентрируют в вакууме. Остаток очищают хроматографически на колонке с силикагелем (используя смесь дихлорметан : метанол =100:6 в качестве элюента), чтобы получить указанное в заголовке соединение (29 мг, 0,075 ммоль, 36%) в виде белого твердого вещества.
Спектр ЯМР 1H (400 МГц, ДМСО-d6): 1,24 (1Н, м), 2,01 (3Н, с), 2,0 (1Н, м), 3,54 (1Н, дд, 5,4 и 12 Гц), 3,64 (1Н, дд, 5,4 и 12 Гц), 3,88 (3Н, м), 4,10 (1Н, м), 5,36 (1Н, д, 5,4 Гц), 5,49 (1Н, т, 5,0 Гц), 5,95 (1Н, с), 7,4-7,6 (3Н, м), 8,21 (2Н, м), 8,49 (1Н, с), 13,17 (1Н, шир. с).
FAB-MAS (mNBA): 388 (М+Н)+.
Пример 21. 5'-О-Диметокситритил-2'-О,4'-С-этилен-4-N-бензоил-5-метилцитидин (номер иллюстративного соединения 2-51)
Раствор соединения, полученного в примере 20 (44 мг, 0,114 ммоль), в безводном пиридине подвергают азеотропной перегонке, для того чтобы удалить воду. Продукт растворяют в безводном пиридине (1 мл) в атмосфере азота, добавляют в раствор 4,4'-диметокситритилхлорида (60 мг, 0,177 ммоль) и смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. К реакционной смеси добавляют небольшое количество метанола и затем растворитель выпаривают в вакууме. Остаток распределяют между водой и хлороформом. Органический слой промывают насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия и насыщенным водным раствором хлорида натрия и концентрируют в вакууме. Остаток очищают хроматографически на колонке с силикагелем (используя смесь дихлорметан : метанол = 100:4 в качестве элюента), чтобы получить указанное в заголовке соединение (73 мг, 0,106 ммоль, 93%) в виде бесцветного масла.
Спектр ЯМР 1H (400 МГц, CDCl3): 1,46 (1Н, м), 1,49 (3Н, с), 2,06 (1Н, м), 2,59 (1Н, д, 8,6 Гц), 3,36 (1H, д, 11 Гц), 3,39 (1Н, д, 11 Гц), 3,80 (3Н, с), 3,81 (3Н, с), 3,99 (2Н, м), 4,30 (1Н, д, 3,3 Гц), 4,39 (1Н, м), 6,12 (1Н, с), 6,85 (4Н, м), 7,2-7,5 (12Н, м), 8,03 (1Н, с), 8,28 (2Н, м).
FAB-MAS (mNBA): 573 (М+Н)+.
Пример 22. 5'-О-Диметокситритил-2'-О,4'-С-этилен-4-N-бензоил-5-метилцитидин-3'-О-(2-цианэтил-N,N-диизопропил)фосфоамидит (номер иллюстративного соединения 2-236)
Раствор соединения, полученного в примере 21 (35 мг, 0,0507 ммоль), в безводном пиридине подвергают азеотропной перегонке, чтобы удалить воду. Продукт растворяют в безводном дихлорметане (1 мл) в атмосфере азота. Тетразоловую соль N,N-диизопропиламина (17 мг) добавляют в раствор и затем добавляют по каплям 2-цианэтил-N,N,N',N'-тетраизопропилфосфоамидит (32 мкл, 0,1 ммоль) в бане со льдом. Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь промывают насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия и насыщенным водным раствором хлорида натрия и концентрируют в вакууме. Остаток очищают хроматографически на колонке с силикагелем (используя смесь дихлорметан : этилацетат= 2:1 в качестве элюента) для того, чтобы получить указанное в заголовке соединение (40 мг, 0,0445 ммоль, 89%) в виде белого твердого вещества.
Спектр ЯМР 1H (400 МГц, СDСl3): 1,1-1,2 (12Н, м), 1,36 (3Н, с), 1,37 (1Н, м), 2,10 (1Н, м), 2,36 (2Н, м), 3,3-3,6 (6Н, м), 3,81 (6Н, м), 3,98 (2Н, м), 4,42 (1Н, м), 4,49 (1Н, м), 6,11 (1Н, с), 6,88 (4Н, м), 7,2-7,5 (12Н, м), 8,14 (1Н, с), 8,28 (2Н, м).
FAB-MAS(mNBA): 890(М+Н)+.
Пример 23. 2'-О,4'-С-Этилен-5-метилцитидин (номер иллюстративного соединения 2-226)
Раствор соединения, полученного в примере 20 (11,6 мг, 0,030 ммоль), в метаноле насыщенном аммиаком (2 мл), выдерживают в течение ночи. Смесь концентрируют, чтобы получить белое твердое вещество (8,5 мг, 0,030 ммоль).
Спектр ЯМР 1H (400 МГц, ДМСО-d6): 1,20 (1Н, м), 1,82 (3Н, с), 1,97 (1Н, м), 3,49 (1Н, дд, 5 и 12 Гц), 3,58 (1Н, дд, 5 и 12 Гц), 3,85 (2Н, м), 5,23 (1Н, д, 5 Гц), 5,32 (1Н, т, 5 Гц), 5,84 (1Н, с), 6,7 (1Н, шир. с), 7,2 (1Н, шир. с), 8,08 (1Н,с).
FAB-MAS (mNBA): 284 (M+Н)+.
УФ(λmах): 279 (рН7), 289 (pH1), 279 (рН13).
Пример 24. 3',5'-Ди-О-бензил-2'-О,4'-С-этилен-2-N-изобутирилгуанозин (номер иллюстративного соединения 1-24)
Водный 1N раствор гидроксида натрия (2 мл) добавляют к раствору соединения, полученного в сравнительном примере 15 (приблизительно 200 мг), в пиридине (2 мл) и смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 15 мин. Реакционную смесь нейтрализуют 1N соляной кислотой и экстрагируют этилацетатом. Органический слой промывают насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия и насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушат над безводным сульфатом магния и затем концентрируют в вакууме. Остаток очищают хроматографически на колонке с силикагелем (используя смесь дихлорметан : метанол = 50:1 в качестве элюента), чтобы получить бесцветное аморфное твердое вещество (20 мг, 0,036 ммоль, 6%, 2 стадии).
Спектр ЯМР 1H (400 МГц, CDCl3): l,27 (3H, c), 1,29 (3Н, с), 1,43 (1Н, дд, 3 и 13 Гц), 2,28 (1Н, м), 2,59 (1Н, кви, 6,9 Гц), 3,54 (1Н, д, 11 Гц), 3,68 (1Н, д, 11 Гц), 4,03 (2Н, м), 4,15 (1Н, д, 3,0 Гц), 4,31 (1Н, д, 3,0 Гц), 4,45 (1Н, д, 12 Гц), 4,56 (1Н, д, 12 Гц), 4,61 (1Н, д, 12 Гц), 4,63 (1Н, д, 12 Гц), 6,18 (1Н, с), 7,2-7,4 (10Н, м), 8,19 (1Н, с), 11,93 (1Н, шир. с).
FAB-MAS (mNBA): 560 (М+Н)+.
Пример 25. 2'-О,4'-С-Этилен-2-N-изобутирилгуанозин (номер иллюстративного соединения 1-177)
Раствор соединения, полученного в примере 24 (10 мг, 0,018 ммоль), в метаноле (2 мл) перемешивают в среде водорода при атмосферном давлении в течение 5 час. Реакционную смесь фильтруют для того, чтобы удалить катализатор, и фильтрат концентрируют в вакууме. Остаток очищают хроматографически на колонке с силикагелем (используя смесь дихлорметан : метанол =10:2 в качестве элюента), чтобы получить бесцветное масло (5 мг, 0,013 ммоль, 72%).
Спектр ЯМР 1H (400 МГц, CD3OD): 1,21 (3Н, с), 1,22 (3Н, с), 1,41 (1Н, дд, 4 и 13 Гц), 2,18 (1Н, м), 2,69 (1Н, кви, 6,9 Гц), 3,69 (1Н, д, 12 Гц), 3,76 (1Н, д, 12 Гц), 4,0 (2Н, м), 4,26 (1Н, д, 3,2 Гц), 4,30 (1Н, д, 3,2 Гц), 6,30 (1Н, с), 8,40 (1Н, с).
FAB-MAS (mNBA): 380(M+H)+.
Пример 26. 5'-О-Диметокситритил-2'-О,4'-С-этилен-2-N-изобутирилгуанозин (номер иллюстративного соединения 1-35)
Раствор соединения, полученного в примере 25 (5 мг, 0,013 ммоль), в безводном пиридине подвергают азеотропной перегонке, чтобы удалить воду. Продукт растворяют в безводном пиридине (1 мл) в атмосфере азота, к раствору добавляют 4,4'-диметокситритилхлорид (14 мг, 0,04 ммоль) и смесь перемешивают при температуре 40°С в течение 3 час. К реакционной смеси добавляют небольшое количество метанола и затем растворитель выпаривают в вакууме. Остаток очищают хроматографически на колонке с силикагелем (используя смесь дихлорметан : метанол =100:6 в качестве элюента), чтобы получить указанное в заголовке соединение (4 мг, 0,0059 ммоль, 45%) в виде бесцветного твердого вещества.
Спектр ЯМР 1H (400 МГц, СDСl3): 1,26 (3Н, д, 1,4 Гц), 1,28 (3Н, д, 1,4 Гц), 1,66 (1Н, м), 2,15 (1Н, м), 2,59 (1Н, кви, 6,9 Гц), 3,65 (1Н, м), 3,78 (1Н, м), 4,06 (2Н, м), 4,35 (1Н, м), 4,38 (1Н, д, 3,2 Гц), 6,23 (1Н, с), 6,8 (4Н, м), 7,2-7,5 (9Н, м), 8,01 (1Н, с), 8,19 (1Н, шир. с).
FAB-MAS (mNBA): 682 (М+Н)+.
