Способ получения бактериального препарата мацерирующего действия для мочки льна Советский патент 1983 года по МПК C12N1/02 C12R1/145 

Изобретение относится к технической микробиологии, в частности к способам производства бактериальных препаратов, и может быть исполь зовано для ускорения мочки льна, повыиения выхода длинного и улучшения его качества. Известен способ получения бактериального препарата путем культивирования Cgostria um fe sineurn СЛ Недостаком этого спосо.ба являетс низкий выход препарата. Наиболее близким к изобретению по техничес сой сущности и достигаемому эффекту является способ ния бактериального препарата мацерирукяцего действия для мочки льна предусматривающий выращивание бакте рий DBost r-,cii ит fePsinSLim в анаэроб ных условиях на жидкой питательной ереде, содержащей источник углерода сернокислый аммоний в качестве источника азота, источник кальция, хлорное железо и кукурузный экстрак в качестве стимулятора роста, с пос ледукии-гм выде/1ением бактериальньях спор из культуральной жидкости ci/iiiкой и смешиванием полученного концентрата спор с мелом. В качестве источника углерода используют сухую картофельную мезгу, выделение концентрата спор осуществляют сепарированием с последую щей калориферной сушкой Сз . Недостатки известного способа основной компонент питательной сред ухая картофельная мезга с содержаниег крахмала 50-60%) не выпускаетс заводским способом. Возить для пройзводства влажную мезгу (70-80%-ьюй влажности) экономически невыгодно. Кроме того, картофель часто подвергается замораживанию при транспортировке и заболеваниям при хране Е1ии. Мезга из такого кар-л-ефеля вооб ще станонится непригодной для выращивания микроорганизмоп. Мезга не стандартна по составу, что также влияет на выход препарата. Кроме того, применение сепарирования культуральной жидкости при отделении спор С8. е Psi neum приводит к гибели 55-68% спор, так как CS. f е е sH пеигп - строгий анаэроб, и воздействие кислорода воздуха на споры приводит к гибели большого их количества. При этом следующая за, сепарирова нием калориферная сушка также вызывает гибель 20-35% спор. Общие поте спор при этом способе производства препарата составляют 80-90% при среднем титре спор в ферментаторе 50-60 млн. э 1 мл культуральной жид кости, т.е. вьосод спор в препарате очень низок. Иель изобретения - увеличение выхода- делового продукта и . его Кс чества. Постар ленная цель достигается тем, что согласно с:;осоОу по.тгучения бачтег иальиого пр;; -;. а манерирующего .цействия для мочпги льна, преду см а лртш а га:ему аыргшивание бактерий C csi -diurw fePsifie:-/r-p 3 анаэробных услоаиях Eia жид;слй питательной соех;е, содержащей ксточмик углерода, сернокислый аммогшйв качества источ: иика cisoTa, источнизс -сальция, хлорное железо и кукурузный экстракт в качестве стимулятора роста, с последукйим выделением бактериальных спор из культуральной жидкости сушкой и смймивание.м .полученного концентрата спор с мелом, иолользуют крахмг1Л :: кукурузную муку 2 качестве . источника углеро;а/ --лел природньй -- в качестве ;- сточника кальция, JipK содержа KOMi;oiiGHгов Е ,итатсль ю;-: среде, г/л з олопроиодной Б оды: Кукуруз}1ая мука Сегпокислып пмьюний Mej прИкЮдпый Кукурузный экотракг 50%-:ый раствор ;:j.op0,16-0,3 мл. HoiO железа .при этОГ ЕЬрашиван - б.актерг-й зедут при рН 5,8-7,2 и коэФФи1.;кенте заполь;сния среды 0,7-0,9, а выделение спор ;у7 ьтуральнои жидкости OGy::iecT3j;nr)7 рполылпт льной с:ушкой Б присутст:а и 1-2 об. % хлори:::того натрия. Cyi-i,;iocrb способа закл;сч етоя в оледую/дем. Пе1;;ВО;1ачальное когичество посевного материала может быть уме-Еьшено до 0,l-G,2v от обт.ема сраль:, если матертчал исгю Ьоуют г, ви;д(; спор в возрасте от 7-Я О сут до 2 i.-ieo. или риал n :;ei CTEBJiefi в вида вегетативных клетол (табл.1) . Процесс вырациваь ия с ферментере ;зедут в течение 3 сут„ при .35 - 37 С, коэфф ициензапо.пнйния сре,ш.;Л О ,-7-0 ,-грН среды 5,8-7,2, в аг- аэробнЕ;К. условиях без прю 1е-иивант Я при избьточком ;цазлении О, 2- О, 1 ати, В Г7роцеосе развичня бактерий среда .подкисляется , для усреднения среды через 30-48 ч зырагщтвания и далее через каклые ч необходимо включать мешалку ija 0,5 мин. В качестве за1:дитно1о компонента добавляют хлористый натрий в количестве 1 об.