Способ получения -аминокислот Советский патент 1978 года по МПК C07C101/02 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ

занную с силакизированным носителем через симм- триазиновый цикл.

Предлагаемый способ получения L --аминокислот заключается в следующем: катализатор с ацилазной активностью,. приготовленный силанизированием силохрома или силикагеля- If -аминопропилтриэтоксисиланом и присоединением аминоацилазы через производное .дихлор-симм-триазина, например активно го красителя ярко-голубого КХ или ярко-оранжевого, хранящегося при в растворе К -ацетиламинокислотн, отфильтровывают, промывают 0,1 М фосфатным буфером с рН 7,2 и еще влажный помещают в сосуд для проведения реакции.

Из предназначенного для превращения количества рацемической К -aциJJаминокислоты готовят водный раствор, рН которого устанавливают концентриров.анным водным аммиаком на 7-8,что-бы концентрация исходной N-ацилааминокислоты была от 0,5 до 1,0 М,и вводят в сосуд с катализатором.

Реакционную смесь вьадёрживают при 37-40°С, изредка перемешивая до завершения реакции получения t -аминокислотЫр причем молярная концентрация образующейся L -аминокислоты достигает половины концентрации исходной рацемической N-ациламинокислоты.

Отфильтровывают катализатор от реакционной смеси, промывают 0,1 М фосфатньм буфером с рН 7,2, после чего его можно использовать повторно; такое использование без снижения ферментативной активности катализатора мож:но повторять не менее 10 раз. Раствор получаемой реакционной смеси концентрируют в вакууме при О-50°С, образующуюся L -аминокислоту выделяют извест ными приемами..

Повышенная устойчивость ковалентно связанного фермента по сравнению с адсорбированным позволяет работать с более концентрированными растворами субстратов и увеличить кратность использования ковалентно иммобилизованной аминоацилазы, тем самым повысив выход целевого продукта примерно вдво

Пример 1. 20 г силохрома С-80 (фракция 0,1-0,16 мм), 6 мл Г -амино- пропилтриэтоксисилана и 200 мл абсолютного этанола кипятят при перемешивании 30 ч. Силанизированный силохром отфильтровывак)т, промывают 1 л абсолютного этанола. Продукт .сушат сначала на воздухе в течение 12 ч, потом 1 ч над пятиокисью фосфора в вакууме { 5 мм рт.ст.) при 180-190 С.

Количество аминогрупп 600 мкмоль/ носителя.

4 г силанизированного силохрома см Ш18ают с раствором 0,15 г активного красите ярко-голубого КХ в 60 мл диметилформо1мида и оставляют на 12 ч

при комнатной температуре. Продукт отфильтровывают, промывают 30 мл диметиформамида и сушат в вакуум-эксикаторе

К 1 г активированного носителя прибавляют 1 мл экстра1кта ацетонового порошка свиных почек в 0,1 н. фосфатном буфере (рН 7,2) с общей ацилазной активностью 2000 мкмоль/час L -аланина и 4 мл 1 М N-ацетил-DL-аланина, выдерживают 10 мин при комнатнойтемпературе. Иммобилизованную аминоацилазу отфильтровывают, промывают дважды 20 мл 1 М раствора хлористого натрия, 20 мл 0,1 М фосфатного буфера ( рН 7,2).

получают катализатор с общей ацилазой активностью IQOO мкмоль/час L аланина.

Полученную иммобилизованную а «шноацилазу хранят в растворе N -ацетил- аланина при 4-9°С.

Пример 2. 2 г катализатора с ацилазной активностью 1000 мкмоль/час L -аланина, полученного согласно методике примера 1, загружают в колбу с 100 МП 1 М раствора рацемического

N -ацетилаланина, рН которого устанавливают концентрированным аМмиаком на 8,0,и выдерживают в термостате при 37-40 С в течение 24 ч. После окончания реакции катализатор отфильтровывают., промывают 0,1 М фосфатным буфером с рН 7,2 и использутрт вторично. Полученный pacTiop. обрабатывают активированным углем, упаривают в вакууме до сиропа при 45С. После охлаждения до комнатной температуры добавляют: 100 мл этанола и останавливает на 16 ч при для кристаллизации. Кристаллы L.-аланина отфильтровывают промывают спиртом и высушивают при до постоянного веса. Выход L-аланина 3,9 г (87,5%).

«1М.2( Бн. соляная кислота).