Пример 27. 5'-О-Диметокситритил-2'-О,4'-С-этилен-2-N-изобутирилгуанозин-3'-О-(2-цианэтил-N,N-диизопропил)фосфоамидит (номер иллюстративного соединения 1-185)
Раствор соединения, полученного в примере 26 (4 мг, 0,0058 ммоль), в безводном пиридине подвергают азеотропной перегонке, чтобы удалить воду. Продукт растворяют в безводном дихлорметана (0,5 мл) в атмосфере азота. Тетразоловую соль N,N-диизопропиламина (5 мг) добавляют к раствору и затем добавляют по каплям 2-циaнэтил-N,N,N',N'-тетраизопропилфосфоамидит (9 мкл, 0,03 ммоль) в бане со льдом. Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 1 час. Реакционную смесь промывают насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия и насыщенным водным раствором хлорида натрия и концентрируют в вакууме. Остаток очищают хроматографически на колонке с силикагелем (используя смесь дихлорметан : этилацетат = 2:1 в качестве элюента) для того, чтобы получить указанное в заголовке соединение (4 мг) в виде белого твердого вещества.
Спектр ЯМР 1H (400 МГц, CDCl3): 1,1-1,4 (19Н, м), 2,1 (1Н, м), 2,4 (2Н, м), 2,6 (1Н, м), 3,3-3,6 (6Н, м), 3,8 (6Н, с), 4,0-4,6 (4Н, м), 6,2 (1Н, с), 6,8 (4Н, м), 7,2-7,5 (9Н, м), 8,1 (1Н, с).
Пример 28. 2'-О,4'-С-Этиленгуанозин (номер иллюстративного соединения 1-5)
Раствор соединения, полученного в примере 25 (0,5 мг), в метаноле, насыщенном аммиаком (0,5 мл), выдерживают при 60°С в течение 5 час. Смесь концентрируют, получая белый порошок (0,4 мг).
FAB-MAS (mNBA): 310 (М+Н)+.
УФ(λmах): 255 (рН7), 256 (рН1), 258-266(рН13).
Пример 29. Синтез олигонуклеотидных производных
Синтез олигонуклеотидных производных проводят, используя механический синтетизатор нуклеиновых кислот (ABI модель 392 ДНК/РНК синтетизатор - продукт фирмы Perkin-Elmer Corporation), в количестве 1,0 мкмоль. Растворители, реагенты и концентрация фосфоамидита в каждом цикле синтеза являются такими же, как и при синтезе природных олигонуклеотидов. Растворители, реагенты и фосфоамидиты природных нуклеозидов являются продуктами фирмы РЕ Biosystems Corporation. Каждую последовательность, содержащую модифицированные олигонуклеотиды, синтезируют путем повторения конденсации соединения, полученного в примере 9, или амидитов, содержащих 4 нуклеотида, с 5'-гидрокситимидином, полученным путем удаления защитной диметокситрифенилметильной группы в 5'-О-4,4'-диметокситрифенилметилтимидине (1,0 мкмоль), используя трихлоруксусную кислоту, причем 3'-гидроксигруппу тимидина присоединяют к носителю CGP.
Цикл синтеза изложен ниже:
1) удаление тритильной группы - в смеси трихлоруксусная кислота/дихлорметан, 35 с;
2) сочетание фосфоамидита (приблизительно 20 экв) - в смеси тетразол/ацетонитрил, 25 с или 10 мин;
3) покрытие - в смеси 1-метилимидазол/тетрагидрофуран, уксусный ангидрид/пиридин/тетрагидрофуран, 15 с;
4) окисление - в смеси йод/вода/пиридин/тетрагидрофуран, 15 с.
В приведенном выше цикле 2), когда используют соединение, полученное в примере 9, время реакции составляет 10 мин, а когда используют фосфоамидиты, время реакции составляет 25 с.
После синтеза желаемой последовательности, содержащей олигонуклеотидные производные, удаляют 5'-диметокситрифенилметильную группу и затем носитель, содержащий желаемый продукт, традиционно обрабатывают концентрированным водным аммиачным раствором для того, чтобы отделить олигомер от носителя и удалить цианэтильную группу, которая является защитной группой для фосфористой группы. Защитные группы аминогрупп в аденине, гуанине и цитозине удаляют из олигомера. Олигонуклеотидные производные очищают методом ВЭЖХ с обращенной фазой (HPLC: LC-VP - продукт фирмы Shimazu Corp.; колонка: Wakopak WS-ДНК - продукт фирмы Wako Pure Chemical Industry Ltd.), чтобы получить желаемый олигонуклеотид.
В соответствии с этим способом синтеза получают следующую олигонуклеотидную последовательность (олигонуклеотид которой в последующем обозначен как "олигонуклеотид 1") в количестве 0,23 мкмоль, выход 23%: 5'-GCGTTTTTTGCT-3' (иллюстративная последовательность номер 2 в перечне последовательности), в которой функциональная группа сахара тимидинов в номерах оснований от 4 до 8 представляет собой 2'-0,4'-С-этилен.
Сравнительный пример 1. 3,5-Ди-O-бензил-4-трифторметансульфонилоксиметил-1,2-O-изопропилиден-альфа-D-эритропенто-фураноза
Безводный пиридин (0,60 мл, 7,5 ммоль) добавляют в раствор 3,5-ди-O-бензил-4-гидроксиметил-1,2-O-изопропилиден-альфа-D-эритропентофуранозы (2000 мг, 5,0 ммоль) в безводном дихлорметане (50 мл) и добавляют ангидрид трифторметансульфокислоты (1010 мг, 6,0 ммоль) в атмосфере азота при -78°С, смесь перемешивают в течение 40 мин. Реакционную смесь распределяют между метиленхлоридом и насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия (приблизительно 100 мл). Органический слой промывают насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия (приблизительно 100 мл) и насыщенным водным раствором хлорида натрия (приблизительно 100 мл), сушат над безводным сульфатом магния и затем концентрируют в вакууме, получая белый порошок (2520 мг, 4,73 ммоль, 95%), который используют в следующей реакции без дополнительной очистки.
Спектр ЯМР 1H (400 МГц, CDCl3): 1,34 (3Н, с), 1,63 (3Н, с), 3,48 (1Н, д, 10 Гц), 3,53 (1Н, д, 10 Гц), 4,21 (1Н, д, 5,0 Гц), 4,5 (4Н, м), 4,74 (1Н, д, 12 Гц), 4,80 (1Н, д, 12 Гц), 5,01 (1Н, д, 12 Гц), 5,73 (1Н, д, 4,6 Гц), 7,3 (10Н, м).
Сравнительный пример 2. 3,5-Ди-O-бензил-4-цианметил-1,2-О-изопропилиден-альфа-D-эритропентофураноза
Соединение, полученное в сравнительном примере 1 (2520 мг, 4,73 ммоль), растворяют в диметилсульфоксиде (50 мл) при 90°С. В этот раствор добавляют цианид натрия (463 мг, 9,46 ммоль) при комнатной температуре и смесь перемешивают при 50°С в течение 3 час. Реакционную смесь распределяют между водой (приблизительно 100 мл) и этилацетатом (приблизительно 100 мл). Органический слой промывают насыщенным водным раствором хлорида натрия (приблизительно 100 мл), сушат над безводным сульфатом магния и затем концентрируют в вакууме. Остаток очищают хроматографически на силикагеле (используя смесь гексан : этилацетат = 4:1), чтобы получить бесцветное масло (1590 мг, 3,89 ммоль, 82%).
Спектр ЯМР 1H (400 МГц, СDСl3): 1,34 (3Н, с), 1,62 (3Н, с), 2,88 (1Н, д, 17 Гц), 3,15 (1Н, д, 17 Гц), 3,50 (1Н, д, 10 Гц), 3,58 (1Н, д, 10 Гц), 4,08 (1Н, д, 5,1 Гц), 4,52 (1Н, д, 12 Гц), 4,56 (1Н, д, 12 Гц), 4,57 (1Н, м), 4,58 (1Н, д, 12 Гц), 4,76 (1Н, д, 12 Гц), 5,73 (1Н, д, 3,7 Гц), 7,3 (10Н, м).
Сравнительный пример 3. 3,5-Ди-O-бензил-4-формилметил-1,2-О-изопропилиден-альфа-D-эритропентофураноза
Толуольный раствор (1,5М) изобутилалюминийгидрида (2 мл, 3,0 ммоль) медленно добавляют по каплям в раствор соединения, полученного в сравнительном примере 2 (610 мг, 1,49 ммоль), в дихлорметане (10 мл) в атмосфере азота при -78°С, смесь перемешивают при -78°С в течение 1 ч и затем нагревают до комнатной температуры. К реакционной смеси добавляют метанол (5 мл) и насыщенный водный раствор хлористого аммония (приблизительно 20 мл) и эту смесь перемешивают в течение 30 мин. Реакционную смесь экстрагируют этилацетатом (приблизительно 30 мл). Органический слой промывают насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия (приблизительно 30 мл) и насыщенным водным раствором хлорида натрия (приблизительно 30 мл), сушат над безводным сульфатом магния и затем концентрируют в вакууме, получая продукт, который используют в следующей реакции без дополнительной очистки.
Сравнительный Пример 4. 3,5-Ди-O-бензил-4-гидроксиэтил-1,2-О-изопропилиден-альфа-D-эритропентофураноза
Борогидрид натрия NaBH4 (7,6 мг, 0,2 ммоль) добавляют к раствору соединения, полученного в сравнительном примере 3 (154 мг, 0,377 ммоль), в этаноле (5 мл) и смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 1 часа. Реакционную смесь распределяют между этилацетатом (приблизительно 10 мл) и водой (приблизительно 10 мл) и органический слой промывают насыщенным водным раствором хлорида натрия (приблизительно 10 мл), сушат над безводным сульфатом магния и затем концентрируют в вакууме. Остаток очищают хроматографически на силикагеле (используя смесь гексан : этилацетат = 2: 1), чтобы получить бесцветное масло (117 мг, 0,284 ммоль, 75%).
Спектр ЯМР 1H (400 МГц, CDCl3): 1,33 (3Н, с), 1,66 (3Н, с), 1,78 (1Н, ддд, 4,0, 8,5, 15 Гц), 2,51 (1Н, ддд, 3,4, 6,4, 15 Гц), 3,31 (1Н, д, 10 Гц), 3,54 (1Н, д, 10 Гц), 3,80 (2Н, м), 4,13 (1Н, д, 5,3 Гц), 4,43 (1Н, д, 12 Гц), 4,52 (1Н, д, 12 Гц), 4,55 (1Н, д, 12 Гц), 4,65 (1Н, дд, 4,0, 5,3 Гц), 4,77 (1Н, д, 12 Гц), 5,77 (1Н, д, 4,0 Гц), 7,3 (10Н, м).
FABMS (mNBA): 415 (М+Н)+. [α]D +57,4° (0,91, в метаноле).
