Способ определения е-розеткообразующих клеток Советский патент 1981 года по МПК A61B10/00 

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ Е-РОЗЕТКООБРАЗУЮЩИХ КЛЕТСЖ

Изобретение относится к медицине, s именно к иммунологии. Известен способ.определения Е-розегкообразующих клеток Е-РСЖ) путем смешения суспензий эритроцитов барана и ли фоцитов с последующим инкубированием смеси и подрчетом розеток til Однако известный способ не обеспечивает точного определения Е-РОК йз-за нежелательных изменений поверхностн эритрсщитов барана фиксатором - неспеЦифического прилипания фиксированных эритроцитов барана к клеткам крови человека и возможного обнажения в мембране бараньих эритроцитов скрытых антигенов, к которым имеются рецепторы/у лимфоцитов человека. Цель изобретения - повышение точности способа. Цель достигается тем, что способ определения Е-розеткообразующих клеток осуществляют путем смешения суспензий эритроцитов барана и лимфоцитов с после дующим инкубированием смеси и подсчето розеток, эритрмиить перед смешенвем обрабатьюают ааетальдегидом при конц(Ш1трации эритроцитов 9,О±1,О% и ацетальдегида 7,2±ОД% при рН 7,О-7,2 и 2О-25°С 22-24 ч. Способ осуществляют следующим образом. Фиксацию эритроцитов осуществляют смешением равных объемов 18% (по плотному осадау) взвеск отмытых О,85%-вь1м раствором NaCC бараньих эритротигов и 7,2% раствора ацетальдегида, содержащего О,85%-ную NaC .(рН раствора ацетальдегида предварительно доводят до 7,О7,2 с помощью аОН), Смесь выдерживают 22-24 ч при 2О-25°С при периодическом перемешид ании. Затем эритр(М1Иты трижды отмывают О,85%-ным раствором N аС при центрифугировании ( 3 мин, 3 тыс. об/мин). Отмытые фиксированные эритроциты суспендируют в 0,85%-ном растворе NaC8 до 1О%-«ой концентрации (по плотному осадку). Клеточную концентрацию взвеси определяют подсчетом в камере Горяева. Препарат фиксированных эригроцигов барана хранят при 3-5 С без консерванта. Фиксированные эритроциты сохраняют пригодность для определения Е-РОК в течение не менее 1 года (срок наблюдения). П р н м 6 р 1. Вьшеление лимфоцитов человека производят в растворе, составленном нз 10 мл 1О%-ного раствора желатина, содержащего 0,85%-ную NaCC , и 0,6 мл раствора гепарина (без консерванта) с активностью 5000 МЕ/мл. В 0,5 мл гфиготовленного раствора берут из вены самотеком 1О мл . Кровь отстаивают 30 мин при 2О-25 С. Из пробы крови лимфоциты выделяют в фиколл -верографиновом градиенте следующего состава: 7 объемов 36,7% верографина и 16 объемов 9% водного раствора фнкол- ла, плотность градиента равна 1,О77. На 1 объем градиента в узкой центрифужной пробирке наслаивают 2 объема нааосаака, образовавшегося над слоем эритроцитов пр отстаивании крови. Пробу центрифугируют 35 мин при 2О-25 , 14ОО об/мин. Лимфоциты отсасывают из границы раздела жидкостей, дважды отмывают средой 199 5 мин при 20-25°С, 1200 об/мин. Концентрацию лимфоцитов определяют подсчетом в камере Горяева. Взвесь лимфоцитов разводят средой 199 до конечной концентрации 2-10 клеток/мл. Дважды отмытые О,85%-ным раствором NaCE и один раз средой 199 фиксированные эритроциты суспендируют в среде 199 до концентрации 6-1О Ю клетсяс/мл, исходя из результатов определения концентрации: эритроцитов в исходной 1О%-ной взвеси фиксированнъгх клеток 0,5 мл полученной взвеси лимфоцитов ос торожно наливают на дно ксжической центрифужной пробирки, к ней добавляют О,5 мл приготовленной взвеси фиксированнъ1х эритроцитов барана. Содержимое осто рожно смешивают и оставляют 2О мин при 37°С. Пробу центрифугируют 5 мин при 5ОО об/мин при 20-25°С и оставляют на ночь при 3-5°С. Затем содержимое пробирки перемешивают осторожным вращением в вертикальном положении 30 с. Пробу помещают в камеру Гориева и производят подсчет Е-РОК, принимая за нихлимфоциты с не менее чем тремя плотно прикрепившимися эритроцитами. Вычисляют на основе не менее трех параллельнък определений Процентное содержание в общем количестве лимфоцитов. Для получения сравнительных данных в контроле вместо фиксированнъ1Х эрит894 оцитов применяют в тех же условиях нативные эритроциты барана, вьшеленные из свежей крови, собранной в раствор Олсвера. Полученные следующие результаты при определении Е-РОК (%) человека с эритроцитами: нативными - 32,8± 1,6; 38,2tl,O; 42,2±О,4; фиксированныи 31,811,1; 34,,9; 34,8tO,5. Приведенные данные псжазьшают, что в реакции розеткообразовання с фиксированными эритроцитами барана вьщеляюгся менее колеблющиеся показатели содержания Е-РОК по сравнению с применением в реакции нативных эритроцигов. При этом средние количества нативных и фиксированных эритроцитов, приходящихся на одну Е-РОК, практически одинаковы. Существенно сокращается время на проведение анализа в результате того, что концентрация фиксированных эритроцитов определяется подсчетом однк раз для больщой партии фиксированных эритроцитов. П р и м е р 2. Выделение лимфоцитов осуществляют так же, как в примере 1. С каждой из двух проб лимфоцитов человека, въшеленных соответственно из крови двух доноров по способу, описанному в примере 1, четьфехкратно определяют содержание Е-РОК с каждой из грех партий нативнътх эритроцитов и с одним препаратом фиксированных по сфеддагаемому способу эритроцитов барана. Результаты анализа полученнъгх данных сведены в таблицу. Как видно, содержание Е-РОК значительно колеблется для одной и той же пробы лимфоцитов в зависимости от осо|бенностей нативнъпс эритроцитов. Сравнение кгоффициентов вариации, вычисленных для нагивных эритроцитов суммарно и для фиксированных эритроцитов, показало существенное (Р О,О5) уменьшение степени варьирования результатов определения Е-РОК при использовании фиксированных эритроцитов. Пример 3. в параллельном опыте проверяют не изменяется ли специфичность выявления Е-РОК при использовании фиксированных по предлагаемому способу эритроцитов барана в сравнении с нативными. Опыт ставят следующим образом, Две одинаковые пробы лимфоцитов, выделенных по методике примера 1, истощают бараньими эритроцитами: одну - на- тивными, другую - фиксированными; количество эритрсйхитов, использованных для истощения, одинаковое - 10О млн. эритроцитов на 20 млн. лимфоцитов. В надо- садках обеих проб в реакции розеткообразования с нативными эригроцигами барана по тому же способу определяют коПйчесгво Е-РОК. Подучают следующие результаты: копнчесТБо Е-РОК после истощения натиЕными эритроцитами снижается с 32,8±lt6 до 4,1+0,7; количество Е-РОК после истощения фиксированным эритрсвдитами снижается с 31,8±1,1 до 3,4±0,2,

