Способ определения @ -глутаминовой кислоты Советский патент 1982 года по МПК C12Q1/00 

Изобретение относится к биохимическому анализу, а именно к количественному определению L-глутаминовой кислоты, и может использоваться для контроля технологии и качества L-глутаминовой кислоты, для анализа пищевого и кормового сырья и продуктов.

Известны способы энзиматическипотенциометрического определения Lглутаминовой кислоты, основанные на измерении выделяющейся двуокиси углерода СО, селективным электродом 11 .

Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому результату является способ определения L-глутаминовой кислоты путем обработки анализируемой пробы энзимом на основе L-г.лутаматдекарбоксилазы. Выделяющаяся при этом уг.г1екислота вызывает изменение потенциала COg селективного электрода. Концентрацию L-глутаминовой кислоты определяют по калибров04нему графику зависимости потенциала от концентрации кислоты 2.

Недостатками указанного способа являются большой расход водорастворимого препарата, L-глyтaмaтдekapбoкcилазы и недостаточно выраженная количественная зависимость между концентрацией L-глутаминовой кислоты и потенциалом электрода.

Цель изобретения - упрощение способа.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения

L-глутеминовой кислоты путем обработки анализируемой пробы энзимом на основе L-глутаматкарбоксилазы, иммобилизо10ванной на силохроме,содержащем бромацетильные группы, с последующим потенциометрическим измерением образующейся двуокиси углерода, i качестве энзима используют Ь-глутаматдькарбок15силазу, иммобилизованную на силохроме, содержащем брсмацетильные группы. Пример. Получение иммобилизованной ь-глутаматдекарбоксилазы. В качестве носителя используют амино20пропилсилохром СХ-2,5 С размером грану.п 0,1-0,2 мм. Для введения бромацетильных групп 5 г носителя суспендируют в 40 мл диоксана, прибавляют 0,56 г бромуксусной кислоты и зквива25 лентное количество 0,83 г N, N -днциклогексилкарбодиимида. Реакционную смесь перемешивают на качалке при комнатной температуре в течение 3 ч. Получен11ый активированный носитель про30мывают диоксаном, водой и 0,1 М фосфатньм ч уферньм растворам (рН 7,2). Для иммобилизации используют препара L-глутаматдекарбоксилазы из Escherichia coli шт. вОО, с активностью 46 Е/мг белка (Е-мкмоль «мин ) . В 40,0 мл раствора L-глутаматдекарбоксилазы (0,1 М фосфатный буфер, рН 7,2, концентрация белка 6,26 мг/мп) суспендируют 5 г активированного носителя, и смесь перемешивают Нк хачалке.18 ч при . Затем носитель со связанным ферментом прсялывают ведой 1 М раствором NaC и 0,05 М фосфатным буфером (рН 6,0). Активность иммобилизованного препарата 1508 Е/г, выход по активности 65,5%. Иммобилизованный препарат хранят в холсдильнике () в виде суспензии 0,05 М фосфатном буфере (рН 6,0), содерзйащем 0,026 мг/мл пиридоксальфосфата. Пример 2. Методика определе ния L-глутаминовой кислоты. Перед измерением в реакционную ячейку вносят 170 мг иммобилизованно Ь-глутс1матдекарбоксилазы (260 Е) . Исследуемый раствор L-глутаминовой кислоты подготавливают установлением рН 3,8-4,0 0,1 N-pacTBOpOM НС или NaOH и внесением NaC в таком количестве, чтобы конечная концентрация NaC была 0,05 М. Блок электродов рН-метра помещают на вспомогательную ячейку,-содержаш,ую раствор электроли та (0,005 М ЫаНСОэ, 0,005 М NaCt, 1% метилцеплюлозь и 0,1% твин-20) , так чтобы шарик стеклянного электрода бь полностью погружен в раствор. После уравновешивания электрода, избыток электролита с поверхности шарика уда ляют при помощи полиуретановой губки. Блок электродов переносят на реакционную ячейку. Изме рение вьщеляющейся двуокиси углерода осуществляют обычным стеклянным H чувствительным электроде, котЪрый отделен от реакционной смеси воздушHfcJM зазором. Исследуемый раствор помещают в ячейку и закрывают , в котором смонтированы стеклянный и вспомогательный электроды. При этом шарик стеклянного электрода, предварительно покрытый тонким слоем элект;;-. ролита, остается отделенным от реакционной смеси воздутиным зазором. L-глутаминовую кислоту декарбоксилиРуют ферментом, иммобилизованным на ранулах силохрома,, содержащего бромацетильные группы. Выделяющаяся двуокись углерода растворяется в электролите, вследствие чего происходит изменения его рН, пропорциональное концентрации L-глутаминовой кислоты. Изменения рН регистрируют с помощью самопишущего потенциометра и цифрового вапэтметра. L-Глутаминовую кислоту определяют по кешибровочному графику, показываюдему зависимость изменений рН электролита от концентрации L-глутаминовой кислоты. После анализа испытуемый раствор отфильтровывают, промывают 3x2 мл 0,05 М буферным раствором рН 3,8, содержащим S. пиридоксальфосфат и 0,05 М NaC, и анализируют другой образец, используя тот же ферментный препарат. Концентрацию (С)L-глутаминовой кислоты определяют по калибровочному графику или рассчитывгиот по формуле, полученной преобразованием уравнения калибровочной прямой. Коэффициенты уравнения калибровочной прямей) получены обработкой метсщом наименьших квадратов данных зависимости Д рН от Cog С растворов L-глутаминовой кислоты с известной концентрацией (коэффициент корреляции 0,9997). Уравнение кашибровочной прямой рН-3,239-0,914 eogf С. Концентрация L-глутаминовой.кисло- Э,2Ъ9-йрН ты (моль/л) С:Ю Коэффициент вариации метода v-2,3%. Производительность 10-12 образцов/час. В таблице приведены сравнительные технические данные по известному и предлагаемому способу.