Сравнительный Пример 5. 3,5-Ди-O-бензил-4-формил-1,2-O-изопропилиден-альфа-D-эритропентофураноза
Оксалилхлорид (6,02 мл, 69,0 ммоль) добавляют к метиленхлориду (200 мл), охлажденному до -78°С. В этот раствор добавляют по каплям раствор диметилсульфоксида (7,87 мл, 110 ммоль) в безводном метиленхлориде (100 мл). После перемешивания в течение 20 мин в эту смесь добавляют по каплям раствор 3,5-ди-О-бензил-1,2-О-изопропилиден-альфа-D-эритропентофуранозы (9210 мг, 23,02 ммоль) в безводном дихлорметане (100 мл) и смесь перемешивают в течение 30 мин. В эту реакционную смесь добавляют триэтиламин (28 мл, 200 ммоль) и смесь медленно нагревают до комнатной температуры. Реакционную смесь распределяют между дихлорметаном и водой (приблизительно 300 мл). Органический слой промывают водой (приблизительно 300 мл) и насыщенным водным раствором хлорида натрия (приблизительно 300 мл), сушат над безводным сульфатом магния и затем концентрируют в вакууме. Остаток очищают хроматографически на силикагеле (используя смесь гексан : этилацетат = 5:1) для того, чтобы получить бесцветное масло (8310 мг, 20,88 ммоль, 91%).
Спектр ЯМР 1H (400 МГц, СDСl3): 1,35 (3Н, с), 1,60 (3Н, с), 3,61 (1Н, д, 11 Гц), 3,68 (1Н, д, 11 Гц), 4,37 (1Н, д, 4,4 Гц), 4,46 (1Н, д, 12 Гц), 4,52 (1Н, д, 12 Гц), 4,59 (1Н, д, 12 Гц), 4,59 (1Н, дд, 3,4, 4,4 Гц), 4,71 (1Н, д, 12 Гц), 5,84 (1Н, д, 3,4 Гц), 7,3 (10Н, м), 9,91 (1Н, с).
FABMS (mNBA): 397 (М-Н)+, 421(M+Na)+.
[α]D +27,4° (0,51, в метаноле).
Сравнительный Пример 6. 3,5-Ди-O-бензил-4-винил-1,2-О-изопропилиден-альфа-D-эритропентофураноза
Толуольный 0,5М раствор реактива Теббе (44 мл, 22 ммоль) добавляют к раствору соединения, полученного в сравнительном примере 5 (8310 мг, 20,88 ммоль), в безводном тетрагидрофуране (300 мл) в атмосфере азота при 0°С и смесь перемешивают при 0°С в течение 1 часа. К реакционной смеси добавляют диэтиловый эфир (300 мл) и затем медленно добавляют 0,1N водный раствор гидроксида натрия (20 м). Смесь фильтруют через целит, чтобы удалить осадок, и этот осадок промывают диэтиловым эфиром (приблизительно 100 мл). Органический слой сушат над безводным сульфатом магния и затем концентрируют в вакууме. Остаток очищают хроматографически на основном оксиде алюминия, используя дихлорметан, чтобы получить сырой продукт, который дополнительно очищают хроматографически на силикагеле (используя смесь гексан : этилацетат =8:1-5:1) для того, чтобы получить бесцветное масло (5600 мг, 14,14 ммоль, 68%).
Спектр ЯМР 1H (400 МГц, CDCl3): 1,28 (3Н, с), 1,52 (3Н, с), 3,31 (1Н, д, 11 Гц), 3,34 (1Н, д, 11 Гц), 4,25 (1Н, д, 4,9 Гц), 4,40 (1Н, д, 12 Гц), 4,52 (1Н, д, 12 Гц), 4,57 (1Н, дд, 3,9, 4,9 Гц), 4,59 (1Н, д, 12 Гц), 4,76 (1Н, д, 12 Гц), 5,25 (1Н, дд, 1,8, 11 Гц), 5,52 (1Н, дд, 1,8, 18 Гц), 5,76 (1Н, д, 3,9 Гц), 6,20 (1Н, дд, 11, 18 Гц), 7,3 (10Н, м).
FABMS (mNBA): 419(M+Na)+.
Сравнительный Пример 7. 3,5-Ди-O-бензил-4-гидроксиэтил-1,2-O-изопропилиден-альфа-D-эритропентофураноза
Тетрагидрофурановый 0,5М раствор 9-BBN (9-борабицикло[3,3,1]нонан) (80 мл, 40 ммоль) добавляют по каплям к раствору соединения, полученного в сравнительном примере 6 (5500 мг, 13,89 ммоль), в безводном тетрагидрофуране (200 мл) в атмосфере азота и смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. К реакционной смеси добавляют воду, пока не прекратится выделение газа, добавляют 3N водный раствор гидроксида натрия (30 мл) и затем медленно добавляют 30% водный раствор пероксида водорода, поддерживая температуру между 30 и 50°С. Эту смесь перемешивают в течение 30 мин и распределяют между насыщенным водным раствором хлорида натрия (приблизительно 200 мл) и этилацетатом (200 мл). Органический слой промывают нейтральным буферным раствором фосфорной кислоты (приблизительно 200 мл) и насыщенным водным раствором хлорида натрия (приблизительно 200 мл) и сушат над безводным сульфатом магния и затем концентрируют в вакууме. Остаток очищают хроматографически на силикагеле (используя смесь гексан : этилацетат = 2:1-1:1) для того, чтобы получить бесцветное масло (5370 мг, 12,97 ммоль, 93%).
Спектр ЯМР 1H (400 МГц, CDCl3): 1,33 (3Н, с), 1,66 (3Н, с), 1,78 (1Н, ддд, 4,0, 8,5, 15 Гц), 2,51 (1Н, ддд, 3,4, 6,4, 15 Гц), 3,31 (1Н, д, 10 Гц), 3,54 (1Н, д, 10 Гц), 3,80 (2Н, м), 4,13 (1Н, д, 5,3 Гц), 4,43 (1Н, д, 12 Гц), 4,52 (1Н, д, 12 Гц), 4,55 (1Н, д, 12 Гц), 4,65 (1Н, дд, 4,0, 5,3 Гц), 4,77 (1Н, д, 12 Гц), 5,77 (1Н, д, 4,0 Гц), 7,3 (10Н, м).
FABMS (mNBA): 415(М+Н)+. [α]D +57,4° (0,91, в метаноле).
Сравнительный Пример 8. 3,5-Ди-O-бензил-4-(пара-толуолсульфонилоксиэтил)-1,2-O-изопропилиден-альфа-D-эритропентофураноза
Триэтиламин (1,8 мл, 13 ммоль), диметиламинопиридин (30 мг, 0,25 ммоль) и пара-толуолсульфонилхлорид (858 мг, 4,5 ммоль) добавляют к раствору соединения, полученного в сравнительном примере 4, который был подвергнут азеотропной перегонке с толуолом (1035 мг, 2,5 ммоль), в безводном дихлорметане (35 мл) в атмосфере азота при 0°С и смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь распределяют между дихлорметаном и насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия (приблизительно 100 мл). Органический слой промывают насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия (приблизительно 100 мл) и насыщенным водным раствором хлорида натрия (приблизительно 100 мл), сушат над безводным сульфатом магния и затем концентрируют в вакууме. Остаток очищают хроматографически на силикагеле (используя смесь гексан : этилацетат = 3:1) для того, чтобы получить бесцветное масло (1340 мг, 2,6 ммоль, 94%).
Спектр ЯМР 1H (400 МГц, СDСl3): 1,33 (3Н, с), 1,49 (3Н, с), 1,99 (1Н, дт, 7,6 и 15 Гц), 2,47 (3Н, с), 2,60 (1Н, ддд, 5,7, 7,6, 15 Гц), 3,28 (1Н, д, 10 Гц), 3,45 (1Н, д, 10 Гц), 4,11 (1Н, д, 5,3 Гц), 4,32 (2Н, м), 4,42 (1Н, д, 12 Гц), 4,50 (1Н, д, 12 Гц), 4,54 (1Н, д, 12 Гц), 4,62 (1Н, дд, 4,0, 5,2 Гц), 4,76 (1Н, д, 12 Гц), 5,74 (1Н, д, 4,0 Гц), 7,3 (12Н, м), 7,78 (2Н, д, 8,3 Гц).
FAB-MAS(mNBA): 569(М+Н)+.
Сравнительный Пример 9. 1,2-Ди-О-ацетил-З,5-ди-О-бензил-4-(пара-толуолсульфонилоксиэтил)-альфа-D-эритропентофураноза
Уксусный ангидрид (1,88 мл, 20 ммоль) и концентрированную серную кислоту (0,01 мл) добавляют к раствору соединения, полученного в сравнительном примере 8 (1340 мг, 2,36 ммоль), в уксусной кислоте (15 мл) и смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 1 часа. Реакционную смесь выливают в воду (60 мл), находящуюся в ледяной бане, и перемешивают в течение 30 мин, затем распределяют между насыщенным водным раствором хлорида натрия (приблизительно 100 мл) и этилацетатом (приблизительно 100 мл). Органический слой промывают нейтральным буферным раствором фосфорной кислоты, насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия и насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушат над безводным сульфатом магния и затем концентрируют. Остаток очищают хроматографически на силикагеле (используя смесь гексан : этилацетат = 2:1) для того, чтобы получить бесцветное масло (1290 мг, 2,11 ммоль, 89%, α:β=1:5).
Спектр ЯМР 1H (400 МГц, СDСl3): (β-производная) 1,86 (3Н, с), 2,05 (3Н, с), 2,08 (1Н, м), 2,18 (1Н, м), 2,42 (3Н, с), 3,30 (1Н, д, 10 Гц), 3,33 (1Н, д, 10 Гц), 4,23 (1Н, д, 5,1 Гц), 4,24 (2Н, м), 4,42 (2Н, с), 4,45 (1Н, д, 12 Гц), 4,55 (1Н, д, 12 Гц), 5,28 (1Н, д, 5,1 Гц), 6,01 (1Н, с), 7,3 (12Н, м), 7,73 (2Н, д, 8,3 Гц).
FAB-MAS(mNBA): 613(М+Н)+.
