Способ получения бактериальной биомассы Советский патент 1984 года по МПК C12N1/20 C12R1/07 

О Од

сс сх. Изобретение относится к получению бактериальной биомассы путем выращивания тионовых бактерий, в частности штамма Tbiobaciflus thtooxidans 58R, применяемого в качестве источника ферментов при синтезе биологически активного вещества 0-рибулозо-1,5дифосфата. Получение О-рибулозо-},5-дифосфата из 0-рибозо-5-фосфата и аденозин-5-трифосфата (АТФ) протекает в две стадии с участием ферментйв рибозофосфатизомеразы (D-рибозо-5-фосфат-кетол-изомераза, КФ 5.3.1.6) и |фосфорибулокиназы (АТФ: О-рибулозо-5-фосфат-1-фосфатхртнефераэа, КФ 2.7.1.19). В клетках тионовых бактерий ThiobacJNus fhidoxidans 58 R1 активности зказанных ферме тов достаточно высоки и бесклеточный зкстракт бактерий применять для проведе ния синтеза в нромышлениом масштабе. Кроме того в клетках названных тионовых бактерий отсутствуют фосфатазы, которые гидро лизуют- эфиры фосфорной кислоты. Тионовые бактерии ThicAacillus fhrooxidan 58 R являются автотрофными организмами, к торые используют в качестве источника знергин срединегейя серы, а все органические вещества синтезир тот из углекислого газа, при сз тствующего в воздзосе аэрадаи. Известен способ получеиия бактериальной биомассы путем вырашшания тионовых бакт .рий грзшпы ThiobaclHus на среде, содержащей микроэлемецтЕд. Применение в способе среды выращявания тионовых бактерий с содержанием растворенных в дистиллирован ной воде микроэлементов в следующих концентрациях, мг/л: NaCf 300; Hid 0,021; CuS045H20 0,08; ZnSO4 7Н20 0,106; НэВОз 0,6; Al2(S04)3 0,123; WiClj6HjO 0,11, CoS047H2O 0,109; TiCl4 0.06; KBr 0,03; KJ 0,03; MgCta4H2O 140, MnSO4 X jfTHjO 0,629; SnClj 2H2O 0,036; FeSO4 х7НгО 0,3 не обеспеадгоает достаточно высокой урожайност биомассы культуры И1. Наиболее близким к предлагаемому по технической суииостн и достигаемому реэуль Лагу является способ получения бактеряальшой биомассы путем вьфащивания культуры ThiobaciHus tbJooxldansi58 R на шпахелыктй среде, содержащей в 1 л водопроводной воды, г: «а282Оз«5Н2О 5; СаМРО4 5; МИ4а 0,5; МдСЬбНзО 0,1; KHjP04 3.0 в аэробных условиях, процесс ведут в периодической культуре с непрерьюной аэрацией (обычно - с интенсивностью 2 в 20-литровых бутылях в течение 4-5 сут при комнатной температуре). Клетки бгцстернй вьщеляют из кулыурапыюй яшдкости цеи1фифу гированием. Выход сырой бяомассы 0,5-0,8 г с 10 л культуральной жидкосш f2j. Недостатком известного способа является низкая урожайность бактериальной культуры, т.е. недостаточно высокий выход биомассы. Цель изобретения - повышение выхода биомассы Поставленная цель достигается тем, что согласно способу аблученкя бактериальной биомассы путем выращивания культуры Thiobacillus thiooxidans 58 R на питательной среде, . включающей N3282Оз 5Н2О; КН2РО4, NH4C1 и MgClj 6H2O, в аэробных условиях, процесс ведут в проточном режиме при скорости разбавления 0,1-0,15 на среде, дополнительно содержащей CaCt2 4Н2 О, Нз ВОз, jFeCl3 6Н2О. ZnSO4 7Н2 О. MnSO4 4Н2 О. ;CoCl2, (NH4)2 Мо04, CuS04 5Н2О, Na2 НРО4 Х12Н2О, при следующем соотношении ингредиентов, (г/л воды): N338203-5 0 КН2Р04 №2НР0412Н20 0,8-1.2 0,4-0,6 NH4CI 0,09-0,1 MgCl26H2O (19-21) -10 CaCf2- 4Н2О (2,5-3,0) 10 РеС1з 6Н2О (0,70-0,75) 1СГZnS047H20(0,5-0,6) . MnS04-4HiO (0,25-0,35)- 10 НзВОз NH4)2MoO4 (0,2-0,3). 10 (0,13-0,17)40 CuSO45H2O (0,09-0,11)10 CoCl2 и процесс ведут при аэрации воздухом, обогащенным CQ2 до концентрации 6-8%. Способ осуществляется следующим образом. Выращивание проводится в ферментере в проточном режиме с иепрерьшной аэрацией при рН 3,2 в среде указанного состава. Продувание воздуха, обогащенного углекислым газом (не более чем 0%), проводят со ско.ростью, обеспечивающей концентрацию кислорода в кyльтJpaлfeнoй жшисости б пределах 10-20% от насыщею1я, рК культуральной жидкости поддерживают автоматически при помощи 1 М { 1створа карбоната калия, равным 3,2. Темпе т а выкашивания бакте{жй 28°С. Скорость раэб авления в проточном режиме, т.