Вычислено,%: С 40,44; Н 7,92; N 15,72.

Найдено,%: С 40,49; Н 8,04; N15,74

Пример 3. Гидролиз N-ацетилоШанина осуществляют, как в примере 1, с многократным введением в процессе катали затора, использованного в примере 2 (2 г катализатора с ацилазной активностью 1000 мклюль/час Ь-аланина),.

Катализатор в процессе гидролиза используют 9 раз без снижения адилазной активности.

Общий выход L -аланина 39 г на 10 процессов.

Выход L-аланина на 1 г катгшизатора 19,5 г.

. Пример 4, 2 г катализатора с аци лазной активностью 1200 мкмоль/час L. н«)етион1яна загружают в колбу с 100 мл 1 М раствора рацемического Н ацетилметионина, рН которого устанав-i

ливают концентрированнЕлм аммиаком на 8,0, и .выдерживают в термостате .при 37-40°С в, течение 21 ч. После окончания реакции катализатор отфильтровывают , промывают 0,1 М фосфатным буфером с рН 7,2,используют вторично. Полученный раствор обрабатывают актнвированньгк5 .углем, упаривают в вакууме до сиропа при 45°С.После охлаждения до комнатной температуры добавляют 100 мл этанола и оставляют.на 16 ч при 4е для кристаллизации. Кристаллы L -метионина отфильтровывают, промывают сдиртом и сушат при SOC до постоянного веса,

Выход Ь -метионина. б, 54 г (88%).

Л -1-22. (, 5-2,0; 5н . соляная кислота) .

Вычислено,%:С 40,25; Н 7 , 43; Н9,39

Найдено, в %: с 40,16; Н 7,51; N 9,62.

Пример 5. Гидролиз К -ацетилметионина осуществляют по методике приме, ра 4 с многократным введе.ием в процесс катализатора, использованного в примере 4 (2 г катализатора с ацилазной активностью 1200 мкмоль/час L- иетионина).

Каташизатор в процессе гидролиза используют девятикратно без снижения ацилазной активности.

Обсаий выход L -метионина 65,4 г за 10 процессов. Выход L-метионина на Ч г катализатора 32,7 г.

Пример 6. 2 г катализатора с ацитазной активностью 940 мкмоль/час . -серина загружают в колбу с 100 мл 1М раствора рацемического L-ацетилсерина, рН которого устанавливают кон центрированным агфшаком на 8,0, и выдерживают в термостате при 30-4О С в течение 27 ч. После окончания реакции катализатор отфильтровывают, промывают 0,1 М фосфатным буфером с . рЯ 7,2 и используют вторично. Полученный раствор обрабатывают актйвированным углем, упаривс гот в .вакууме до сиропа прк.45С. После охлаж.г енип до комнатной тем.пературы добавляют 100мл этанола и оставляют на It5 ч при для кристаллизации. Крис- . таллы L-серина отфильтровывают, проNWpaioT спиртом и высуижвают при до постоянного веса.го

Выход L-серина 4,6 г (90%) . :с4. +13,5{с-0, 5-2; 5н. .соляная кислота)

Вычислено, %; С 34,29 ;Н б, 71; МП, 3

Найдено,: С 34,40;Н 6,51; N13,71.

Пример 7. Гидролиз Н-ацетилсерИна осуществляют по методике примера б с многократным введением в процесс катализатора, использованного в примере б (2 г катализатора с ацилазной активностью 940 мкмоль/час L-серкна).

Катализатор в процессе гидролиза используют девятикратно без снижения ацилазной активности.

Общий выход I.-серина 46 г за 10 процессов. Выход L-серина на I г катализатора 23 г.

Формула изобретения

Способ получения Ь -аминокислот ; путем асимметрического гидролиза рацемических N-ациламинокислот в присутствии катализатора-иммобилизован-ной аминоаЦилазы,о Тлйчающийс я тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта и упрощения процесса, в качестве катализатораиспользуют аминоацилазу, ковалектно связан ную с силанизкрованным носителем через симм-триазиновый цикл..

Источники информации, принятые во внимание при Экспертизе

1 . патент ФРГ № 2105009,кл.12а.б/01 15,11.. 73. . . 2.Патент Англии 1072876,, кл. G 2С, 21.06.76.

3.Авторское свидетельство СССР № 523892, кл.С О7 С 1Q1/02, 1976.