Сравнительный Пример 10. 2'-О-Ацетил-3',5'-ди-O-бензил-4'-пара-толуолсульфонилоксиэтил-5-метилуридин
Триметилсилилированный тимин (500 мг, приблизительно 2 ммоль), который получен в соответствии со способом H.Vorbrggen, К. Krolikiewicz и В. Bennua (Chem. Ber., т. 114, с. 1234-1255 (1981)), добавляют к раствору соединения, полученного в сравнительном примере 9 (650 мг, 1,06 ммоль), в безводном 1,2-дихлорэтане (15 мл) при комнатной температуре в атмосфере азота. Триметилсилилтрифторметансульфонат (0,36 мл, 2 ммоль) добавляют по каплям к смеси и эту смесь перемешивают при температуре 50°С в течение 1 часа. К реакционной смеси добавляют насыщенный водный раствор гидрокарбоната натрия (приблизительно 50 мл) и смесь фильтруют через целит. Добавляют к фильтрату дихлорметан (приблизительно 50 мл). Органический слой промывают насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия (приблизительно 50 мл) и насыщенным водным раствором хлорида натрия (приблизительно 50 мл), сушат над безводным сульфатом магния и затем концентрируют в вакууме. Остаток очищают хроматографически на силикагеле (используя гексан :этилацетат = 1,2: 1) для того, чтобы получить бесцветное аморфное твердое вещество (432 мг, 0,64 ммоль, 60%).
Спектр ЯМР 1H (400 МГц, CDCl3): 1,52 (3Н, д, 0,9 Гц), 1,94 (1Н, дт, 7,5 и 15 Гц), 2,06 (3Н, с), 2,23 (1Н, дт, 6,0 и 15 Гц), 2,42 (3Н, с), 3,38 (1Н, д, 10 Гц), 3,67 (1Н, д, 10 Гц), 4,17 (2Н, м), 4,36 (1Н, д, 6,0 Гц), 4,41 (1Н, д, 12 Гц), 4,44 (1Н, д, 12 Гц), 4,48 (1Н, д, 12 Гц), 4,58 (1Н, д, 12 Гц), 5,39 (1Н, дд, 5,1 и 6,0 Гц), 6,04 (1Н, д, 5,1 Гц), 7,3 (12Н, м), 7,73 (2Н, дт, 1,8 и 8,3 Гц), 8,18 (1Н, с).
FAB-MAS (mNBA): 679(M+H)+.
Сравнительный Пример 11. 2'-O-Ацетил-3',5'-ди-O-бензил-4'-пара-толуолсульфонилоксиэтил-4-N-бензоилцитидин
Триметилсилилированный бензоилцитозин (300 мг, приблизительно 1,0 ммоль), который был получен в соответствии со способом H.Vorbrggen, К. Krolikiewicz и В. Bennua (Chem. Ber., т. 114, с. 1234-1255 (1981)), добавляют к раствору соединения, полученного в сравнительном примере 9 (383 мг, 0,626 ммоль), в безводном 1,2-дихлорэтане (4 мл). К смеси добавляют триметилсилилтрифторметансульфонат (0,18 мл, 0,995 ммоль) при 0°С и смесь перемешивают при 50°С в течение 1 часа. К смеси добавляют насыщенный водный раствор гидрокарбоната натрия (приблизительно 10 мл) и метиленхлорид (приблизительно 20 мл) и затем смесь перемешивают. Образовавшийся белый осадок фильтруют через целит. Органический слой фильтрата промывают насыщенным водным раствором хлорида натрия (приблизительно 20 мл), сушат над безводным сульфатом магния и затем концентрируют в вакууме для того, чтобы получить бесцветное аморфное твердое вещество (397 мг, 83%).
Спектр ЯМР 1H (400 МГц, CDCl3): 8,70 (1Н, br), 8,18 (1Н, д, 7,4 Гц), 7,87 (2Н, д, 7,5 Гц), 7,72 (2Н, д, 8,3 Гц), 7,61-7,57 (1Н, м), 7,51-7,48 (2Н, м), 7,43-7,21 (13Н, м), 6,02 (1Н, д, 2,9 Гц), 5,40 (1Н, дд, 5,8, 2,9 Гц), 4,57 (1Н, д, 11 Гц), 4,39 (1Н, д, 11 Гц), 4,32-4,28 (3Н, м), 4,19-4,16 (2Н, м), 3,69 (1Н, д,11 Гц), 3,31 (1Н, д, 11 Гц), 2,40 (3Н, с), 2,30-2,23 (1Н, м), 2,06 (3Н, с), 1,95-1,89 (1Н, м).
FAB-MAS (mNBA): 768(M+H)+.
Сравнительный Пример 12. 2'-O-Ацетил-3',5'-ди-O-бензил-4'-пара-толуолсульфонилоксиэтил-6-N-бензоиладенозин
Триметилсилилированный бензоиладенозин (500 мг, приблизительно 2,0 ммоль), который был получен в соответствии со способом H. Vorbrggen, К. Krolikiewicz и В. Bennua (Chem. Ber., т. 114, с. 1234-1255 (1981)), добавляют к раствору соединения, полученного в сравнительном примере 9 (600 мг, 0,98 ммоль), в безводном 1,2-дихлорэтане (15 мл) при комнатной температуре в атмосфере азота. После добавления по каплям триметилсилилтрифторметансульфоната (0,36 мл, 2 ммоль) к смеси, эту смесь перемешивают при температуре 50°С в течение 4 час. К реакционной смеси добавляют насыщенный водный раствор гидрокарбоната натрия (приблизительно 50 мл) и дихлорметан (50 мл) и смесь распределяют между этими двумя слоями. Органический слой промывают насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия (приблизительно 50 мл) и насыщенным водным раствором хлорида натрия (приблизительно 50 мл), сушат над безводным сульфатом магния и затем концентрируют в вакууме. Остаток очищают хроматографически на силикагеле (используя смесь дихлорметан : метанол = 50:1) для того, чтобы получить бесцветное аморфное твердое вещество (405 мг, 0,51 ммоль, 52%).
Спектр ЯМР 1H (400 МГц, CDCl3): 2,0 (1Н, м), 2,06 (3Н, с), 2,32 (1Н, дт, 6,0 и 15 Гц), 2,40 (3Н, с), 3,36 (1Н, д, 10 Гц), 3,58 (1Н, д, 10 Гц), 4,22 (2Н, м), 4,39 (1Н, д, 12 Гц), 4,45 (1Н, д, 12 Гц), 4,47 (1Н, д, 12 Гц), 4,59 (1Н, д, 12 Гц), 4,62 (1Н, д, 5,6 Гц), 5,94 (1Н, дд, 4,5 и 5,6 Гц), 6,21 (1Н, д, 4,5 Гц), 7,2-7,3 (12Н, м), 7,54 (2Н, м), 7,62 (1Н, дт, 1,2 и 6,2 Гц), 7,72 (2Н, д, 8,3 Гц), 8,02 (2Н, м), 8,21 (1Н, с), 8,75 (1Н, с), 8,97 (1Н, шир. с).
FAB-MAS (mNBA): 792 (М+Н) +.
Сравнительный Пример 13. 2'-O-Ацетил-3',5'-ди-O-бензил-4'-пара-толуолсульфонилоксиэтилуридин
Триметилсилилированный урацил (200 мг, приблизительно 0,8 ммоль), который был получен в соответствии со способом H. Vorbrggen, К. Krolikiewicz и В. Bennua (Chem. Ber., т. 114, с. 1234-1255 (1981)), добавляют к раствору соединения, полученного в сравнительном примере 9 (200 мг, 0,327 ммоль), в безводном 1,2-дихлорэтане (8 мл) при комнатной температуре в атмосфере азота. После добавления к смеси по каплям триметилсилилтрифторметансульфоната (0,145 мл, 0,8 ммоль), смесь перемешивают при температуре 70°С в течение 1 часа. К реакционной смеси добавляют насыщенный водный раствор гидрокарбоната натрия (приблизительно 10 мл), смесь фильтруют через целит и к фильтрату добавляют дихлорметан (приблизительно 10 мл). Органический слой промывают насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия и насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушат над безводным сульфатом магния и затем концентрируют в вакууме. Остаток очищают хроматографически на силикагеле (используя смесь дихлорметан : метанол = 100:2) для того, чтобы получить бесцветное масло (199 мг, 0,299 ммоль, 92%).
Спектр ЯМР 1H (400 МГц, CDCl3): 1,94 (1Н,дт, 7,4 и 15 Гц), 2,07 (3Н, с), 2,23 (1Н, дт, 5,9 и 15 Гц), 2,43 (3Н, с), 3,36 (1Н, д, 10 Гц), 3,65 (1Н, д, 10 Гц), 4,17 (2Н, дд, 6 и 7 Гц), 4,31 (1Н, д, 5,9 Гц), 4,38 (1Н, д, 11 Гц), 4,39 (1Н, д, 11 Гц), 4,40 (1Н, д, 11 Гц), 4,58 (1Н, д, 11 Гц), 5,29 (1Н, дд, 2,4 и 8,2 Гц), 5,33 (1Н, дд, 4,5 и 6 Гц), 6,00 (1Н, д, 4,5 Гц), 7,2-7,4 (12Н, м), 7,61 (1Н, д, 8,2 Гц), 7,74 (1Н, д, 8,3 Гц), 8,14 (1Н, шир. с).
FAB-MAS(mNBA): 665(М+Н)+.
Сравнительный Пример 14. 2'-O-Ацетил-3',5'-ди-O-бензил-4'-пара-толуолсульфонилоксиэтил-4-N-бензоил-5-метилцитидин
Триметилсилилированный бензоил - 5-метилцитозин (400 мг, приблизительно 1,2 ммоль), который был получен в соответствии со способом H. Vorbrggen, К. Krolikiewicz и В. Bennua (Chem. Ber., т. 114, с. 1234-1255 (1981)), добавляют к раствору соединения, полученного в сравнительном примере 9 (400 мг, 0,653 ммоль), в безводном 1,2-дихлорэтане (6 мл). После добавления к смеси триметилсилилтрифторметансульфоната (0,180 мкл, 1,0 ммоль) при 0°С смесь перемешивают при температуре 50°С в течение 1 часа. Реакционную смесь нагревают до комнатной температуры. К реакционной смеси добавляют насыщенный водный раствор гидрокарбоната натрия (приблизительно 5 мл) и метиленхлорид (приблизительно 10 мл) и смесь перемешивают. Смесь фильтруют через целит для того, чтобы удалить белый осадок. Органический слой фильтрата промывают насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушат над безводным сульфатом магния и затем концентрируют в вакууме, получая бесцветное аморфное твердое вещество (320 мг, 0,409 ммоль, 63%).
