Способ получения -аминокислот Советский патент 1976 года по МПК C07C101/02 

Изобретение относится к усоверпюггстоованному способу получения L -лмииокис- лот, таких, как метноиин, лсппрлги.нонпк кислота, серии, лейцин и других, гидролиза рацемических N -пцилпмииокисло Известен способ получения L -asfHiio- кислот путем гидролиза рацемических лцетиламинокислот с помощью иммобили,юв,.п(ной ацилазы, получаемой адсорбцией ацило- зы на ДЕАЕ-сефадексе. Недостатком этого способа явЛгется необходимость сильного сгущения реакционны смесей при выделении продуктов реакции, связанная с теьХ, что гидролиз осуществляется в разбавленных растворах ациламинокислот (растворами, концентрация которых прювыщает 0,2М; ацилаза быстро вымывается из ДЕЛЕ-сефадекса). Кроме того, необходимый для нригатов.ления иммобилизованной ацилазы ДЕАЕ-се1фадекс- Является малодоступным импортным органическим носителем, химические и фигм1чоские свойства которого могут меняться , при эксплуатации. С целью интенсификации процесса по предл.1г 1омо у способу непрерывный или многократный ассиметрический гидролиз рацемических aцилл(инoкиcлoт при рН 7-8 и 1540 С осуществляют, используя в качестве каталиг атора легко получаемые препараты аииллзы, сорбированной на отечественных гюорганических сорбентах с повышенной удельной поверхностью (таких, как силикагель или силохром). Сорбцию аиилазы на указанных сорбентах осуществляют при температуре от О до 25°С, причем силикагель предваритолыю приготавливают кипячением с кис-лото/. Поскольку получаемые в реакции /, аминокислоты ингибируют ацилазную активность, то препараты иммобилизованной на силикагеле или силохроме ацилазы при перерьтах в работе отмывают и в буфере рН 7 при 2-6°С. Сорбировавщий ацилазу силохром после потери каталитической штиБности в результате использования регенерируют прокаливанием при 200-700 0 и снова используют для сорбции новой пор цин ацилазы. Преимуществами предлагаемого способа является; возможность непрерывного или многократного асиметрического гидролиза рацемических ациламин окис лот при повышен- ных коацентрациях последних (до 0,5 М); более высокая скорость асиметрического гидролиза рацемических ацгшаминокислот на 1 мл объема работающей иммоб илиэ,9ванной ацилазы (до ЗООО мкмоль L -аланина к до 625 мкмоль L-метионина в 1 час). Кро , меооходимые для пр}ггоговления иммобилизованной ацилазы неорганическиенд- сители (например, силикагель или силохром)

редставляют собой легко доступные выпускаемые отечественной промышленностью сорбенты, отличающиеся химической стойкостью и постоянством хороиаей фильтрующей i способности и.-других фиапческих свойств, f Предлагаемьп способ позволяет с помощью лрепаратопиммобилизованной аднлазы,

адсорбиров.лшой например на силйкагеле или cилoxpovfe, получать белковые и другие L -aNiHHOKnc/iorb (что зстаиойлоно полу-L

-мегиО

че ij (ОМ 1L -сеffUiiis L -aciin|)ni-iMiOt;i;ij ;сисло-ты,

piiiia fi L -jieiiiuiH;j).

bjjiyчоннr.ni Rtiefiapii i нс--|5астиориvfой аци- ла-м лранят i. О, 1А1 фосф.тиом Oyfjjepe с р( oi.OiiO 7 при ,

;fio/.if iijii;i4eHtio/-o для лреьращония колнппсгр.а р;идем 1ческой ацилакягнокислоты ГО7О 1 I ii-.i/JHiiii (злсгоор; pif коТОрого устаHAbjiih.v, 1-i I (fcH грирОБаиных Doaiu.Kd aiv;- MH;ih; 4 ,-ti (icO(U:.Mrrf;a)-trifi pauijMичес-