%.. Результаты испытаний этих опера;.;ий лриБе;1;1ены в табл, 2. Этот способ noaBOnHevi пог учить сухой концентрат с сод;ержанием спор 8-15 млрд/Го Концен рат отангартиэуют мелом до содержания спор в нем 0,8-1,2 млрд/г. Выращивание продуцента на предла гаемой среде и применение распылительного способа высушивания повыша ет жизнеспособность спор, увеличивает срок хранения препарата с 8 ме до 1-1,5 лет без снижения количества спор и позволяет уменьшить дозу препарата в мочке льна с 1 до 0,5 к льносоломы. Влияние способа сушки спор СР. е Siveum на сохранение hx титра в препарате показано в табл.З. Влияние способа получения препарата на мочку льна показано в табл.4. Пример 1. Исходная культу С&, f e siheom хранится в ампулах под вакуумом в лиофильно высушенном со тоянии. Для приготовления посевного материала ампулу вскрыв.ают, проверяют на чистоту посевом на мясо-пеп тонный бульон.Содержимое ампулы CNbiB ют 10 мл стерильной водопроводной ды и засевают по 0,1 об.% в питате ную среду, в которой выращивают культуру в анаэробных условиях 2 с при 35-37°С. Отбродившую культуру вынипают и термостата, подсчитывают количеств спор с помощью камеры Горяева, мик роскопируют и используют в дальней шем в качестве посевного материала для ферментеров. Для массовог о выращивания СЕ. ее sineurn в ферментерах применяется питательная среда следующего состава г/л: картофельный или кукурузный крахмал 19 (на абсолютно сухой вес); мука кукурузная 7 (на,абсолю но сухой вес); экстракт кукурузный 4 (на технический вес); мел природный обогащенный 6 и аммо-ний сернокислый 1. Среда содержит такж 0,3 глл 50%-ного раствора хлорного железа и 1 л водопроводной воды. Стерилизуют в течение 1 ч при 2 ати РН после стерилизации 5,8, Коэффиц ент заполнения среды в ферментере 0,8, Для эасева ферментера используют посевной материал в виде вегетативных клеток в количестве 2% от объема среды в ферментере или в виде спор в количестве 0,1-0,2%. Выращивание ведут в анаэробных условиях без перемешивания среды при 35-37°С с избыточным давлением в ферментере 0,2-0,4 ати, В процессе развития бактерий при сбраживании крахмала вьщеляются -газообразные продукты (СО и Н2) и среда лодкисляется, Для усреднения среды через 30 ч выращиванил и далее через каждые 6 ч необходимо включать мешалку на 0,5 мин, В конце ферментации в 1 мл культуральной жидкости содержится 250-300 млн,спор С. f neum. Затем в культуральную жидкость добавляют 1 об.% хлористого натрия и проводят распылительное высушивание, Сухой концентрат с содержанием спор 8-15 млрд/г размалЕзшают и разбавляют мелом. Количествоспор в готовом препарате должно составлять 0,8-1,2 млрд./г. Полученный сухой препарат расфасовывают в бумажные машки. Выход спор в препарате составляет 20-40 % к титру спор в культур льноЯ жидкости, 1Пример 2, Для массового вы|ращивания С. f eEsineum в ферметерах использовалась питательная среда следующего состава, г/л водопроводной воды: крахмал картофельный или кукурузный 10 (на абсолютно сухой вес), кукурузная мука 5 (на абсолютно сухой вес), кукурузный экстракт 2 (на технический вес),мел природный обогащенный 3 и аммоний сернокислый О,5,Среда содержит также 0,16 мл 50%ного раствора хлорного железа. Среду стерилизовали в течение 1 ч при 2ати. рН после стерилизации 5,8-7,2. Коэффициент заполнения среды в ферментере 0,9, В конце ферментации в 1 мл культуральной жидкости содержалось 140200 млн. апор ГГ e sineum , что в 2,8-4 раза больше по сравнению с известным способом. Пример 3, Для массового выращивания ce.feestneum в ферментерах использовалась питательная среда следующего состава, г/л водопроводной во-. ды; крахмал картофельный или кукурузный 30 (на абсолютно сухой вес),кукурузная мука 15 (на абсолютно сухой вес), кукурузный экстракт 10 (на технический вес), мел природный обогащенный 10 и аммоний сернокислый 1, Среда содержит также 0,3 мл 50%-ного раствора. Среду стерилизовали в течение 1 ч при 2 ати. РН после стерилизации 5,8-7,2, Коэффициент заполнения среды в ферментере 0,7, В конце ферментации в 1 мл культу.ральной жидкости содержалось 130200 млн, спор СВ. f е е sineurrt, что в 2-4 раза больше по сравнению с известным способом. Таким образом, предлагаемый способ по сравнению с известным позволяет увеличить со.цержание спор п культуральной жидкости в 5-6 раз, а в готовом препарате - в 4-6 раз.Срок хранения препарата увеличивается с 8 мес. до 1-1,5 лет, а время мочки льна сокращается на 10 ч. Количество посевного материала, % - гетативные клетки 2 6 10 Споры 2 4 0,1 0,2 ВариантВыход тель Без Nace С 1% NaCe С 0,5% NaCe .С 2% NaC Сушка , . исходный через Таблица 1 Титр спор в ферментере млн/мл 280 240 220 .220 200 280 270 Таблица 2. спор ,Г1ри распыли- Выход спор при калоой сушке, %риферной сунже, % 20 15-17 4017 25-3015-17 40rj Таблица 3. итр спор 8 мес. через 1 год через 1,5 года