Спектр ЯМР 1H (400 МГц, CDCl3): 1,68 (3Н, с), 1,95 (1Н, дт, 7,3 и 15 Гц), 2,07 (3Н, с), 2,25 (1Н, дт, 6 и 15 Гц), 2,43 (3Н, с), 3,40 (1Н, д, 10 Гц), 3,71 (1Н, д, 10 Гц), 4,18 (2Н, м), 4,37 (1Н, д, 5,8 Гц), 4,42 (1Н, д, 12 Гц), 4,46 (1Н, д, 12 Гц), 4,51 (1Н, д, 12 Гц), 4,61 (1Н, д, 12 Гц), 5,42 (1Н, дд, 4,9 и 5,8 Гц), 6,07 (1Н, д, 4,9 Гц), 7,2-7,6 (17Н, м), 7,74 (2Н, д, 8,3 Гц), 8,28 (2Н, д, 7,0 Гц).
FAB-MAS (mNBA): 782 (М+Н)+.
Сравнительный Пример 15. 2'-O-Ацетил-3',5'-ди-O-бензил-4'-пара-толуолсульфонилоксиэтил-2-N-изобутирилгуанозин
Триметилсилилированный изобутирилгуанозин (650 мг, около 1,5 ммоль), который был получен в соответствии со способом H. Vorbrggen, К. Krolikiewicz и В. Bennua (Chem. Ber., т. 114, с. 1234-1255 (1981)), добавляют к раствору соединения, полученного в сравнительном примере 9 (400 мг, 0,65 ммоль), в безводном 1,2-дихлорэтане (10 мл) при комнатной температуре в атмосфере азота. После добавления к смеси триметилсилилтрифторметансульфоната (0,2 мл, 1,2 ммоль), эту смесь перемешивают при 50°С в течение 4 час. К реакционной смеси добавляют насыщенный водный раствор гидрокарбоната натрия (приблизительно 5 мл), органический слой промывают насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия и насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушат над безводным сульфатом магния и затем концентрируют в вакууме, получая продукт, который используют в следующей реакции без дополнительной очистки.
Тест-пример 1. Определение температуры плавления Тm
Раствор образца (1000 мкл) в 10 мМ фосфате натрия (рН 7,2) с конечной концентрацией NaCl 100 мМ, содержащий 4 мкМ олигонуклеотида (1) и 4 мкМ комплементарной ДНК (далее олигонуклеотид (2)) с последовательностью комплементарной цепи (последовательность: 5'-AGCAAAAAACGC-3' (последовательность №1 в перечне последовательностей), или комплементарной РНК (далее олигонуклеотид (3) ) с последовательностью 5'-AGCAAAAAACGC-3' (последовательность №1 в перечне последовательностей) нагревают в кипящей водяной бане и медленно охлаждают до комнатной температуры приблизительно в течение двух часов. Затем раствор нагревают и определяют поглощение при 260 нм, используя спектрофотометр (UV-3100PC - продукт фирмы Shimadzu Corp.). Образец нагревают в кювете (толщина кюветы 1,0 см, с рубашкой цилиндрического типа) циркулирующей водой, нагретой в термостате (Haake FE2 - продукт фирмы ЕКО Corp.), и определяют рост температуры, используя цифровой термометр (фирмы SАТО SK1250MC). Температуру повышают от 20 до 95°С и для каждого увеличения температуры на 1°С измеряют поглощение при 260 нм, что соответствует максимуму поглощения. В качестве контроля используют ДНК природного происхождения (далее олигонуклеотид (4)), с последовательностью 5'-GCGTTTTTTGCT-3' (последовательность №2 в перечне последовательностей), представляющей собой ту же последовательность, что и олигонуклеотид (1) (соединение примера 29).
Температура, при которой интенсивность изменения на 1°С достигает максимума, принимается температурой плавления Тm, и способность олигонуклеотидного аналога к образованию комплекса с комплементарной цепью оценивают при этой температуре.
Ниже показаны результаты измерения температуры плавления Тm олигонуклеотида (4) (ДНК природного происхождения) и олигонуклеотида (1) (соединение примера 29) относительно олигонуклеотида (2) (комплементарная ДНК) и олигонуклеотида (3) (комплементарная РНК).
Как видно из приведенной выше таблицы, для олигонуклеотидного аналога настоящего изобретения наблюдаются значительно более высокие значения температур плавления Тm, а также значительно более высокая способность к образованию комплекса с комплементарной цепью по сравнению с ДНК природного происхождения.
Тест-пример 2. Определение устойчивости к нуклеазам
Олигонуклеотид смешивают в буферном растворе с экзонуклеазой или эндонуклеазой и инкубируют при 37°С в течение определенного периода времени. Для остановки реакции добавляют этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА) и нагревают при 100°С в течение 2 мин. Количество олигонуклеотида, оставшегося в смеси, определяют с помощью HPLC на колонке с обращенной фазой и определяют изменения количества олигонуклеотида во времени, в присутствии нуклеазы.
Олигонуклеотидные аналоги настоящего изобретения демонстрируют значительную устойчивость к нуклеазам.
Тест-пример 3.
Определение устойчивости к нуклеазам.
(а) Синтез эталонного соединения - 2'-О,4-С-метилен нуклеозида формулы (1)
Олигонуклеотид А, содержащий 2'-О,4-С-метиленнуклеозид формулы (1), синтезировали по способу, раскрытому в WО98/39352 и его устойчивость к нуклеазам сравнивали с устойчивостью олигонуклеотида, содержащего нуклеозиды настоящего изобретения.
Олигонуклеотид A: 5'-tlt ttt ttt txt-31
b) Синтез соединения настоящего изобретения
Олигонуклеотид В, содержащий нуклеозиды изобретения, синтезировали по способу, раскрытому в описании настоящей заявки.
Олигонуклеотид В: 5'-ttt ttt ttt tyt-3'
(с) Методика анализа на устойчивость к нуклеазе и полученные результаты. Устойчивость олигонуклеотида А и олигонуклеотида В к действию фосфодиэстеразы змеиного яда определяли по методике, описанной в Сравнительном примере 2. Олигонулеотиды в количестве 26 мкг/мл добавляли в раствор, содержащий 50 мМ Трис-HCL (рН 8,0) и 10 мМ MgCl2. Устойчивость к нуклеазам определяли в виде процентного отношения количества оставшихся олигонуклеотидов к их исходным количествам. Полученные результаты представлены в Таблице 4.
Как следует из результатов, приведенных в таблице 4, через 120 мин инкубации олигонуклеотид А в растворе не детектируется, а олигонуклеотид В присутствует в количестве 82% от исходного.
Из этого можно сделать вывод, что олигонуклеотид В настоящего изобретения обладает значительно более высокой устойчивостью к нуклеазам, чем известный олигонуклеотид А. Столь высокая устойчивость к нуклеазам олигонуклеотида по изобретению не является очевидной для специалиста в данной области техники. Поскольку роль кольцевой структуры нуклеозидов изобретения не является чисто структурным фактором, по-видимому, в этом и состоит отличительный признак изобретения в сравнении с известным уровнем техники.
Тест-пример 4. Определение способности олигонуклеотидов формулы (I) к образованию дуплекса с комплементарной цепочкой и устойчивости к нуклеазам
Олигонуклеотид по настоящему изобретению имеет формулу (I)
где А представляет собой (СН2)2-группу.
(а) Синтез известных соединений
В ссылках, цитированных в Международном отчете о поиске, например в Tetrahedron, 1998, 54, 3607, и т.д., раскрывается 2'-О,4'-С-метиленнуклеозид формулы (II)
Олигонуклеотид А, содержащий 2'-О,4'-С-метиленнуклеозид формулы (II) синтезировали по способу, раскрытому в WО98/39352 и его устойчивость к нуклеазам сравнивали с соответствующей активностью олигонуклеотидов, содержащих нуклеозиды изобретения.
Олигонуклеотид A: 5'-ttt ttt ttt txt-3'
(b) Синтез соединений настоящего изобретения
Олигонуклеотид В и олигонуклеотад С, содержащие нулеозиды по изобретению, синтезировали в соответствие со следующей схемой, а также методами, указанными в описании настоящей заявки.
Олигонуклеотид В: 5'-ttt ttt ttt tyt-3'
Олигонуклеотид С: 5'-gcg ttt tty gct-3'
Схема. Синтез 2'-О,4'-С-пропилентимидин-3'-О-фосфорамидита и олигонуклеотидов. Реагенты и условия: i) (COCl)2, DMSO, Et3N, СН2Сl2, 78°С, 99%; ii) (EtO)2P(O)CH2COOEt, NaH, THF, 86%; iii) Pd(OH)2; H2(3,5 фунт/дюйм2), МеОН, 71%; iv) L-селектрид, THF, 85%; v) TsCl, Et3N, CH2Cl2, 77%; vi) Ac2O, H2SO4, AcOH, 79% (главным образом β-аномер); vii) силилированный тимин, TMSOTf, ClC2H4Cl, дефлегмация, 88%; viii) 1M NaOH, пиридин-Н2O; ix) TBAF; THF, 82% (2 стадии); x) Н2, Pd(OH)2, MeOH, 59%; xi) DMTrCl, пиридин, CH2Cl2, количественный, xii) ((iPr)2N)2P(OC2H4CN), тетразолид N,N-диизопропиламмония, количественный; xiii) синтезатор ДНК/РНК.
5-O-(трет-Бутилдифенилсилил)-4-С-формил-3-O-бензил-1,2-O-изопропилиден-a-D-эритропентофураноза (2). Хлористый оксалил (8,3 мл, 95 ммоля) добавляли к безводному CH2Cl2 (200 мл) при -78°С. К полученному раствору прикапывали раствор ДМСО (11,4 мл, 160 ммолей) в безводном CH2Cl2 (100 мл). После перемешивания в течение 20 минут к полученной смеси прикапывали раствор соединения 1 (Obica,S; Morio, K; Hari, Y.; Imanishi, T. Chem. Commun., 1999, 2423)(26,3 г, 47,9 ммоль) в безводном СН2Сl2 (100 мл) и полученную смесь перемешивали в течение 30 минут. В реакционную смесь добавляли триэтиламин (42 мл, 300 ммоль) и полученную смесь медленно нагревали до комнатной температуры. Реакционную смесь охлаждали Н2O. Органический слой промывали водой и рассолом, сушили над MgSO4 и затем выпаривали в вакууме. Остаток подвергали хроматографической очистке на силикагеле (гексан : ЕOАс=7:1) с образованием соединения 2 в виде бесцветного масла (26,1 г, 47,8 ммоль, 99%).
