Способ определения активности гормона тимуса Советский патент 1981 года по МПК A61K38/22 

1

Изобретение относится к химикофармацевтической промышленности и касается определения активности лекарственных препаратов, которые могут найти применение в медицинской практике.

Известен способ определения активности гормона тимуса путем проведения реакции розеткообразонания лимфоцитов под влиянием гормона тимуса с последующим инкубированием смеси и подсчетам розеткообразующих клеток .LlJ.

Однако известный способ обладает недостаточно высокой чувствительностью.

Цель изобретения - повьвпение чувствительности способа.

Указанная цель достигается тем, что способ определения активности гормона тимуса осуществляют путем проведения реакции розеткообразования лимфоцитов под влиянием гормона тимуса с последуюа1им инкубированием смеСИ и подсчетом розеткообразующих клеток, для реакции розеткообразования используют лимфоциты тимуса, инкубирование смеси проводят в присутствии теофиллина и по степеш5 ингибирования розеткообразования определяют активность гормона тимуса.

Способ осуществляют следующим образом.

10

Определение активности гормона тимуса складывается из следуюпих этапов работы: приготовление суспензии клеток тимуса, приготовление эритроцитарной суспензии, постановISка реакции и ее учет.

Тимус NEbnneA любого пола возрастом 1-4 мес. измельчают на холоду в среде для культур тканей (например, среде 199) любым подходящим способом

20 и клеточную взвесь фильтруют через тонкую стальную или капроновую сеточку.Затем клетки дважды отмывают средой, центрифугируя при 400 д в течение 5-6 мин и готовят взвесь так, чтобы в Г мл среды содержалось 30x10 лимфоцитов. Для реакции используют эритроциты барана, которые хранят в растворе Алсевера и непосредственно перед ее постановкой трижды промывают физиологическим раствором, центрифугируя при 500 д в течение 6-7 мин . Отмытые эритроциты суспензируют в культураль ной среде в концентрации 250-300 млн клеток в 1 мл. В центрифужные конические пробир ки вносят по 0,1 суспензии тимически клеток и по 0,1 мл раствора гормона тимуса в различных концентрациях, причем одну и ту же концентрацию.пр парата как мигимум в 4 пробирки. В контрольные пробирки вместо гормона вносят по О,1 мл среды. Контрольные и опытные пробы ставят в термостат на и суспензии клеток инкубируют в нем 30 мин. После этого в полов ну равноценных проб добавляют по 0,1 мл раствора теофиллина на среде, а в другую половину проб только по 0,1 мл среды. Инкубацию в термостате продолжают еще в течение 2 ч. Затем пробы вынимают из тер мостата, в каждую из них добавляют п 0,1 мл приготовленной суспензии эритроцитов. Клетки перемешивают и центрифугируют при 200 д 5 мин.Клеточные осадки вместе с надосадочной жидкостью помещают в,холодильник на 1 ч при +4°С. Для подсчета роэеткообразующих клеток осадки ресуспендируют на верА4тикальном ротаторе при скорости вращения барабана 10 об/мин, в сечение 5 мин. Затем пипеткой отбирают каплю суспензии и переносят в счетную камеру, например, камеру Горяева, и подсчитывают число розеткообразуюших клеток во всей камере под микроскопом. Число розеткообразующих клеток РОК представляют на 10 лимфоцитов. Сравнивают количество РОК в пробах с и без теофиллина и подсчитывают ингибирующее действие теофиллина в процентах. За единицу активности гормона тимуса принимают то его количество (в весовых единицах), которое обеспечивает ингибирование образования РОК теофиллином на 50%. В таблице приведены результаты оценки активности тимозина (фракция V) . Как видно из таблицы, по предлагаемому способу можно определить 0,05 мкг тимозина в пробе, тогда как чувствительность известного способа на порядок ниже. В соответствии с этим активность тимозина, определенная предлагаемым способом, составляет 20000 Ед, тогда как по известному методу - 2000 Ед на 1 мг препарата. Предлагаемый способ обладает большей чувствительностью, использование способа обеспечит возможность оперативного контроля его качества на всех стадиях производства и позволит стандартизировать выпускаемые серии препарата. 7 85883 Формула изобретения Способ определения активности гормона тимуса путем проведения реакции розеткообразования лимфоцитовj под влиянием гормона тимуса с последующим инкубированием смеси и подсчетом розегкообразующих клеток, отличающийся тем, что. с целью повышения чувствительности Q способа, для реакции розеткообразования используют лимфоциты тимуса, инкубирование смеси проводят в при48сутствни теоф1ии1ина и по сгепекн ингибироват1Я розеткообрачоваиия определяют активность гормона тиму-са. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе . Bach. J.D,, Dardenne М., et al1 . Appearance of Т-СМ Markers in Bone Marrow RQsette-3ormiпа cells after incubation with thymosln, a Thymic Hormone, Proceeding Nature Academia Science, USA, 1971,68,11. р, 27-34-2738,