Способ получения адсорбентов,содержащих аминогруппы Советский патент 1983 года по МПК C08B37/12 B01J20/30 C12N11/00 

СП

00

сд

00 Изобретение относится в способам получения адсорбентов, содержащих аминогруппы, и может быть использовано при очистке биополимеров (напр мер, белков) методами гидрофобной и аффинной хроматографии. Известен способ получения адсорбентов, содержащих аминогруппы, путем присоединения лигандов (о6,си-диаминоалканов) к активированным твер дым носителям (Вгси-активированной агарозе) Cl К недостаткам способа относится Возникновение положительно заряженной изомочевинной группы в месте пр соединения лиганда к носителю и нео ходимость использования значительно го избытка диаминоалкана для предот Вращения поперечного связывания шар ков агарозы. Известен также способ получения адсорбентов, содержащих аминогруппы коБалентным присоединением лигандов К активированным твердым носителям {шу1мобилизацией лизина на ВгСи-акти вированной агарозе) 2. Однако этот способ вызывает появ ление на адсорбенте не только допол нительных положительно заряженных Групп в месте присоединения лизина к носителю, но и карбоксильных груп что может придавать адсорбенту неже лательные ионообменные свойства, Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и результатам является способ получения адсор бентов, содержащих аминогруппы, ков лентным присоединением лигандов (ди тидразидов двухосновных кислот) к. активированным твердым носителям (ВгСи-активированной анарозе), с последующей химической модификацией иммобилизованного лиганда (сукцинилирование и присоединение с,и)-диаминоалканов с помощью карбодиимидов). Полученные адсорбенты при физи ологических значениях рН не содержат заряженных групп в месте присое динения лиганда к носителю Сз , Однако этот способ отличается многостадийностью и необходимостью использования большого избытка дигидразидов и Дефицитных карОодиимидов. Кроме того, полученные адсорбенты могут содержать непрореагировавшие с диаминоалканом карбоксильные группы, что приводит, к появлению дополнительных заряженных груп и наличию неспецифичёских эффектов при хроматографии биополимеров Цель изобретения - упрощение про цесса и исключение неспецифических эффектов при хроматографии биополимеров на указанных адсорбентах. Указанная цель достигается тем, что согласно способу получения гшсорбентов, содержащих аминогруппы, ковалентным присоединением лигандов к активированным твердым носителям с последующей химической модифика:цией иммобилизованного лиганда в качестве лиг-андов используют гидразиды N-замещенных аминокислот или пептидов, а последующую химическую модификацию осуществляют обработкой носителя 3,9-4,1 М раствором хлористого водорода в диоксане или эквимолярной смесью трифторуксусной кислоты и хлористого метилена. Использование предлагаемого способа получения адсорбентов, содержащих аминогруппы, позволяет получать адсорбенты,не имеющие дополнительных заряженных групп, что исключает (ежелательные ионообменные эффекты при последующей хроматографии. Полученные адсорбенты могут быть использованы для очистки биополимеров, например, протеолитических ферментов, моно- и диаминок- сидаз, В последнем случае в качестве лиганда целесообразно использовать производные лизина, что приводит к адсорбенту с иммобилизован ам i,5-диаминопентаном - биоспецифическим лиг.андом для диаминоксидазы. Кроме того, при использовании производных лизина существенно увеличивается удельное содержание аминогрупп на адсорбенте. Адсорбенты,полученные по предлагаемому способу, могут служить в качестве исходного материала для последующего присоединения биоспецифических лигандов различной химической природы по аминогруппам иммобилизованных аминокислот или пептидов . В последнем случае открывается возможность получения высокоэффективных аффинньйс адсорбентов с незаряженньми гидрофильными пептидньми вставками. В качестве носителей могут быть использованы различные твердые носит.ели, устойчивые в условиях удаления И-защитных групп, такие как CL-сефароза, полиакриламидные носители, шарики из пористого стекла и другие. В качестве лигандов применяют гидразиды N-замещенных oJ.-, uj-, диаминокислот и т.д. Предлагаемый способ позволяет использовать в качестве защитных групп лиганда третбутилоксикарбонильную, тритильнуп, грифторацетильную и другие защитные группы, удаление которых можно осу1дествить в условиях, не разрушаю- щих адсорбент. Пример 1. Получение адСорбента ь-лизин-гидразид-СЬ-сефароза. Суспензию 10 мл BrCW-активированной CL-сефарозы в 10 мл 0,1 М раствора НаНСОэ, рН О,О, перемешивают 20 ч при 4°С с 50 мг (0,1 ммоль) гидразида П , М -ди-трет-бутилоксикарбонил (БОК)-1,-лизина, промывают

100 мл 0,1 М НаНСОз, водой, затем 50 мл смеси уксусная кислота - во (1:1) и окончательно водой. Полученный гель смешивают с 10 мл 1 М этаноламина, рН 9,О, перемешивают

2ч при 20 С и промывают водой. Согласно данным потенциометрическ титрования адсорбент не содержит положительно заряженных групп при физиологических значениях рН.

10 мл адсорбента (К, н -ди-БОК-L-лизин гидразид-СЬ-сефароза) промывают 200 мл ацетона, затем 100 мл хлористого метилена (или диоксана),обрабатывают 5 ч при. 10 мл смеси трифторуксусной кислоты и хлористого м- тилена или

3ч при 4°С диоксаном, насыценным liCl (4м), затем промывают хлористым метиленом (или диоксаном), спиртом, водньм спиртом и окончательно водой.

Результаты использования разлиных условий снятия БОК-защитньох групп приведены в таблице.