Спектр 13С-ЯМР (125 МГц, CDCl3): δ 19,21, 26,13, 26,66, 26,76, 63,05, 72,73, 78,57, 79,08, 90,62, 104,91, 114,15, 127,76, 127,79, 127,83, 128,07, 128,51, 129,81, 129,86, 132,51, 132,82, 135,49, 135,57, 136,99, 100,17.
1Н ЯМР (400 МГц, CDCl3): δ 0,98 (9Н, с), 1,37 (3Н, с), 1,62 (3Н, с), 3,79 (1Н, д, 11 Гц), 3,88 (1Н, д, 11 Гц), 4,54 (1Н, д, 4,4 Гц), 4,62 (1Н, д, 12 Гц), 4,65(1Н, дд, 3,7 и 4,4 Гц), 4,74 (1Н, д, 12 Гц), 5,87 (1 Н, д, 3,7 Гц), 7,3-7,6 (15Н), 9,89(1Н, с).
ИК(пленка)νmax: 2993, 2858, 1732, 1113, 1022, 702 см-1.
ESI-HRMS (положительный): вычислено для C32H38O6SiNa [M+Na]+ 569,2335, найдено 569,2354.
5-O-(трет-Бутилдифенилсилил)-4-С-(2-этоксикарбонил-(Е)-винил)-3-O-бензил-1,2-O-изопропилиден-а-D-эритропентофураноза (3). Гидрид натрия (60% в минеральном масле, 2,3 г, около 57,4 ммоля) добавляли к этиловому эфиру диэтилфосфоноуксусной кислоты (11,5 мл, 57,4 ммоля) в безводном ТГФ (200 мл) при 0°С. Через 10 минут перемешивания к раствору прикапывали раствор соединения 2 (26,1 г, 47,8 ммоля) в безводном ТГФ (200 мл) и полученную смесь перемешивали в течение 30 минут при комнатной температуре. Реакционную смесь охлаждали водой и экстрагировали ЕtОАс. Органический слой промывали рассолом, сушили над MgSO4 и затем выпаривали в вакууме. Остаток подвергали хроматографической очистке на силикагеле (гексан : ЕtOАс=7:1) с образованием 3 в виде бесцветного масла (25,4 г. 41,2 ммоля, 86%).
Спектр 13С-ЯМР (125 МГц, СDСl3): δ 14,23, 19,25, 25,66, 26,07, 26,77, 60,21, 65,60, 72,53, 77,21, 78,08, 86,68, 103,99, 113,48, 122,66, 127,68, 127,73, 127,80, 127,96, 128,49, 129,73, 129,71, 133,12, 135,49, 135,56, 145,51, 166,21.
Спектр 1Н-ЯМР (400 МГц, CDCl3): δ 1,04 (9Н, с), 1,30 (3Н, т, 7,3 Гц), 1,45 (3Н, с) 3,54 (1Н, д,10 Гц), 3,58 (1Н, д,10 Гц), 4,2 (2Н, м), 4,39 (1 Н, д, 6,3 Гц), 4,59 (1Н, д, 10 Гц), 4,58 (1Н, дд, 4,4 и 6,3 Гц), 4,77(1Н, д, 10 Гц), 5,90 (1Н, д, 4,4 Гц), 6,24 (1Н, д, 16 Гц), 7,3-7,7(15Н, м).
ИK(KBr) νmax: 2929, 2857, 1717, 1302, 1139, 1106, 1034, 704 см-1.
FAB-MS (mNBA): 639(M+Na)+.
ESI-HRMS (положительный): вычислено для C36H44O7SiNa [M+Na]+639,2754, найдено 639,2755.
5-О-(трет-Бутилдифенилсилил)-4-С-(2-этоксикарбонилэтил)-3-O-бензил-1,2-O-изопропилиден-а-D-эритропентофураноза (4). К раствору соединения 3 (26,0 г, 42,14 ммоля) в ЕtOАc (100 мл) добавляли 20% гидроксида палладия на угле (8,0 г). Смесь перемешивали в атмосфере водорода при давлении 3,5 фунт/дюйм2 в течение 10 часов. Реакционную смесь фильтровали и фильтрат выпаривали в вакууме. Остаток очищали методом хроматографии на силикагеле (гексан : ЕtOАс=7:1) с образованием соединения 4 в виде бесцветного масла (18,5 г, 29,9 ммоля, 71%) и дебензилированного соединения (6,0 г, 11,34 ммоля, 27%).
13С-ЯMP (125 МГц, СDСl3): δ 14,16, 19,20, 26,19, 26,59, 26,80, 27,00, 29,02, 60,12, 66,29, 72,35, 77,97, 79,16, 86,88, 104,17, 113,27, 127,73, 127,76, 128,40, 129,68, 129,76, 132,89, 133,17, 135,53, 135,61, 137,92, 173,88.
Спектр 1Н-ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ: 0,98 (9Н, с), 1,18 (3Н, т, 7,0 Гц), 1,35 (3Н, с), 1,64 (3Н, с), 1,82 (1Н, м), 2,16 (1Н, м), 2,52 (2Н, м), 3,40 (1Н, д, 11 Гц), 3,61 (1Н, д, 11 Гц), 4,04 (1Н, д, 12 Гц), 5,78 (1Н, д, 4,4 Гц), 7,3-7,7 (15 Н, м).
ИК(КВr) νmax: 2933, 2858, 1733, 1111, 1025, 703 см-1.
FAB-MS (mNBA): 617[M-H], 641[M+Na]+.
ESI-HRMS (положительный): вычислено для C36H46O7SiNa [M+Na]+ 641,2911, найдено 641,2910.
5-O-(трет-Бутилдифенилсилил)-4-С-гидроксипропил-3-О-бензил-1,2-O-изопропилиден-а-D-эритропентофураноза (5). К раствору соединения 4 (1,95 г, 3,15 ммоля) в безводном ТГФ (40 мл) добавляли 1,0 М три-втор-бутилборогидрида лития в ТГФ (L-селектрид, 10 мл, 10 ммоль) и реакционную смесь перемешивали в течение 30 минут при комнатной температуре. Реакцию прекращали добавлением 20% уксусной кислоты и смесь фильтровали через целит. Фильтрат экстрагировали EtOAc и органический слой промывали насыщенным раствором NaHCO3 и рассолом, сушили над MgSO4 и выпаривали в вакууме. Остаток подвергали хроматографической очистке на силикагеле (гексан : ЕtOАc=4:1) с получением соединения 5 в виде бесцветного масла (1,55 г, 2,69 ммоля, 85%).
ИК(пленка) νmax: 3487, 2934, 2858, 1112, 1025, 703-1.
Спектр 13C ЯМР (125 МГц, CDCl3) δ: 19,21, 26,06, 26,58, 26,77, 26,80, 27,51, 62,57, 65,97, 72,42, 77,83, 79,15, 87,95, 104,13, 113,14, 127,68, 127,73, 127,82, 128,42, 129,70, 129,75, 132,92, 133,29, 135,53, 135,65, 137,95.
Спектр 1H-ЯМР (400 MГц, CDCl3) δ: 0,98 (9Н, с), 1,35 (3Н, с), 1,63 (3Н, с), 1,54-1,70 (2Н, м), 1,97 (1Н, т, 6,1 Гц), 2,17 (1Н, м), 3,44 (1Н, д, 11 Гц), 3,56 (2Н, м), 3,74 (1Н, 11 Гц), 4,35 (1Н, д, 1 Гц), 4,59 (1Н, д, 12 Гц), 4,68 (1 Н, дд, 4,4 и 5,1 Гц), 4,80 (1Н, д, 12 Гц), 5,79 (1Н, д, 4,4 Гц), 7,3-7,7(15Н, м).
FAB-HRMS (mNBA): вычислено для С34Н44O6SiNа [M+Na]+ 599,2805, найдено 599,2819.
5-О-(трет-Бутилдифенилсилил)-4-С-(п-толуолсульфонилокси-пропил)-3-О-бензил-1,2-О-изопропилиден-а-В-эритропентофураноза (6). Пиридин (0,24 мл, 3,0 ммоля) и хлористый п-толуолсульфонил (286 мг, 1,5 ммоля) добавляли в раствор соединения 5 (610 мг, 1,06 ммоля) в безводном СН2Сl2 (10 мл) в атмосфере азота при 0°С и полученную смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Реакционную смесь распределяли между СН2Сl2 и насыщенным NaHCO3. Органический слой промывали рассолом, сушили над MgSO4 и затем выпаривали в вакууме. Остаток подвергали хроматографической очистке на силикагеле (гексан : ЕtOАс=7:1) с образованием 6 в виде бесцветного масла (600 мг, 0,82 ммоля, 77%).
ИК(пленка) νmax: 2933, 2858, 1360, 1176, 1112, 704см-1. Спектр 13С-ЯМР (400 MГц, CDCl3) δ 19,17, 21,56, 23,20, 26,17, 26,73, 26,77, 27,80, 66,33, 71,09, 72,37, 78,04, 79,25, 87,20, 104,16, 113,13, 127,70, 127,76, 127,81, 127,87, 128,42, 129,70, 129,79, 132,85, 133,11, 133,13, 135,51, 135,58, 137,89, 144,44.
Спектр 1H-ЯМР (400 MГц, CDCl3) δ: 0,96 (9Н, с), 1,32 (3Н, с), 1,50 (3, с), 1,42-1,56 (2Н, м), 1,82 (Н, м), 2,05 (1Н, м), 2,39 (3Н, с), 3,34 (1Н, д, 11 Гц), 3,56 (1Н, д, 11 Гц), 3,90-4,00 (2Н, м), 4,25 (1Н, д, 5,1 Гц), 4,54 (1Н, д, 12 Гц), 4,63(1 Н, дд, 3,7 и 5,1 Гц), 4,77 (1Н, д, 12 Гц), 5,74 (1Н, д, 3,7 Гц), 7,3-7,8 (19Н, м).
ESI-HRMS: вычислено для C41H50O8SiNa [M+Na]+ 753,2893, найдено 753,2878.
