Способ количественного определения коллагена Советский патент 1982 года по МПК G01N33/56 G01N33/80 

(5А) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛЛАГЕНА

I

Изобретение относится к медицине, а именно иммунологии, и может быть использовано при анализе иммунных препаратов.

Известен способ количественного определения коллагена радиоиммунологическим методом, Заключающийся в том, что к исследуемому образцу добавляют известное количество меченного радиоактивным изотопом коллагена и определенное количество антител IAT) или антисыворотки к этому коллагену. Образовавшиеся в ходе иммунологической реакции нерастворимые комплексы антиген-антитело (АГ-АТ) отделяют соосаждением с дополнительной , не связанной с исследуемой системой АГ-АТ, дающей обильный преципитат. После тщательной отмывки осадка от неспецифически сорбировавшегося меченного коллагена по преципитировавшей радиоактивности, с помощью заранее построенной калибровочной кривой, определяют количестВО коллагена в исследуемом растворе. Чем больше коллагена в исследуемом растворе, тем меньшая часть от внесенного меченного коллагена осядет в виде преципитата, так как между коллагеном исследуемого раствора и внесенным меченным коллагеном происходит конкуренция за антитела к коллагену tl.

Основным недостатком этого мето10да является сложность методических процедур, трудоемкость и многоэтапность его проведения. Процесс маркирования радиоактивными метками связан с использованием больших коли15честв изотопов. Необходимость проведения маркирования антигена сопровождается частичной денатурацией молекулы и нарушением ее антигенных свойств. При этом равная конкурентная