е. соотнсмиеиие потока питатецьной среды в час и общего обьема культуральной жидасости в ферментере, находится 8 наделах 0,1-0,15. Скорость перемешивания 100-400 об/мин. Интенсивный рост бактерий характеризуется концентрацией кислорода 10-20% от насыщения, постоянным расходом раствора карбоната калия и оптической плотностью кульчрм 0,38-0,41 при 540 нм. Биомассу отделяют от культуральной жидкости центрис ггированием. Выход сыро бяо-: массы 7-8 г на 10 л культуральной жидкости. Пример. Культуру тионовых бактерий Thiobacillus thiooxidans 58 R выращивают в колбах на 2 л в жидкой среде следующего состава (среда Эмото): laгS2Oз xSHiO 5 г; СаНРО4 5 г; КНзГО 3 г; NHflCl 0,5 г; МдС бНгО 0,1 г. водаВопопроводаая 1 л. Объем среды в колбе 1,5 л. Время культивирования при постоянной аэрации при комнатной температуре 3 сут. Эта культура используется в качестве материала для засева ферментера. П§именя от ферментер Ультроферм 1601 (JЖБ, Швеция) на 5 л, снабженный системами поддерживания тйштературы и рН среды,. системой подачи среды, аэрации и перемеши вания и электродом измерения концентрации кислорода. Ферментер наполняют 3 л среды в дастиплированной воде, содержащей NajSjOj .SHjO 10 г/л; КН2ГО4 2 г/л; NajHTO412HjO 1 г/л; 0,5 г/л; раствор микроэлементов 1 мл/л. Такую же среду применяют и в проточном режиме. Раствор микроэлементов содержит в 100 мл дистиллированной воды CaCl24H2O 2 г; НзВОз 30 мг; MgCl26H2O 10 г, feCls )с6Н2О 270 мг, ZnSO4 7H2O 72 мг; МпЗО 4Н2О 55 мг; СоС 10 мг, (NH4)2MoO4 25 мг; CuSO45H2O 0,15 мг. Ферментер стерилизуют при в течение 20 мин. В отдельной колбе стеркпиззпот 1 М pactBop карбоната калия, который титрантом для поддерживания рН в ферментере. Ферментер засевают через систему подачи среш 1л посевного материала из 2-литровой КОЛ&4. Температура в ферментере - . После засева яэраа ю и перемешива мне поддеряошают на лшнимальном уровне концентрация кислорода до 60% от насьпцения и скорость перемешивашя 50 об/мин, ч Начш1о интенсивного роста бакте1 гй (через сутки) характеризуется понижением рН. и ко центрации кислорода и повышением оптической плотности п{Ж 540 нм. При понижении рН культуры до 3,2 вклю чают автоматическую систе подтитровки ари помощи 1 М раствора карбоната калия, поддерживая величину рН постоянной, и подачу свежей среды со скоростью 50 мл/ч. 384 . При понижении концентрации кислорода повышают интенсивность аэрации до 10 л/мия, повышая в то же время содержание СО2 в продуваемом воздухе до 6-8%. Скорость перемешивания находится в пределах 100- 400 об/мин. При повышении оптической плот ности культуры бактерий при 540 им до 0,38 (оптическая плотность определяется методом отбора проб на спектрофотометре Спектромом (Венгрия) скорость потока среды постепенно увеличивают от 50 до 600 мл/ч. Ийтенсивный рост бактерий в проточных условиях характеризуется постоянным ртсходом раствора карбоната калия для поддерживання рН культуры, концентрацией кислорода в пределах 10-20% от насыщения и оптической плотностью прн 540 им 0,38-0,42. Клетки бакте|Я1й отделяют из культуральной жидкости центрифугированием на цеетрифуге К-70 (Янецки, ГДР) при 5000 о 5/мин. Выход сырок биомассы составляет 16 г из 20 л культуральной жидасостн. 1 Исвользование изобретения обеспечивает повышею1е урожайности бактериальной культуры до 15 раз, а суммарная активность ферментов, превращающих 0-рибозо-5-фосфат в присутствии АТФ в 0-{жбулозо-1,5-дифосфат увелн агаается до 20 раз по сраш1ению с прототипом. Достигается хорошая воспроизводимость при вырацщвашш бактерий. Ферментер может работать непрерывно по меньшей мере 1 мес. Полученная за это время масс бактерш составляет ЭОС г. В соответствии с регламентом производства 0-рибулозо-1 -дифосфата ддя гатучеюи I г О-рибул« эо-1,5-дифосфата требуется фермент1ш препарат из 3,6 г сырой бактериалыюй массы. Объем производ„Ba О-рибулозо-М-дифосфата составляет приблизительно 15 г в год. Необходимая для этой цели бактериальная масса получает при использовании предлагаемого способа из 70 л культуральной жидасости, а в случае пе жодического культивирования или выращнвания бактерий по прототипу требуется 900 л культуральной жидкости. Соответственно уменьшается объем работы, связанный с изготовлением питательной среды и отделением бактер} из культуральной жидкости при центртфугировашш.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЫ ИАЛЬНОЙ БИЮМАССЫ путем выращивания культу-. jH iThtobacillusThiooxidans58R иа питательной среде, включающей ,; 5Н2О, КНзРО, NH|CI и , в аэробных условиях, о тличаюшиися тем, что, с целью повышения выхода биомассы, процесс ведут в проточном режиме при сморости разбавления 0,1-0,15 на среде, даяюлнительно сод шшщей , HjBOU, FeCb л6Н,р, . 7HjO, , СоОй.. ( Си$Оц,. N82HPC|y 12H{p, «при следующем соотоошенш ингредвентов, г/л вошл: 8-12 Ма2&зОз-5Н,0 1,8-2,2 КМ,ТО4 0,8-1,2 Na2HPO4 12HiO 0,4-0,6 NN4 0,09-0,1 МдаабНаО (19-21).10, CeClj iO . -3 (2,5-3,0). 10-FeCls- 6HjO (0,70-,75) «10 ZnSO47HjO (0,5-0,6)- lO- MnS044H2O S (0,)-If НэВОз (0,2-ОЛ- lO, (NH4)lMoO4 (0,13-0,17) «lO GuSO4«5H2O