5-O-(трет-Бутилдифенилсилил)-4-С-(п-толуолсульфонилоксипропил)-3-O-бензил-1,2-ди-O-ацетил-а-D-эритропентофураноза (7)
Уксусный ангидрид (1,0 мл, 10 ммолъ) и концентрированную H2SO4 (0,01 мл) добавляли в раствор соединения 6 (600 мг, 0,82 ммоль) в уксусной кислоте (5 мл) и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут. Реакционную смесь переливали в Н2О (10 мл) на бане со льдом и перемешивали в течение 30 минут, после чего экстрагировали EtOAc. Органический слой промывали нейтральным фосфатным буфером, насыщенным раствором NaHCO3 и рассолом, сушили над MgSO4 и затем выпаривали в вакууме. Остаток подвергали хроматографической очистке на силикагеле (гексан : ЕtOАс=5:1) с образованием преимущественно β-аномера соединения 7 в виде бесцветного масла (500 мг, 0,65 ммоля, 79%).
ИК(пленка) νmax: 1748, 1362, 1220, 1176, 1112, 704 см-1.
Спектр 13C-ЯМР (125 MГц, CDCl3) δ: 19,32, 20,75, 20,96, 21,58, 22,85, 26,90, 28,23, 67,30, 71,15, 73,50, 74,75, 79,07, 87,79, 97,70, 127,51, 127,77, 127,84, 128,43, 129,74, 129,82, 129,94, 132,71, 133,05, 133,24, 135,49, 135,59, 137,59, 144,50, 169,20, 169,71.
Спектр 1H-ЯМР (400 MГц, CDCl3) δ: 1,03 (9Н, с), 1,60-1,90 (4Н, м), 1,80 (3Н, с), 2,06 (3Н, с), 2,40 (3Н, с), 3,53 (2Н, с), 3,98 (2Н, м), 4,34 (1Н, д, 5,2 Гц), 4,50 (1Н, д, 11 Гц), 4,57 (1Н, д, 11 Гц), 5,33 (1Н, д, 5,2 Гц), 6,08 (1Н, с), 7,307,8 (19Н, м).
ESI-HRMS: вычислено для C42H50O10SiNa [M+Na]+ 797,2792, найдено 797,2798.
5-O-(трет-Бутилдифенилсилил)-4'-С-(п-толуолсульфонилоксипропил)-3'-O-бензил-2'-O-ацетил-5-метилуридин (8). Триметилсилилированный тимин (500 мг, около 2 ммоля), полученный по способу Vorbruggen (Vorbruggen,H.; Bennua, В. Chem. Ber., 1981, 114, 1279), добавляли в раствор соединения 7 (490 мг, 0,64 ммоля) в безводном 1,2-дихлорэтане (15 мл) при комнатной температуре в атмосфере азота. TMSOTf (0,2 мл, 1,1 ммоля) прикапывали в полученную смесь и смесь перемешивали при 50°С в течение 3 часов. Реакцию останавливали добавлением насыщенного раствора NaHCO3 и фильтровали через целит. Органический слой промывали насыщенным раствором NaHCO3 и рассолом, сушили над MgSO4 и затем выпаривали в вакууме. Остаток подвергали хроматографической очистке на силикагеле (CH2Cl2:MeOH=100:3) с получением 8 в виде бесцветного аморфного твердого вещества (475 мг, 0,56 ммоля, 88%).
ИК(КВr) νmах: 2931, 1748, 1693, 1361, 1228, 1176, 1111, 703 см-1.
1H-ЯМР (400 MГц, CDCl3) δ: 1,10 (9Н, с), 1,40-1,52 (2Н, м), 1,55 (3Н, с), 1,72-1,82 (2Н, м), 2,08 (3Н, с), 2,40 (3Н, с), 3,49 (1Н, д, 12 Гц), 3,75 (1Н, д, 12 Гц), 3,92 (2Н, м), 4,37 (1Н, д, 6,6 Гц), 4,02 (1Н, д, 12 Гц), 4,57 (1Н, д, 12 Гц), 5,36 (1Н, т, 6,6 Гц), 6,12 (1Н, д, 6,6 Гц), 7,3-7,7 (19Н, м), 7,71 (1Н, д, 2,2 Гц), 8,08 (1Н, с).
ESI-HRMS: вычислено для C45H52N2O10SiNa [M+Na]+ 863,3009, найдено 863, 2991.
3'-O-Бензил-2'-O,4'-С-пропилен-5-метилуридин (9). 3 мл 1,0N раствора NaOH добавляли в раствор 8 (475 мг, 0,56 ммоля) в пиридине (5 мл) при 0°С и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 20 минут. Реакционную смесь нейтрализовали путем прикапывания водного 20% раствора уксусной кислоты и экстрагировали CH2Cl2. Органический слой промывали нейтральным фосфатным буфером и рассолом, после чего выпаривали в вакууме. Полученное сырое соединение разбавляли ТГФ (5 мл) и к раствору добавляли 1,0 М раствор фтористого тетрабутиламмония в ТГФ. Полученную реакционную смесь перемешивали в течение 6 часов при комнатной температуре и затем распределяли между Н2О и СН2Сl2. Органический слой промывали рассолом, сушили над MgSO4 и выпаривали в вакууме. Остаток подвергали хроматографической очистке на сликагеле (CH2Cl2:MeOH=40:1) с получением 9 в виде бесцветного аморфного твердого вещества (180 мг, 0,46 ммоля, 82%).
Спектр 1H-ЯМР (400 MГц, CDCl3) δ: 1,50-1,90 (4Н, м), 1,87 (3Н, с), 3,70 (1Н, д, 12 Гц), 3,80 (1Н, д, 12 Гц), 4,05 (1Н, м), 4,30 (1Н, дт, 1,5 и 11 Гц), 4,37 (1Н, д, 5,9 Гц), 4,42 (1Н, д, 5,9 Гц), 4,56 (1Н, д, 11 Гц), 4,82 (1Н, д, 11 Гц), 6,02 (1Н, с), 7,3-7,4 (5Н, м), 7,72 (1Н, д, 1,5 Гц), 8,25 (1Н, широкий).
ИК(КВr) νmax: 3393, 2956, 1468, 1118 см-1.
ESI-HRMS9 (положительный): вычислено для C20H25N2O6[M+H]+ 389,1713, найдено 389,1714.
FAB-MS(mNBA): 389[М+H]+.
2'-O,4'-С-Пропилен-5-метилуридин (10). К раствору соединения 9 (175 мг, 0,45 ммоля) в МеОН (5 мл) добавляли 20% гидроксида палладия на угле (105 мг). Смесь перемешивали в атмосфере водорода при атмосферном давлении в течение ночи. Реакционную смесь фильтровали и фильтрат выпаривали в вакууме. Остаток подвергали хроматографической очистке на силикагеле (CH2Cl2:MeOH=10:1) с получением 10 в виде бесцветного аморфного твердого вещества (81 мг, 0,27 ммоля, 59%).
1H-ЯМР (400 MГц, CD3OD) δ: 1,58 (1Н, м), 1,71 (1Н, м), 1,84 (2Н, м), 1,85 (3Н, с), 3,36 (1Н, с), 3,66 (1Н, д, 12 Гц), 3,74 (1Н, д, 12 Гц), 3,94 (1Н, дт, 3,7 и 11 Гц), 4,11 (1Н, д, 5,9 Гц), 4,28 (1Н, м), 4,50 (1Н, 5,9 Гц), 5,95 (1Н, с), 8,28 (1Н, с).
FAB-MS (mNBA): 299[M+H]+.
ESI-HRMS (положительный): вычислено для С13Н19N2О6[М+Н]+ 299,1243, найдено 299,1237.
5'-O-(4,4'-Диметокситритил)-2'-O,4'-С-пропилен-5-метилуридин (11). Получение 11 осуществляли по методике, описанной в Примере 8 с образованием 11 в виде бесцветного аморфного твердого материала (количественный выход).
Спектр 13C-ЯМР (125 MГц, CDCl3) δ: 11,83, 25,03, 31,46, 55,26, 66,10, 68,18, 70,64, 80,89, 86,94, 89,38, 91,37, 110,14, 113,36, 123,81, 127,18, 128,09, 128,13, 130,10, 135,17. 135,19, 135,37, 136,13, 144,22, 149,99, 158,74, 163,80.
Спектр 1H-ЯМР (400 MГц, CDCl3) δ: 1,32 (3Н, с). 1,67 (1Н, м), 1,76 (1Н, м), 1,83 (2Н, м), 2,73 (1Н, широкий), 3,37 (2Н, с), 3,79 (6Н, с), 4,06 (1Н, м), 4,20 (1Н, м), 4,30 (1Н, д, 6,6 Гц), 4,72 (1Н, д, 6,6 Гц), 5,99 (1Н, с), 6,84 (4Н, м), 7,3-7,7 (9Н, м), 8,44 (1Н, с), 8,61 (1Н, м).
ИК(КВr) νmax: 3403, 2951, 1688, 1509, 1252 см-1.
FAB-MS (mNBA): 601 [М+Н]+, ЕSI-НRМS (положительный): вычислено для C34H36N2O8Na [M+H]+ 623,2369, найдено 623, 2365.
51-O-(4,4'-Диметокситритил)-2'-О,4'-С-пропилен-5-метилуридин-3'-O(2-цианоэтил-N,N-диизопропил)фосфорлмидит (12). Получение соединения 12 осуществляли по методике, описанной в примере 9, с получением 12 в виде бесцветного аморфного твердого материала (количественный выход).
Спектр 1H-ЯМР (400 MГц, CDCl3) δ: 1,20 (3Н, с), 1,22 (3Н, с), 1,29 (3Н, с), 1,31 (3Н, с), 1,78 (3Н, с), 1,5-2,4 (6Н, м), 2,6-2,8 (2Н, м), 3,6-3,8 (4Н, м), 3,80 (6Н, с), 4,03 (1Н, м), 4,13 (1Н, м), 4,36 (1 Н, д, 6,6 Гц), 4,98 (1Н, д, 6,6 Гц), 6,04 (1Н, с), 6,8-6,9 (4Н, м), 7,3-7,5 (9Н), 7,91 (1Н, д, 1,5 Гц), 8,25 (1H, широкая).
FAB-MS (mNBA):801[М+Н]+.
(с) Определение способности олигонуклеотидов к образованию дуплекса с комплементарной цепочкой.
Тпл (температуру плавления) измеряли по методике Сравнительного примера 1, представленного в описании. Из данных представленных в Таблице 5 следует, что значения Тпл, дуплексов олигонуклеотида С по отношению к олигонуклеотиду Е (комплементарная РНК) или олигонуклеотиду F (комплементарная ДНК) (-0,5 или -2,0°С в расчете на модификацию) имеют почти столь же высокие значения, что и дуплекс нуклеотида D (природная ДНК).