Точность, % (мг%) Избирательность Ан LДлительность опредеОтления, мин Предел обнаружения L-глутаминовой кислоты , мг Объем пробы, мл 6,0(0,2-10) 1,7(0,4-10) Ансшизируется только ализируется только L-глутаминовая кислота глутаминовая кислотаОтклик 1-3 (Весь ансшиэ 5-6) клик 15-20

Из приведенных данных следует, что предлагаемый метод значительно превосходит известный по быстроте анализ а уступает только по пределу обнаружения. Поскольку имеется практическая потребность в экспресс-анализе L-глутаминовой кислоты в микробиологической и химико-фармацевтической промЕли ленности, где приходится иметь дело с концентрациями порядка 0,1-3%, меньший предел обнаружения не является недостатком. Предлагаемый способ позволяет сразу анализировать более концентрированные растворы (до 1,5%) без и-х разбавления, в то время, как по изаестному способу нельзя определять L-глутаминовую кислоту в раствоpax с концентрацией более 0,01%.

При определении концентрации L-глутаминовой кислоты по известному способу расход фермента составляет в среднем 20 Е на анализ. В предлагаемом способе исходное количество иммобилизованного феЕ 1ента (260 Е) может быть исполь,зовано для проведения минимум 1000 анализо в.

Кроме того, способ может быть осуществлен при использовании обычного рН-электрода.

Формула изобретения

Способ определения L-глутаминовой кислоты путем обработки анализируемой пробы зняимсм.на основе L-глутаматдекарбоксилазы с последуюпц1М потенциометрическим измерением выделяющейся двуокиси углерода, о тличающийся тем, что ci целью упрощения способа, в качестве знзима используют Ь-глутаматдекарбоксилазу, иктобилизованную на силохроме содержащем брсмацетильные .

,Источни1си информации, принятые во внимание при зксперт нэе

2.Ahn B.K. et al Д enzime alecr trode for the determination of Zgeutaunic acid. Bioelectrochem. Bipenerg., 1975, 2, p.142-153 (прототип) .