кой ,MU bl lNniIiii;;liCJiaT : ,ОД.-0,5М), СООТBeTC:TByioii(f;e количосгд о снл(1к,(еля нлп си- Jjoxi KVi/; с чП.мл, гмвносгью (храпя- шегск.;; fi 0,J, М ;l)&cdiaTHOM буфере f.: (м ужоло 7) яспо,1и-;зу(;г для з июл Г1ек 1Я с-гек; ч пгой географической колонки с pyGaiiTKOii для ииркуляцнн обогрева- юшей воды (д, Г1епре|) гтредесса) или о-1х|)ильтровыр.гчюг па BoporsKe Бтохнера w си..е вламчным в сосуд ппп проведеимя ре-акции (провс:доггня процесса в массе).

ilpa ocyiiiocrBvTGiUiF (рьгви9го процес са колонку с; npen,:iparoM иммобилизоBaHHOii аип.пазы, гермсх:татировга1ную на 7ем перстуру до 4C5JC с помоаа к) ультрйч-ермо-CTajvi. ;.:ояу;г:ак т рчстпор рацемической ага5шаииНО а слО1,;. с r-aKoit осоростью чтобы ,5се Kv)/ :i;:;cTt.:) .щигл- L -аминолагслоты успевало про; )шиол:Г1В;;аЬся до соответствую™ Utofi- aMi;H yK K:. ; 1олярная концен-

грйии-j убразузо: -;: ;i- -ал-гшгоктгслогы

ДОС7ТГ-ПОТ .rfOHOJiUHbi )рацйи исходной ра1 ем 1ческой йЦ1глл л ;коккслогы), В колонке с пpeiapaтo ; (.-п билизовакной ацилазы

но снова использовать для получения Ц -аминокислоты из новой порции рацемической ациламинокислоть (такое использование, без снижения ферментативной активности препарата можно повторять ие менее 5 раз).

Раствор получаемой реакционной смеси сгущают в вакууме при 40-50°С и образовавшуюся Ц -аминокислоту вьшеляют, добавлепьом спирта к сгущенному остатку; ацил- D -амш-юкислоту из соединенных филь;- гратов после отфпльгрования L -SMHUOKHCлогы выделяют нрн г( колонки с каги нитом КРС-4 Б водородной ,

П р и м е р 1, 10 г апе тонового пороги- ка свиных почек суспендируют в 50 мл охлажденной дксгнллнрованной всУды и выдерживают при С, периодически перемешивая, 20 час. К получег111Ой суспензии добавляю;) фкльтрадиониый noponjOK; фильтроперлит .1 (около .3 г), пореме 1 ИВ((ЮТ содержи- и отфильгровываюг на воронке Бюхнера. Полученный в фильтрат экс7ракт (с ацилаэН:л1 активностью около 2000 мкмо; ь/час Ь на 1 мл p.iCTBOpa и pli около

7 7) сразу используют для приготовления препгтратов иvjMo6иллзовзиной ацилазы.

2 г силохрома суспендируют сЮмл экстракта и вьщерживазог, периодически перемешивая, 20 час при . Затем сило хром отфи,льгровьгоа.ют па воронке Бюхнера, промывают 1 н. хлористым натрием в ОДМ фосфатном буфере 6. / и ф х:фатным буфером I

Ь рЬ 7,2 до отсу-тствия белков в промывной жи/ кости. К он гр ОЛЬ/За содержанием белков в исходном экстракте, фильтрате и промывных

жидкостях СХ7}-ЩеСТВЛЯЮТ TpИXЛOf)

