Способ получения гиалуронидазы Советский патент 1978 года по МПК C07G7/02 

Изобретение относится к способу получения ферментных препаратов, в частности к способу получения гиалуронидазы (КФ 3,2.1.35)-фермента, регулирующего катаболизм гликозамингпиканов в живом организме. Этот фермент находит широкое применение в животноводстве, рыбном хозяйстве, кожевенно-меховой промышлен ности, а также в медицине и в лабораторной практике. Гиалуронидаза содержится во многих тканях и жидкостях животных. Наиболее богатыми источниками гиалуронидазы животного происхождения являются тестикулы и сперма ij . Известно несколько способов выделения гиалуронидазы из тео тикул крупного рогатого скота ij . Все они основаны на том, что экстракцию тка ни проводят в кислой среде (разбавленная уксусная кислота или ее смесь с разбавленной соляной кислотой) с последующим фракционированием сульфатом аммония или органическими растворителями и хроматографией. Известен, в частности, способ получения гиалуронидазы из семенников крупного рогатого скота 2J . Способ заключается в следующем: все операции ведут при О - 5 С. Замороженные сухим льдом ткани тести кул гомогенизируют в равном количестве воды. К суспензии добавляют ледяную уксусную кислоту до рН 4,0. Оставляют при температуре 4 - 5 С на 15ч. Центрифугируют. Осадок реэкстрагируют водой. Недосадочные фракции объединяют. Фильтруют. Поводят рН до 4,5. Побавпяют сульфат аммония до 1О-12%-ного насыщения. Осадок удаляют центрифугированием. Палее добавляют сульфат аммония до ЗО-4О%-ного насыщения. Белок, содержащий ферментативную активность, собирают центрифугированием и диализуют против холодной проточной воды в течение 27 ч. Огдиализованный раствор лиофилизуют. Выход 2,5 г из 1 кг исходного материала. Активность 54,5 МЕ/мг. Однако этот способ получения гиалуронидазы имеет ряд недостатков. Так, ферJ63мент получают с низким выходом (2,5 г из 1 кг сырья), так как в качестве исходного сырья используют семенники крупного рогатого скота, из которых получают малоконцентрированные экстракты; щэичем имеются потери фермента в процессе экстракции, где при рН 4,0 часть фермента осаждается вместе с баластными веществами. Часть фермента теряется при осаждении сульфатом аммония 10-12%-ного насыщения. Часть активности теряется в процессе фильтрования. Кроме того, полученный препарат фермента характеризуется сравнительно низкой активностью (54,5 МЕ/мг). Целью изобретения является повышение активности и выхода целевого продукта. Указанная цель достигается за счет того, что в качестве исходного -. сырья используют сперму крупного рогатого скота, забракованную для искусственного осеменения экстракцию проводят не кислым буфером, а раствором хлористого натрия при рН 5,8 - 6,3, поскольку, начиная с рН 5,6 и ниже, наблюдается выпадение осадка, в который вовлекается часть фермента, что приводит к значительной его потере. Фракционирование сульфатом аммония проводят в два этапа, причем 1-ое фракционирование ведут 6О-65%-ным насыщением сульфата аммония, 2-ое фракционирование проводят на стадии после диализа последовательным добавлением сульфата аммония, до 38-45%-кого насыщения и 65-70%-ного насыщения и конечный продукт выделяют известным способом. Из спермы можно получить концентрированные экстракты без дополнительной обработки сырья. Это позволяет выделить фермент с минимальными потерями активности. На первом этапе осаждения 6О-65%-но го насыщения сульфатом аммония получают фракцию, содержащую практически весь фермент, .содержащийся в экстракте и низ комолекулярные примеси. Эта операция позволяет сохранить всю активность фермента без потерь. При помощи диализа освобождаются от ионов сульфата и аммония и части низкомолекулярных примесей. После диализа - насыщением диализата до 38-45% сульфатом аммония-полностью от деляют все баластные белки. Доведением до насыщения сульфата аммония до 65-7О% осаждают гиалуронидазу. Фракционирование в три этапа позволяет выделить весь фермент с высоким выхо дом и активностью. Согласно изобретению описывается спооб получения гиалуронидазы с высоким ыходом и удельной активностью посредсром экстракции раствором хлористого натия с рН 5,,3 спермы крупного рогатого скота, забракованной для искусственого осеменения, затем экстракт подверают фракционированию сульфатом аммония, причем 1-ое фракционирование проводят 60-65%-ным насыщением сульфата аммоия, 2-ое фракционирование проводят на стадии после диализа последовательным обавлением сульфата аммония до 38-45%ого насыщения и 65-70%-ного насыщения и конечный продукт выделяют известным способом. Предпочтительно процесс выделения проводят следующим образом: Сперму оттаивают, разбавляют в пять раз 0,15 М раствором хлористого натрия в дистиллированной воде; рН смеси 5,86.3. Смесь медленно перемешивают в т&чёние 4 ч при температуре 4-5 С, центрифугируют. Добавляют сульфат аммония до 60-65%-ного насыщения. Оставляют при температуре 4-5°С в течение 4 ч. Центрифугируют. Осадок растворяют в дистиллированной воде, диализуют в течение 24 ч против проточной дистиллированной воды. При выпадении осадка в диализате центрифугируют. Добавляют сульфат аммония до 38-45%-ного нас ццения. Оставляют при температуре 4-5 С в течение 2 ч, центрифугируют. В на посадочную жидкость добавляют сульфат аммония до 65-7О%-кого насыщения. Оставляют при температуре 4-5 С в течение 1О ч. Центрифугируют. Осадок растворяют в дистиллированной воде. Диализуют 24 ч против проточной дистиллированной воды. При выпадении осадка в диализате - центрифугируют. Диализат лиофилизуют.. Пример получения гиалуронидазы. К 10О мл оттаенной спермы добавляют 400 мл 0,15 М раствора хлористого нагт рия в дистиллированной воде. Устанавливают рН 6,0. Смесь медленно перемешивают при температуре 4-5 С в течение 4 ч. Центрифугируют. Прибавляют 195 г (6О%) сульфата аммония. Оставляют при темп эатуре 4-5 С в течение 4 ч. Центрифугируют. Осадок растворяют в 7О мл дистиллированной воды. Диализуют в течение 24 ч против проточной дистиллированной воды. Удаляют выпавший осадок центрифугированием.