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОГО ПРЕПАРАТА МАЦЕРИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ДЛЯ МОЧКИ ЛЬНА, предусматривающий выращивание бектерий CEostridium feesirreym в анаэробных условиях на жидкой питательной среде, содержащей иdтoчник углерода, .сернокислый аммоний в качестве источника азота, источник кальция, хлорное железо и кукурузный экстракт в качестве стимулятора роста, с последующим вьщелениембактериальных спор из культуральноЯ жидкости сущкой и смешиванием полученного концентрата спор с мелом, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода целевого продукта и повышения его качества, в качестве источника углерода используют крахмал и кукурузную муку , а в ка- чёстве источника кальция - природный мел, при содержании компонентов в питательной среде, г/л водопроводной воды: 10-30 , Крахмал 5-15 Кукурузная мука 0,5-1,0 Сернокислый аммоний 3-10 Мел природный (Л 2-10 Кукурузный экстракт 50%-ный раствор 0,16-0,3 мл хлорного железа при этом выращивание бактерий ведут при рН 5,8-7,2 и коэффициенте заполнения среды 0,7-0,9, а выделение спор из культуральной жидкости осуществляют распыл 1тельной сушкой в присутствии 1-2 обм.% хлористо4 СО го натрия.:, сл со СХ)

1,0

1,0

1,0 .

0,820

0,750

1,0

1,0

0,5

Таблица 4,

72

14

20

58

24

33

48