20 способность меченного и немеченного коллагенов в,реакции с антителами не всегда имеет место, что сказывается на результатах анализа. Кроме то9го, при отмывании преципитата возможно его частичное растворение, что также влияет на точность измерения. Цель изобретения - упрощение способа количественного определения коллагена. Поставленная цель достигается тем что согласно способу количественного определения коллагена, включающему постановку серологической реакции с исследуемым раствором и последуют щее измерение преципитирующей радиоактивности, предварительно проводят адсорбцию коллагена на полихлорвиниловую поверхность в буферном растворе при рН 9,0-10,0 и температуре 3037, в течение 2-6 ч, затем на полихлорвиниловую поверхность наносят разведения исследуемого раствора с фиксированным количеством антител к коллагену инкубируют при 16-25 0 в течение 3- ч и связывающиеся при этом антитела детектируют вторыми fl-антителами к иммуноглобулину животного продуиента антител к коллагену. Пример 1. Исследуемый образец в различных разведениях смешивают с определенным количеством антител (антисыворотки) к коллагену. При этом часть внесенных антител связывается с коллагеном, содержащимся в исследуе мом образце и теряетспособность в дальнейшем взаимодействовать с коллагеном. После непродолжительной инкубации в течение 1-2 ч при комнатной температуре полученный раствор вносят в лунку полихлорвиниловой поверхности на которую адсорбирован коллаген. Кол лаген в буферном растворе рН 9,0-10, адсорбируют на полихлорвиниловую по-, верхность в течение 2-6 ч при температуре 30-37,5°С. Антитела, не провзаимодействовавшие с коллагеном исследуемого образца, специфически реа гируют с коллагеном, абсорбированном на твердой поверхности. После этого все неспецифически адсорбированные вещества удаляются промыванием, а ан титела, связч1вшиеся с коллагеном твердой фазы остаются и затем детектируются вторыми меченными Sl-антителами к иммуноглобулинам животного - продуцента антител к коллагену. Избыток вторых антител удаляют про мыванием. Количество коллагена определяется по калибровочной кривой (см. чертеж), исходя из количества радиоактивности, специфически связавшейся на полихлорвиниловой поверх 24 ности. Построение калибровочной кривой отличается тем, что в качестве исследуемого берут препарат чистого коллагена известной концентрации. Пример 2.,Л. Получение твердой фазы. В лунку полихлорвиниловой поверхности вносят 50 мкл раствора коллагена 1 типа быка (17 мкг/мл) в 0,01 М натрий-карбонатном буфере рН 9,6 и ингибируют 2 ч при и ночь при С. Промывают 10 раз холодной водопроводной водой и вносят в каждую лунку по 200 мкл 10|-ной нормальной лошадиной сыворотки в фосфатном буфере рН 7,0 (0,15 М KfjHPO +0,075 М NaCI + 0,02% NaNj +Q,5% детергената). После инкубации в течение 2 ч при комнатной температуре 5 раз промывают нормальной лашадиной сывороткой и хранят при +Ц°С до использования (2-3 ч). Б. Определение количества коллагена в образце. К 50 мкл сыворотки, содержащей ант титела кролика к коллагену 1 типа быка, добавляют по 50 мкл различных разведений исследуемого образца,сделанных на фосфатном буфере рН J.O (0,15 М K( 0,075 М NaCl, рН7,0) и инкубируют 2 ч при комнатной температуре. Затем.этот раствор вносят в падготовленные, как описано по примеру 2 А, лунки полихлорвиниловой поверхности, покрытие коллагеном, и инкубируют 3 ч при комнатной температуре. Промывают проточной водой и вносят по 50 мл раствора вторых, меченных () антител барана к иммуноглобулину кролика (50х1б имп/мин, в фосфатном буфере рН 7,0). Инкубируют ночь при , промывают протЬчной водой, вырезают лунки и просчитывают радиоактивность на гамма-счетчике. Для неразведенного исследуемого образца получают счет имп/мин. При разведении этого же образца в 10 раз получают счет равный 39350 имп/мин. Исходя из внесенного количества радиоактивности 50000 имп/мин вычисляют процент подавления связывания радиоактивной метки с твердой фазой, равным 51,5 и 21,3 соответственно. Количество коллагена 1 типа быка в исследуемом растворе определяют по калибровочной кривой (см чертеж), исходя из процента подавления связывания радиоактивной метки, учитывая разведение. Иcrfbльзyя данные, полученные при разведении исследуемого раствора в 10 раз, находим, что в 50 мкл этого разведения содержится 0,11 мкг коллагена или его концентра ции 2,2 мкг/мл. Используя данные для неразведенного образца, получают,что в 50 мкл исследуемого раствора содер жится 0,10 мг коллагена или его концентрация составляет 2,0 мкг/мл.Усредняя полученные величины находят, что в исследуемом образце концентрация коллагена 2,1 мкг/мл. ГУ р и м е р 3- Условия проведени опытов аналогичны примеру 1, за исключением того, что в качестве иссле дуемого образца берут раствор коллагена 1 типа быка с исходной концентрацией 1 мг/мл. Делают разведения исследуемого образца 6 100 и 10000 раз. Количество связавшейся радиоактивности оказалось равным22130 имп/ми и 43550 имп/мин соответственно, а пр цент подавления связывания составляет 55f8 и соответственно.Определенная по калибровочной кривой кон центрация исходного раствора.составляет 0,93 мг/мл и 1,05 мг/мл соответ ственно. Из полученных данных видно, что способ позволяет получить результат с точностью 6, что вполне удовлетворяет требованиям, предъявляемым к подобным методам в биохимии и сравнима с известным жидкостным методом определения количества коллагена. 3 то же время предложенный способ методически значительно проще, чем жидкостной . Предложенный метод определения коллагена 1 типа является высокочувствительным, точным, воспроизводимым, высокоспецифичным« технически удобным, высокопроизводительным и не требует работы с большими количествами радиоактивности. Чувствительность ме тода 1 нг коллагена в пробе 50 мкл или 20 нг/мл. Специфическое связыват ние вторых AT составляет ЗО-Ю вно симой, дозы, а неспецифическое 0,9 4,5%. 926 Предлагаемый способ позволяет абсолютно специфично количественно определять коллаген а физиологических растворах. В связи с этим этот способ найдет самое широкое применение не только в лабораторных исследованиях, но и в клинической практике, благодаря своей простоте и высоким техникоэксплуатационным показателям. Использование малых количеств радиоактивности делает этот метод практически полностью безопасным, не требуя также никакого вспомогательного сложного оборудования. Полностью подготовленные для определения радиоактивности пробы могут храниться неделю в любых условиях, а при использовании пересчета на распад изотопа - практически неограниченно долго. формула изобретения Способ количественного определения коллагена, включающий постановку серологической реакции с исследуемым раствором и последующее измерение преципитирующей радиоактивности, отличающий ся тем, что, с целью упрощения способа, предварительно проводят адсорбцию коллагена на полихлорвиниловую поверхность в буферном растворе при рН 9,0-10,0 и температуре ,5°С в течение 2-6 ч, затем на полихлорвиниловую поверхность наносят разведения исследуемого раствора с фиксированным количеством антител к коллагену, инкубируют при 1б-25 С в течение З ч и связавшиеся при этом антитела детектируют вторыми -антителами к иммуноглобулину жиотного -.продуцента антител к коллагену. Источники информации, ринятые во внимание при экспертизе 1. Menzel J. Radioirnmunoassay or antlcol lagen antibodies ,using €.labelled collagen. J Immunol .Methr, 1977. 15, p.77-95. кШ I, и i 7 60 I M I л I I« да0,010, f НГ doSaS/isHHozo кацпаина на ГIff §Q унку 10