Способ иммобилизации фрагментов нуклеиновых кислот на полимерной подложке Советский патент 1993 года по МПК C12N11/08 

Изобретение относится к биотехнологии, молекулярной биологии и медицине. Оно может быть использовано в сэндвич- гибридизационном анализе при выявлении определенных нуклеотидных последовательностей, для выделения индивидуальных нуклеиновых кислот и выявления точечных мутаций.

Сэндвич-гибридизация - наиболее перспективный метод для анализа РНК и ДНК в неочищенных препаратах, в особенности разнородного клинического материала, содержащего белки, полисахариды и другие примеси, способные ингибировать сорбцию нуклеиновых кислот. Метод основан на использовании двух отдельных фрагментов нуклеиновых кислот, один из которых связан с твердой фазой, а другой, находящийся в растворе, несет репортерную группу. В качестве. твердой фазы часто используют полимерные подложки, на которые иммобилизуют длинный фрагмент нуклеиновой кислоты. Однако полинуклеотиды обладают двумя существенными недостатками по сравнению с короткими олигонуклеотида- ми; медленная кинетика реассоциации нуклеиновых кислот, что увеличивает время проведения гибридизационного анализа; отсутствие способности выявлять последовательности, отличающиеся точечными нук- леотидными заменами.

Использование в гибридизационном анализе иммобилизованных на полимерные подложки коротких олигонуклеотидов иск00

о

00

о

со

лючается, так как отсутствуют методы присоединения их к подложке.

Для ковалентного присоединения пол- инуклеотидов известны следующие способы: фотоиммобилизация и взаимодействие с активированными электрофильными группировками, а именно с диазосоединениями.

Метод фотойммобилизации основан на взаимодействии с иммобилизуемыми молекулами высокореакционно-способных частиц - нитренов, которые образуются в ходе облучения арилазидов полимерной подложки ультрафиолетовым светом. Однако под действием ультрафиолетового света, а также в результате реакции с нитренами, происходит модификация гетероциклических оснований. Известно, что изменения в структуре даже одного основания приводят к утрате олигонуклеотидами способности образовывать прочные комплементарные комплексы. Таким образом, фотоиммобилизация не может быть использована для присоединения к полимерным подложкам коротких олигонуклеотидов....

Наиболее близким к заявляемому является способ иммобилизации, основанный на взаимодействии нуклеиновых кислот с активированной электрофильной группировкой полимерной подложки, а именно с диазобензилоксиметилцеллюлозой. Взаимодействие арилдиазониевой соли подложки с нуклеиновыми кислотами ведут в боратном буфере рН 8,0. При этом происходит взаимодействие экзоциклических аминогрупп нуклеиновой кислоты с. диазогруппой подложки и образуются соответствующие диазоаминосоединения. Вовлечение в реакцию важных для образования водородных связей аминогрупп гетероциклических оснований, несомненно, отразится на способности коротких фрагментов нуклеиновых кислот к образованию прочных комплементарных комплексов. Таким образом, этот метод не может быть использован для присоединения к полимерным положкам коротких олигонуклеотидов.

Целью изобретения является обеспечение возможности иммобилизации на полимерные подложки коротких (до 20 нуклеотидных звеньев) олигонуклеотидов при сохранении ими способности образовывать прочные комплементарные комплексы.

Указанная цель достигается предлагаемым способом иммобилизации фрагментов НК, включающим активацию группировок полимерной подложки и их взаимодействие с фрагментами НК, при этом по б -концево- му фосфату фрагментов предварительно вводят аминоспейсер, в качестве подложки

используют материал, содержащий карбоксильные группы, которые активируют превращением в хлорангидрид карбоновой кислоты с помощью пентанхлорида фосфора, а процесс их взаимодействия с фрагмех- тами НК ведут в присутствии третичного амина,

Способ включает присоединение к оли- гонуклеотиду полиметиленполиамина путем взаимодействия одной из алифатических аминогрупп с 5-фосфо-4- М,М-диметиламино- пиридиниевым производным олигонуклеоти- да; активацию с помощью пентахлорида фосфора карбоксильной групяы полимер5 ной подложки с образованием соответствующего хлорангидрида карбоновой кислоты; взаимодействие аминогруппы полимети- ленполиаминового. спейсера олигонуклео- тида с активированной электрофильной

0 группой полимерной подложки в присутствии третичного амина, необходимого для депротонирования аминогруппы спейсера. Пример 1. Иммобилизация на лавсан pdACCTCTCCACCTTCATT. 2 молей

5 (2,9 оптических единиц при длине волны 260 нм (ОЕаео) 17-звенного олигонуклеотида переводят в цетавлоновую соль триметилцети- ламмоний бромидом. Соль нуклеотида растворяют в 50 мл диметилформамида,

