Способ получения адсорбентов для хроматографии Советский патент 1976 года по МПК C08B37/00 C08F8/00 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АДСОРБЕНТОВ ДЛЯ ХРОМАТОГРАФИИ жащям функциональные грутшы, необходимые для ковалентного связывания с носителем (в количестве 1-5 функциональных групп на 1ОО моносахаридных/остатковJ, с пос. присоединением лиганпа путем предварительной активации полисахаридной вставкис помошью бромистого циана, периойатного окисления или других известны методов. Способ позволяет получать устойчивые биоспецифичвс ше адсорбенты с высоким со Держанием лиганда. Так, во всех случаях содержание лигайда на 1 мл адсорбента с полисахаридной вставкой примерно в 3 ра« а превыщапо содержание лиганда в анаЛогичных адсорбентах без вставки. В качестве носителей, наряду с агарозой, могут быть использованы производные полиакриламида шарики из пористого стекла и другие. Бйоспецифичность полученных адсорбентов обусловливается гидрофильной, инертной природой полисахаридной вставки , не несушей каких-либо гидрофобных или за ряженных групп. Для активации вставки применяются Достаточно простыв и хорошо разработанные методы, что позволяет присоединять К носителю как низкомолекулярные лиганды, относящиеся к различным классам органических соединений, так и белковые ли;Гандьи В последнем случае предлагаемый способ может быть использован и для иммобилизации ферментов. .Пример 1.. Получение биоспецифического адсорбента РНК-азадекстрансефарода (РНКаза - рибонуклеаза. А. Введение вставки в носитель декетрансефароза. К раствору 0,5 г карбоксиметилдекстрана (мол. вес 40000, степень замешения карбоксиметильными группами f 5 на 1 ОС .ангидроглюкозныхединицj в 6 мл воды добавляют б мл (упакованный объём аминоэтилсефарозы, содержашей 5 экв, I N Hj-rpynn на 1 мл геля. РН смеси доводят до 4,7-5 с помошью 1 н. НС t и пос тепенно добавляют раствор 2 О мг хлоргий рата 1-этил З/3-диметиламинопропил/-кар бодиимида (ЭДК) в 3 мл воды. Реакционную смесь перемешивают 48 час при 20 поддерживая в течение; первого часа рН 4,7-5 с помошью 1 н. НС|. Затем сеф&розу отделяют, промывают водой (1ОО мл 0,1 М J4aHCOg (100 мЛ) и вновь водой (ЮО мл. Для блокирования остаточных свободных N Hj|-Tpynn суспензию декстран сефарозы в 6 мл воды пере ешивают 6 ча при с 0,О2 мл уксусной ки лоты и 2 мг ЭДК, промывают 1 л воды и используют в следующей стадии. 5 Б. Присоединение лнганда: РНК-азадек. трансефароза. К суспензии 5,5 мл декстрансефарозы в 5,5 мл натрийфосфатного буферного раст« вора, рН 6, постепенно добавляют 130 мг периодата натрия, и смесь перемешивают 1 час при 20 С. Активированный гель про. мывают 100 мл воды и смешивают с раст вором 40 мг в 1О Мл 0,1 М NoHCOg, содержащего 0,5 М NaCt. Смесь Перемешивают 20 час при 20 С, затем поС тепенно добавляют свежеприготовленный раствор 100 мг боргидрата натрия в 5 мл 6ОДЫ и перемешивают 1 час при 20 С. Полученный биоспецифический адсорбент отделяют, промывают на пористом фильтре 250 йл ОД М HaHCOj + 0,5 М ШС1, затем по БО мл ОД М ацетатного буферного раство i pa 1 М NaCt (рН 4) и О,1 М боратного буферного раствора 1 MNaCt (рН 8| (псюледние две промывки повторяюттрижйы По данным спектрофотометрического анализа и определения РНК-азной активности исходного белкового раствора и промывных вод, после присрединення белка содержакие РНК-азы в адсорбенте составляет 6 мг/мл объёма упакоеаатюго геля. Содерясанне РНК азы в адсорбекуёу полученном, прямым прк- соединением .