К 75 мл диализата добавляют 450 мл О,15 М раствора хлористого натрия (концентрация белка 1 мг/мл по Lonrs ) Объем 525 мл. Добавляют 127,6 г сульфата аммония (40%). Оставляют при гемпературе 4-5 С в течение 2 ч. Центрифугируют.

К недостаточной жидкости добавляют 88,1 г сульфата аммония (65%). Оставляют при температуре 4-5 С в течение 10ч. Центрифугируют, Осадок растворяют в 50 мл дистиллированной воды. Пиалязуют 24 ч против проточной дистиллированной воды. Удаляют выпавший осадок цент рифугированием. Диализат - 5О мл лиофилизуют. Выход - 2,5 г, активность 680 МЕУмг.

Формула изобретения

Способ получения гиалуронидазы экс1 ракцией из семенников крупного рогатого

скота и фракционированием сульфатом аммония при температуре О-5 С с последующим диализом и лиофилизацией о т л и ч ающи йся тем, что, с целью повышения активности и выхода целевого продукта, экстракции раствором хлористого натрия при рН 5,8 - 6,3 подвергают спему крупного рогатого скота, забракованную zшя искусственного осеменения, причем 1 фракционирование ведут 6О-65%ным насьццением сульфата аммония, И фракционирование прово/хят на стадии после диализа последовательным добавлением сульфата аммония до Зв-45%-ного насыщения и 65-7О%-ного насыщения.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:

l.,H aEuronidases,Ttie Entvmes ed ,v.5,p.3O7n97-f

2. Патент Великобритании.NO 682933, 1952.