0 добавляют 25 мкл диметилформамида с 3 10 молями (3,66 мг) 4-М,М-диметилами- нопирилина, 12,5 мкл диметилформамида с 15-10 молей (3,93 мг) трифенилфосфина и 12,5 мкл диметилформамида с 1,5

5 молей (3,3.мг) 2,2 -дипиридилдисульфида. Реакционную, смесь выдерживают 10 мин при комнатной температуре. Полученное активное производное олигонуклеотида осаждают 1 мл 2%-ного раствора перхлора0 та лития в ацетона. Осадок отделяют центрифугированием, промывают ацетоном, эфиром, сушат. К сухому остатку добавляют 30 мкл водного раствора, содержащего 3 -10 молей (5 мкл) .1,10-диамино-4,7-диа5 задекана. Выдерживают 60 мин при комнатной температуре, рсаждают 1 мл 2%-ного раствора перхлората лития в ацетоне, осадок отделяют центрифугированием, промывают ацетоном, эфиром, сушат.

Полоску лавсана (15x6 мм) инкубируют при комнатной температуре в насыщенном пентахлоридом фосфора растворе толуола (3 мл) в течение 5 ч, отмывают толуолом до нейтральной среды (по 2 мл). Промывают

5 N.N-диметилформамидом (2x1 мл) и переносят в раствор М,М-диметилформамида (400 мкл) с цетавлоновой солью полученного, как описано выше, фосфамида олигонуклеотида (2 молей; 0,29 ОЕ). Добавляют 5 мкл

0

третичного амина. Реакцию ведут при комнатной температуре в течение 12 ч. Полоску промывают 1 мл 1,М-диметилформамида и опускают в 2%-ный раствор перхлората лития в ацетоне. Через 15 мин полоску промывают водой (5x2 мл) в течение 60 мин, раствором 0,5 м NaC l; 0,1 М Трис-HCI рН 7,5; 0,05% Твин-20 (2x5 мл), затем водой (2x5). Хранят при -4°С, Количество присоединенного к лавсану олигонуклеотида оценивают,, используя Р-меченный образец. Радиоактивность на лавсане детектируют просчетом в жидкостном сцинтилляционном счетчике. Табл.1 иллюстрирует воспроизводимость способа иммобилизации олигонуклеотида на полимерную подложку.

Для определения равномерности иммобилизации олигонуклеотида на поверхность лавсана модифицированный лавсан разрезают на одинаковые полоски. Радиоактивность на полосках детектируется просчетом в жидкостном сцинтилляционном счетчике. Табл.2 иллюстрирует равномерность иммобилизации олигонуклеотида на поверхности полимерной подложки.

Аффинность полученных материалов определяют по способности связывать комплементарный (34-звенный) и некомплементарный (17-звенный) олигонуклеотиды, меченные 32Р.

В паствор 1 М Na Ci, 0,05 М Трис-HCI рН 7,5 с Р-меченными 34-звенным олигонуклеотидом(1,2 10 олигонуклеотидом

,-12

молей) или с 17-звенным

аналогом иммобилизованному на лавсан,(1,4 молей)вносят полоски модифицированного лавсана, Инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч. Отмывают по 25 мин раствором 0,5 М NaCI, 0,1 М Трис-HCI рН 7,5, 0,05% Твин-20 (3x1 мл). Связавшуюся радиоактивность просчитывают в жидкостном сцинтил- ляционном счетчике Rackbeta (LKB, Швеция). Комплементарный олигонуклеотид GGCACCCAGAACTAATGAATGAAGGTGGA GAGGT связывается с модифицированным лавсаном, а некомплементарный АССТСТС- САССТТСАТТ не связывается. Сорбционная емкость.аффинной полимерной подложки представлена в табл.3.

Способность образовывать иммобилизованными олигонуклеотидами прочные- комплементарные комплексы оценивают через сравнение температуры, при которой происходит денатурация комплекса, образованного олигонуклеотидом, иммобилизованным на поверхность полимерной подложки (pdACCTCTCCACCTTCATT) и комплементарным олигонуклеотидом (GGCACCCAGAACTAATGAATGAAGGAGAG

GT) с температурой плавления дуплекса, образованного данными олигонуклеотидами, в растворе,

1 Кривые плавления комплементарных 5 комплексов олигонуклеотидов записывают с .помощью установки для исследования термической денатурации в ультрамикро- масштабе на базе спектрофотометра Обь- 4 (НИБХ СО АН СССР) при концентрации

компонентов 1,4 М в 0,6 М NaCI, 0,01 М Трис-HCI рН 7,99, 0,01 М MgCl2.