уксусной КИСЛОТОЙ и по Лоури Ацилазная активность (обнаруживаемая тонксхглойной хроматографией по гидролизу испытуемой ацил- В - L -аминокислоты и оцениваемая с помощью нивггкдрнна по концентрации воэникаютей в реакции L -аминокислоты) около 1000 мкмоль/час освобождаемого в ейкции L -аланица на 1 г силохрома, взятого для иммобилизации. .без снижения ее каталитической активности процесс получения L -аминокислоты мож но вести непрерывно (не менее 2О дней), При осуществлении процесса в массе в сосуд с препаратом иммобилизованной ацилаэы наливают раствор рацемической ациламинокислоты и ;-.ьшерживают при температуре до , изредка перемешивая содержимое, до завери.ения реакции получения Ь -аминокислоты (о чем судят, как в предыдущем случае). Затем отфильтровывают препарат иммобилизованной ацилазы от по дученной реакционной смеси и иммобилизо« ванный фермент промьюают ОДМ фосфатным буфером с рН около 7, после чего его можПолученный препарат сорбированной на силохроме ацилааы загружают в колбу с 300 мл 0,5М раствора рацемического N -ацетил-аланина, рН которого устанавливаю к центрированным аммиаком на 7,2 и выдерживают в термостате при в течение 24 час. По окончании реакции лизованной фермент отфильтровывают i и, i промыв 0,1 М фосфатным буфером с рН7,2 используют вторично. Полученный в результате прошедшей реакции раствор упаривают в вакууме до сиропа при 45°С. После охлаждения до комнатной температуры добавлшот 30 мл этилового спирта и оставляют на 16 час при 4°С для кристаллизации. За тем кристаллы (Л -алакина отфильтровывают, промывают спиртом и высуигивают при 50°С до постоянного веса. Выход идентифицированного тонкослойной хроматографией на силикагеле (в системе бутанолгуксусная кислота:вода, 4:1:1 по объему) хроматографически однородного L -алашша 4,7 г {70%),1п н- 14,1 о (с 1,5 н. нее ). Фильтрат после отфильтровывания L -ал нина упаривают на вакуумном роторном испарителе при до небольшого (около 50 мл) объема и рН раствора 2 н. соляной кислоты доводят до 2,5-3. Подкисленный раствор пропускают через колонку со слоем 0,9x30 см катис)11итаКРС-4 в водородной форме, через которую затем пропускают дистпллиров ан1 ую воду. Далее собирают фракции и проверяют на отсутстви свободных аминокислот реакцией с нингидрином. Объедш енные кислые фракции упаривают в вакууме на роторном испарителе до сиропообразного состояния и оставляют на холоду кристаллизоваться. Перекристаллизовыватот из ацетона. Выход ацетил- D - W 1 1.1 г; т.пл. 1250С; -аланина 62,2° (с 1.вдда). ТГр и м е р, Экстракт ацетонового (с активностью 1800 мкмоль/ порошка почек мл) /час С -аланина на 1 мл получают по примеру 1, Сорбцией ацилазы из 50 мл экстракта на 10 г силохрома , как в примере 1, получают препарат сорбированней на силохроме ацилазы с активностью около 900 мкмоль/час L -аланина на 1 г исходного силохрома. Этот препарат в виде суспензии в ОД М фосфатном буфере с рН 7,2 загружают в снабженную рубашкой колонку (20x2 см), избегая пузырей воздуха в массе сорбента. Затем промывают колонку О,1 М фосфатным буфером с оН 7,2. После этого через слой иммобилизованной ацилазы в колонке, термостат Т5С1ианиой на с помошью ультратермост.гга. пропускают 500 мл 0,1 М pacTBOiici рацемического ацетилаланина с рН 7,2-7,4, установивскоростьпротекания, обеспечивающую ; Завершение реакции дезацетилпрован1гя, за кото|эой следят при помощи нингидршювой реакции. Далее из раствора выделяют и характеризую 5сроматографически од}10родный 1 алшгин уак же, как в примере 1. Выход 1,8 r(); ,2 (с 2,5н. HCt ). Формула о б р е т Способ получения L -аминокислот путем асиммеггричоского гидролиза рацемических N -ациламинокислот с помощью и мoбIIЛизoвaннoй ацилазы в качестве к-.тализатора, отличающийся тог. что, с целью интенсификации процесса, lioслед ий ведут в присутствии ацилазы, иммобилизованной неорганическим носителем, таким, как силикагель или силохром.