Эти результаты показьюают, что Е-РОК человека одинаково реагируют с нативными и фшссированными эритроцитами.

Г)оверка специфичности выявления Е-РОК с фиксированными эритрсшитами

Формула изобретения

Способ офедепения Е-розеткообразуюШИХ клеток путем смешения суспензийэритрсщитов барана и лимфспитов с последующим инкубированием смеси и подсчетом розеток, отличающийся тем, что, с целью повьпценйя точности (Способа, эритроциты перед смешением обпутем микроскопии мазка, окрашенного по Браше, подтверждает специфичность выявления Е-РОК а реакции с фнкснрованными эритроцитами.

Предложенный способ фвксаавв эритроцитов барана обеспечивает их стабилкэацию и пригодность для офеделенкя Н-РОК человека. При этом не изменяется специ фичность вьоюленвя Е-РОК. Способ обеспечивает снижение вариабепьносгв ре:эуяьтатов определения Е-РОК человека вэ-эа особенностей различных партвй нагнвньос бараньих эритроцнтов в их нестойкосгв, а также экономию еменн на подсчет коа« центрации эритроавгс в каждЫ партвв.

рабатьшают аоетальаегядсмм Щ)и ковцевгрвции эрвтропвтов 9,Otl,O% в апегальдегида 7,2+рД% при рН 7,О-7,2 в 2О25 с 22-24 ч.

Источники информации, принятые во внимание прв экспертвзе

1. Фрвмепь X. Иммунологвческве методы. М., Мир, 1979, с. 5ОЗ.