(d) Определение устойчивости к действию нуклеаз
Устойчивость олигонуклеотида А и олигонуклеотида В к действию фосфодиэстеразы змеиного яда определяли по методике Сравнительного примера 2, приведенного в описании. Олигонуклеотиды в количестве 26 мкг/мл добавляли в раствор, содержащий 50 мМ Трис-HCl (рН 8,0) и 10 мМ MgCL2, после чего в раствор добавляли 7,14 мкг/мл фосфодиэстеразы змеиного яда. Устойчивость к действию нуклеазы определяли в процентном соотношении количества оставшихся олигонуклеотидов и их исходного количества. Полученные результаты представлены в Таблице 6.
Обсуждение
Как следует из данных, представленных в Таблице 5, способность олигонуклеотида С настоящего изобретения к образованию дуплекса с комплементарной цепочкой оказалась столь же высокой, что и способность природной ДНК. Как следует из данных Таблицы 6, в отличие от олигонуклеотида А, который не детектируется уже через 10 минут инкубации, в растворе все еще присутствует 94% олигонуклеотида В. Как можно видеть, олигонуклеотид В настоящего изобретения обладает значительно более высокой устойчивостью к нуклеазам, чем известный олигонуклеотид А. Исключительно высокая устойчивость к нуклеазам соединения по настоящему изобретению не является очевидной для специалиста в данной области.
Промышленная применимость
Олигонуклеотидные аналоги и нуклеозидные аналоги по настоящему изобретению можно использовать в качестве антисенс- или антигенных фармацевтических препаратов, обладающих хорошей стабильностью, в качестве детектирующих зондов специфических генов, в качестве праймеров для амплификации или в качестве промежуточных соединений для их получения.
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| ПРОИЗВОДНОЕ ФОСФОРАМИДИТА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОЛИГО-РНК | 2005 |
|
RU2415862C2 |
| ПРОИЗВОДНЫЕ АМИНОСПИРТОВ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ, ПРОМЕЖУТОЧНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОМЕЖУТОЧНЫХ СОЕДИНЕНИЙ | 2001 |
|
RU2233839C1 |
| СОЕДИНЕНИЕ С-ФЕНИЛГЛИЦИТОЛА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ДИАБЕТА | 2007 |
|
RU2437876C2 |
| НОВЫЕ АНАЛОГИ 2`, 5`-ОЛИГОАДЕНИЛАТА ИЛИ ИХ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИ ПРИЕМЛЕМЫЕ СОЛИ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ НА ИХ ОСНОВЕ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ | 2003 |
|
RU2311422C2 |
| АМИДНОЕ ПРОИЗВОДНОЕ ПИРАЗОЛА | 2015 |
|
RU2658827C2 |
| БЕНЗИМИДАЗОЛЬНОЕ ПРОИЗВОДНОЕ, ИНГИБИТОР ЧЕЛОВЕЧЕСКОЙ ХИМАЗЫ, ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ АГЕНТ И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ НА ЕГО ОСНОВЕ | 2001 |
|
RU2263674C2 |
| Нуклеозидные производные 1,3-диаза-2-оксофеноксазина в качестве ингибиторов репликации герпесвирусов. | 2019 |
|
RU2731381C1 |
| ПРОИЗВОДНЫЕ ЗАМЕЩЕННОГО ПИРРОЛОПИРИДИНОНА, ПРИГОДНЫЕ В КАЧЕСТВЕ ИНГИБИТОРОВ ФОСФОДИЭСТЕРАЗЫ | 2001 |
|
RU2267490C2 |
| ПРОИЗВОДНЫЕ ЭТИЛЕНДИАМИНА И СОДЕРЖАЩИЕ ИХ ИНГИБИТОР FXa И АНТИКОАГУЛЯНТ | 2001 |
|
RU2268259C2 |
| ЦИКЛОАЛКИЛЗАМЕЩЕННЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ АМИНОМЕТИЛПИРРОЛИДИНА И АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫЙ АГЕНТ НА ИХ ОСНОВЕ | 1999 |
|
RU2248970C2 |
Изобретение относится к нуклеозидным аналогам формулы (1), в которой R1 представляет собой Н или группу, защищающую гидроксил, R2 представляет собой Н, группу, защищающую гидроксил, группу фосфорной кислоты, защищенную группу фосфорной кислоты или группу формулы P(R3)R4, в которой R3 и R4 являются одинаковыми или разными и представляют собой гидроксильную группу, защищенную гидроксильную группу, алкоксигруппу, алкилтиогруппу, цианоалкоксигруппу, аминогруппу, замещенную алкильной группой; А представляет собой алкиленовую группу, содержащую от 1 до 4 атомов углерода, и В представляет собой замещенную пурин-9-ильную группу или замещенную 2-оксопиримидин-1-ильную группу, содержащие по крайней мере один заместитель, выбранный из гидроксильной группы, защищенной гидроксильной группы, аминогруппы, защищенной аминогруппы, алкильной группы. Также изобретение относится к олигонуклеотидным аналогам, включающим одну или более структур формулы (2), где А и В имеют такие же значения, как в формуле (1). Олигонуклеотидные аналоги по изобретению или их фармакологически приемлемые соли могут использоваться в качестве лекарственных препаратов, обладающих антисенс-активностью или антигенной активностью. 3 н. и 9 з.п. ф-лы, 6 табл.
в которой R1 представляет собой атом водорода или группу, защищающую гидроксил;
R2 представляет собой атом водорода, группу, защищающую гидроксил, группу фосфорной кислоты, защищенную группу фосфорной кислоты или группу формулы P(R3)R4, в которой R3 и R4 являются одинаковыми или разными и представляют собой гидроксильную группу, защищенную гидроксильную группу, алкоксигруппу, содержащую 1 - 4 атомов углерода, алкилтиогруппу, содержащую 1 - 4 атомов углерода, цианоалкоксигруппу, содержащую 1 - 5 атомов углерода, аминогруппу, замещенную алкильной группой, содержащей 1 - 4 атомов углерода;
А представляет собой алкиленовую группу, содержащую 1 - 4 атомов углерода; В представляет собой замещенную пурин-9-ильную группу или замещенную 2-оксо-пиримидин-1-ильную группу, содержащие по крайней мере один заместитель, выбранный из гидроксильной группы, защищенной гидроксильной группы, аминогруппы, защищенной аминогруппы, алкильной группы содержащей 1 - 4 атомов углерода; или его соль.
2'-O,4'-С-этиленгуанозин,
2'-O,4'-С-этиленаденозин,
3',5'-ди-O-бензил-2'-O,4'-С-этилен-6-N-бензоиладенозин,
3',5'-ди-О-бензил-2'-О,4'-С-этилен-2-N-изобутирилгуанозин,
5'-O-диметокситритил-2'-O,4'-С-этилен-6-N-бензоиладенозин,
5'-O-диметокситритил-2'-O,4'-С-этилен-2-Н-изобутирилгуанозин,
2'-O,4'-С-этилен-2-N-изобутирилгуанозин,
2'-O,4'-С-этилен-6-N-бензоиладенозин,
5'-O-диметокситритил-2'-O,4'-С-этилен-6-N-бензоиладенозин-3'-O-(2-цианэтил-N,N-диизопропил)фосфоамидит,
5'-O-диметокситритил-2'-O,4'-С-этилен-2-N-изобутирилгуанозин-3'-O-(2-цианэтил-N,N-диизопропил)фосфоамидит,
2'-O,4'-С-этиленуридин,
2'-O,4'-С-этилен-5-метилуридин,
2'-O,4'-С-этиленцитидин,
2'-O,4'-С-этилен-5-метилцитидин,
3',5'-ди-O-бензил-2'-O,4'-С-этиленуридин,
5'-O-диметокситритил-2'-O,4'-С-этиленуридин,
3',5'-ди-O-бензил-2'-O,4'-С-этилен-5-метилуридин,
5'-O-димeтoкcитpитил-2'-O,4'-C-этилeн-5-мeтилypидин,
3',5'-ди-O-бензил-2'-O,4'-С-этилен-4-N-бензоилцитидин,
5'-O-диметокситритил-2'-O,4'-С-этилен-4-N-бензоилцитидин,
3',5'-ди-O-бензил-2'-O,4'-С-этилен-4-N-бензоил-5-метилцитидин,
5'-O-диметокситритил-2'-O,4'-С-этилен-4-N-бензоил-5-метилцитидин,
2'-O,4'-С-этилен-4-N-бензоилцитидин,
2'-O,4'-С-этилен-4-N-бензоил-5-метилцитидин,
5'-O-диметокситритил-2'-O,4'-С-этиленуридин-3'-O-(2-цианэтил-N,N-диизопропил)фосфоамидит,
5'-O-димeтoкcитpитил-2'-O,4'-C-этилeн-5-мeтилypидин-3'-O-(2-циaнэтид-N,N-диизопропил)фосфоамидит,
5'-O-димeтoкcитpитил-2'-O,4'-C-этилeн-4-N-бeнзoилцитидин-3'-O-(2-циaнэтил-N,N-диизопропил)фосфоамидит и
5'-О-диметокситритил-2'-O,4'-С-этилен-4-Н-бензоил-5-метилцитидин-3'-O-(2-цианэтил N,N-диизопропил)фосфоамидит.
в которой А представляет собой алкиленовую группу, имеющую 1 - 4 атомов углерода;
В представляет собой замещенную пурин-9-ильную группу или замещенную 2-оксо-пиримидин-1-ильную группу, содержащие по крайней мере один заместитель, выбранный из гидроксильной группы, защищенной гидроксильной группы, аминогруппы, защищенной аминогруппы, алкильной группы, содержащей 1 - 4 атомов углерода; или его фармакологически приемлемая соль.
| Прибор, замыкающий сигнальную цепь при повышении температуры | 1918 |
|
SU99A1 |
| Tetrahedron Letters, 1998, v | |||
| Машина для изготовления проволочных гвоздей | 1922 |
|
SU39A1 |
| Станок для обточки и расточки цилиндров | 1926 |
|
SU5401A1 |
| Chemical Communications, 1998, N 4, pp | |||
| Снеговая лыжа для самолетов | 1913 |
|
SU455A1 |
| Tetrahedron, 1998, v | |||
| Видоизменение прибора для получения стереоскопических впечатлений от двух изображений различного масштаба | 1919 |
|
SU54A1 |
| ПЕРЕНОСНОЙ ПРИБОР ДЛЯ ФРЕЗЕРОВАНИЯ, ШЛИФОВКИ И Т.П. РАБОТ | 1924 |
|
SU3607A1 |