фермента к CWBf-.- агсгйвирован ной сефаррзе не превышает 2-2,5 мг/мл объёма упакованного геля. Адсорбент может храниться д 1ительное время при 4 С в виде водной суспензии в присутствии 0,02% азида натрия. П р и М е р 2, Получение биоспец фического адсорбента РНК-азаамилопектиа сефароза. Адсорбент получают по методике, описанной в примере 1, исходя из карбоксиметнлового эфира амилопектина и аминоэтил- сефарозы. По данным спектрофотометричёс,кого анализа и определения РНК-азной ак- Ь;ив11рсти, удельнбе содержание фермента в адсорбенте 6,5 мг/мл объёма упакованногсз геля. I Примерз, Получение биоспеии- фического адсорбента гемоглобин-дёкстрансефароза. А. Получение модифицированного деке- трана - этилендиамннокарбоксиметилдекс- ; тран- . К охлажденному до 4 С раствору 2 г карбоксйметилдекстрана (мол. вес 4ОООО, Т -5 J в 6 мл воды постепенно приливают 1,4 8 мл 5 0%-ного раствора этилендиами- ,, на Б воде, 2 мл воды и 5 мл .пиридина. К раствору добавляют при перемешивании .. 1,91 г дициклогексилкарбодиимида в 5 мл пиридина. Реакционную смесь перемеши вают 48 час при 2О С, разбавляют 3 объёмами воаы, осадок отделяют, фильтрат обрабатывают эфиром (З х ЗО мл), водный слой упщтвлууг. Остаток растворяют в 2О мд воШл я вводят в колонку ( V 1ОО мп) сефадакса .3-«: SO вода. Фра1кпин, выхоавшвв с нскпючакймимся объемом, об-ьедянаичг, унарвпваюгг до ЗО мл, подщепачявают до рН 8-9; и полимер высаживают 2 объемами спирта. Осадок отделяют, растирайт со, сииртом, затем с абсолютным бййртом и сушат над Рд Og при 8О С/0,1 мм в течение 5 час. Выход 1,2 г (6О, 1%). Найдено, %: К 1,3, что свидетельствует о.модификации всех карбоксиметильныЧ ГруШ. i Б. Присоединение всташси к носителю декстрансефароэа. Суспенэшр 2 г СНВг-актнвированной сефароаы4В ОД М МаНСО, + 0,5 М аСС перемешивают 16 час при с l50 мг этйленДиамиаокарбоксиметилаеюс- ,( Т 5). Затем |свфарозу промывают на пористом фЕ(Л|ЬГрв водой (5О мп), 0,1 М ацетатным буферным раствором (рН 4) (50 мп) и водой (110 мл). СОРпасно определению содержания азота в промывных водах (по Кьепьдапю), с сефа- ||розой 1ковалентно- связывается 114 мг 7в%) П|юизв1оярого декстрата. Для блокирования сютавшихся активных групп на сефарозе промытый гель переме- ;1иивают 2 час при 2 О Со двумя объемами 1 М этанрламина йри рН 8, а для блокирования N Н -групп на полисахаридной Вставке, не вступивших в реакцию с СЫВгактивированной сефароэой, суспензию геля в ёоде перемешивают 6 час при 20 С с . ;О,02 мл ледяной уксусной и 2 мг ЭДК. После промывки водой (1ОО мл) дек 1трансефарозу используют в следующей стации., . В, Присоединение лиганда гемоглобиндекстрансефароза. К охлажденной до 4 С суспензии 7 мл (упакованный объем) декстрансефарозы, по лученной в примере ЗБ, в 7 мл воды добав ;ЛяюТ При перемешивании 7 мл 2 М раствора На.