Адсорбент Ь-лизин-гидразид-СЬ-сефароза хранят в воде в присутствии 0,02% азида натрия при 4.

Количество НП -групп (мкэкв/г вл.веса)

-

количество сефарозы г вл.веса/100 лл суспензии

Прим ер 2. Получение адсорбента Ь-лиэин-гидразидглутаральдегид-биогель Р-300.

Перемешивают 20 мл биогеля Р-300 с 100 мл 6%-ного раствора глутарового альдегида в 0,1 М калий-Фосфатном буферном растворе; рН 7,0, в течение 17 ч при 37°С, гель промывают водой, смешивают с раствором 60 мг

Определение содержания лиганда в полученном адсорбенте проводят спектрофотометрическим методом в геле - по поглощению в УФ-свете суспензии г-ринитрофенилированных производных а 4иносодержащих адсорбентов в 0,1%-ном растворе агарозы.

Аликвоту адсорбента перемешивают 2 ч при 37°с с 1,5 мл 0,1%-ного водного раствора тринитробензолсульфокислоты, содержащего 0,1% NaHSO, в 3 мл 2 М калий-боратного буферного раствора, рН 9,2, фильтруют, гель тщательно промывают водой, выдерживают на пористом фильтре в течение 3 мин в вакууме водоструйного насоса. Навеску полученного трикитрофенилированного производного сефарозы (0,15 - 0,9 г влажного веса) переносят в кювету, содержащую 1,5 мл 0,1%-ного раствора агарозы в 1,5 мл 1м калийборатного буферного раствора и измеряют поглощение суспензии при 240 Hi-i ;;ротив аналогичной суспензии незамещенной сефарозы. Количество NH2-групп определяют по формуле

гидразида Н, К -ди-БОК-Ь-лизина в 30 мл 0,1 М калий-фосфатного буферного раствора, рН 7,0, перемешивают 2 ч при , промывают водой, затем 50 мл 0,1 М раствора НС1 и водой.

20 мл полученного адсорбента про мывают 200 мл ацетона, 100 мл хлористого метилена, затем смешивают с 20 мл смеси трифторуксусной кислоты. и хлористого метилена и перемешивают 16 ч при 4°С, затем промывают хлористым метиленом, спиртом, водным спиртом и окончательно водой, Адсорбент L-лизин-гидразид-глутаральдегидбиогель Р-300 по данным спектрофотометрического анализа в геле содержит 1,3 1мкмоль L-лизина на 1 г влажного веса. I

Пример 3. Получение адсорбента аминокапроилгидразид-сь-сефароза.

Суспензию 10 мл ВгСН-активированной CL-сефарозыв 10мл 0,1М раствора NaHCOj/pH 8,0, перемешивают 16 чпри с раствором 100 мг (0,2 ммоль) оксалата гидразида Н-тритил-С-аминокапроновой кислоты в 10 мл воды, промывают 100 мл 50%-ного диметилформамида, 100 глп воды. Полученный гель смешивают с 10 мл 1М этаноламина. рН 9,0, перемешивают 2 ч при 20°С н промывают водой. 10 мл полученного адсорбента про мывают 200 tvi ацетона, затем 100 мл диоксана, обрабатывают 2 ч (4°С) 4 М раствором хлористого водорода в диок сане, промывают диоксаном, спиртом, водными спиртами и окончательно водо Адсорбент по данным спектрофотометрического анализа в геле содержит 1,7 мкэкв NHj-rpynn на 1 г влажного веса; Таким образом, предлагаемый способ является более простым, чем известный, и исключает неспецифические эффекты, при хроматографии биополимеров на полученных сорбентах. Предлагаемый способ также позволяет повысить удельное содержание аминогрупп на адсорбенте (так, в случае использования Н,М-эащищенных производных гидразида лизина количество аминогрупп на моль шлмобилиаованного лиганда увеличивается вдво по сравнению с СзД или лигандами, содержащими 1 аминогруппу). Увеличение концентрации аминогрупп позволяет при дальнейшем присоединении биоспецифического лиганда существенно повысить концентрацию последнего на адсорбенте, что в ряде случаев может оказать положительный эффект на последующую хроматографическую очистку биополимеров. Предлагаемый способ исключает также наличие Гидрофобных групп на адсорбенте по сравнению с СЗ, что также исключает неспецифические эффекты при хроматографии биополимег . ров, Базовьо объектом можно считать аминогексилсефарозу (AH- Sepharose) продукт шведской фирмы Pharmacie Fine Chemicals, который широко используется в исследовательской работе. Указанный коммерческий продукт производится иммобилизацией гексаметилендиамина на BrCN-активированной сефарозё. Он содержит дополнительную полйжительнр заряженную группу в месте присоединения лиганда к носителю, а также гидрофобную ге ксаметиленовую углеводородную цепочку. Предлагаемые адсорбенты не содержат гидрофобных и дополнительных заряженных групп

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АДСОРБЕНТОВ, СОДЕРЖАЩИХ АМИНОГРУППЫ, ковалентным присоединением лигандов к активированным твердым носителям с последу|Ющей химической модификацией иммоби1лиэонанного лиганда, отлкчаю:щ и и с я тем, что, с целью упрощения процесса и исключения неспецифических эффектов при хроматографии биополимеров на указанных адсорбентах, в качестве лигандов используют гидраэиды К-эамеценных аминокислот или пептидов, .а последующую химическую модификацию осуществляют обработкой носителя 3,9-4,1 М раствором хлористого водорода в диоксане или эквимолярной смесью трифторуксусной кислоты и хлористого метилена.