Термическую денатурацию на лавсановой полоске исследуют, используя 32Р-меченный 34-звенный олигонукле5 отид. Аффинную лавсановую полоску (0,5x0,5 см).инкубируют в 0,1 мл раствора 1 М NaCI 0,05 М Трис-HCI рН 7,5, содержащем 2 молей 32P-GGCACCCAGAA CTAATGAATGAAGGAGAGGT в течение 1 ч

0 при комнатной температуре (25°С). Полоску отмывают по 25 мин раствором 0.5 М NaCI, 0,1 М Трис-HCI рН 7,5, 0,05% Твин-20, переносят в раствор с 0,6 М NaCI, 0,01 М Трис- HCI рН 7,99, 0,01 М MqCl2. Раствор

5 равномерно нагревают в термостате от 25 до 75°С. Через каждые 5°С отбирают супер- натант и просчитывают в жидкостном сцин тилляционном счетчике Rackbeta (LKB, Швеция). Температура плавления дуплекса,

0 образованного в растворе, 51,2°С. Температура денатурации дуплекса, образованного с олигонуклеотидом, иммобилизованном на лавсане .

Примеры 2, 3. Иммобилизация на

5 лавсан pdACCTCTCCACCTTCATT.

Условия иммобилизации аналогичны ус- л овиям, приведенным в примере 1, и отличаются тем, что использован лавсан

Оf)

размером 0,9 см (пример 2) и 0,3 см (при0 мер 3). Результаты по иммобилизации и характеристики аффинных .подложек представлены в табл. 1,2 и 3.

Примеры 4 и 5. Иммобилизация на КМ-целлюлозу олигонуклеотида

5 pdACCTCTCCACCTTTCATT.

Условия иммобилизации аналогичны условиям, приведенным в примере 1, и отличаются тем, что использована вместо лавсана КМ-целлюлоза размером 0,9 см2 в примере 4

0 и 0,3 см в примере 5. Результаты по иммобилизации и характеристики аффинной подложки представлены в таблицах 1, 2 и 3.

П р и м е р 6. Иммобилизация на лавсан pdAATCCACAATGGTTCCCCA.

5Условия иммобилизации аналогичны условиям, приведенным в примере 1, и отличаются тем, что фосфамид олигонуклеотида дополнительно очищают обращенно-фазо- вой ВЭЖХ. Используют колонку (14,6x250

им) со смолой Llchrosorb RP-18 (10 мкм) и градиент концентрации ацетонитрила от О- до 40%.в 0,05 М LICI04. Результаты по иммобилизации представлены в табл.1 и 2.

П р им е р 7. Иммобилизация на лавсан pdTTGTAACCTT.

Условия иммобилизации аналогичны условиям, приведенным в примере 1, и отличаются тем, что фосфамид олигонуклеотида дополнительно очищают обращенно-фазо- вой ВЭЖХ. Используют колонку (4,6x250 нм) со смолой Lichrosorb RP-18(10 мкм) и градиент концентрации ацетонитрила от 0 до 20% в 0,05 М LICI.04. Аффинную емкость и способность к комплексообразованию оце- нива ют, используя комплементарный (28-звенный) олигонуклеотид - 32Р- pdCCTGGGCAGGTTGGTATCAAGGTTACAA. Результаты по иммобилизации и характеристики аффинной подложки представлены в табл.1, 2 и 3..

Таким образом, предлагаемый способ позволяет присоединять к полимерным подложкам фрагменты нуклеиновых кислот с сохранением ими способности образовы- вать прочные комплементарные комплексы, Полученным подложкам свойственна высокая аффинная емкость (до молей/см2).

Этих двух факторов достаточно, чтобы обеспечить возможность использования аффинных полимерных подложек в сэнд- вич-гибридизационном анализе, также при выделении индивидуальных нуклеиновых кислот.

Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я .

Способ иммобилизации фрагментов нуклеиновых кислот на полимерной подложке, включающий активацию групп полимерной подложки и их взаимодействие с фрагментами нуклеиновых кислот, отличаю щи и с я тем, что, с целью обеспечения возможности иммобилизации на полимерной подложке коротких, до 20 нуклеотидных звеньев, фрагментов и сохранения ими способности образовывать прочные компле- м.ентарные комплексы, в качестве подложки используют полимерную подложку, содержащую карбоксильные группы, активацию проводят с помощью пентахлорида фосфора до превращения карбоксильных групп вхло- рангидрид карбоновой кислоты, перед иммобилизацией во фрагменты нуклеиновой кислоты вводят аминоспейсер, а процесс иммобилизации ведут в присутствии третичного амина.

Использование: биотехнология, молекулярная биология, медицина. Сущность изобретения: способ обеспечивает возможность иммобилизации на полимерную подложку коротких (до 20 нуклеотидных звеньев) фрагментов нуклеиновых кислот при сохранении ими способности образовывать прочные комплементарные комплексы, В качестве полимерной подложки используют полимер, содержащий карбоксильные группы, которые активируют, превращением в хло- рангидрид карбоновой кислоты. Во фрагмент нуклеиновой кислоты вводят аминоспейсер и процесс иммобилизации ведут в присутствии третичного амина. СО

Таблица

Таблица2

Продолжение табл. 2

ТаблицаЗ