СО и затем 0,35 мл раствора бромистого циана в ацетонитриле (2 г CNBl мл MeCN). Взвесь энергично перемешивают 2мин Выливают на пористый фильтр, быстро промывают 0,1 М МаНСОд, водой и 0,1 М 1«аНСОз + О,5 М NaCe (по 1ОО мл). За ;Тем активированный гель смешивают с раст:вором 4О мг гемоглобина в 8 мл 0,1 М уЦаНСОд + О,5 М NaC , и смесь перемеши1вают 20 час при 4 С. Промывание биоспе- цифического адсорбента проводят, как описано в примере 1 Б,. Согласно спектрофотометряческому лиэу (при X 280 и 40О нм) адсорбент со держит 6,2 мг белка/мл упакованного Гели. Адсорбент, полученный прямым присоедийе--: нием гемоглобина к CN В(-активировайноЙ сефарозе, содержит 1,5 мг белка/мл , Темно-коричневый адсорбент хранят прй 4 С в воде в присутствии О,О2% азида натрия, П р и М е р 4. Получение биоспёЗй-. фического адсорбента поли U -глико1 енбИо гель марки Р-ЗОО (поли U -полиуридиловая кислота). А. Введшие вставки в носитель гликб генбиогель Р-ЗОО. Присоединение 0,5 г карбоксиметилгликогена (f-S) к 5 мл аминоэтилбиогелн Р-ЗОО проводили, как описано в примере 1А с прмощью водорастворимого карбодиимида. Б. Присоединение лиганда поли У-гликогенбиогель Р-ЗОО. К перемешиваемой суспензии 5 мп гликогенбиогеля Р-ЗОО, полученной в примере 4А, в Ю мл смеси вода - 2 М NajCOg (1:1) добавляют при охлаждении (4 С) 0,3 мл раствора бромистого пиана в аце- тонитриле-(2 г CN Вг / мл MeCN). В момент присоединения бромистого Циана наблюдается слипание шариков биогеля, месь энергично перемешивают 1,5 мин и фильтруют, гель промывают на пористом фильтре 0,1 М NaHCOg, водой и 0,1 М НаНСОд + 0,5 М МаСг (по 75 мл). Про- {мытый гель вносят в раствор 6 мг поли J в 7 мл 0,1 М натрийфосфатного буферноЬо раствора (рН 7,5), и смесь перемешивают 16 час при 4°С.. . . Полученный адсорбент промывают 50 мл О,1 М натрийфосфатного буферного рас- JTBOpa и перемешивают 2 час с равным объемом 1 М этаноламина (рН 8) для бло кирОвания остаточных .активных групп на полисахаридной вставке. Затем адсорбент промывают 5О мл 90%-ного формамида в (10 мМ.калийфосфатного буферного раствора (pff 7,5), содержащего 110 мМ ЗДТА и 0,2% (додецилсульфата и 50 мл 25vo-HO го формамида в 50мМ трис-HCfc. буферного раствора (рН 7,5), содержащего 10;мМ ЭДТА и 0,7 М NaCf. Количество присоединенногополнУ определяют по адсорбции пди Л 260 нм исходного раствора полинуклестида и промывных вод. Согласно спектрофотометри- ческому анализу, удельное содержание лиганда составляет 536 мг/мл адсорбента. Адсорбент хранят при 4 С в виде суспен- аии в присутствии О,02% азида натрия. 52037 Формула изобретения Способ получения адсорбентов для хроматографии путем присоедннеявя лиганда к носителю через вставку, отличаю ш я и с я тем, что, с целью упрошеняя процесса присоединения лиганда, по- вышеыия удельного содержания пиганаав адсорбенте и улучшения биоспецифичностн 08 адсорбента, носитель подвергают взвимо действию с инертными водорастворимыми 11аэлисахаридами, содержащими функционапьиые группы в количестве 1-6 иа 1ОО моч носахаридных остатков, обеспечивающие ковалентное связывание с носителем, с последующим присоединением лигандов путем предварительной активаций полисахаридной вставки.