Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения антибиотиков. Целью изобретения является получение антибиотика тилактона. Для получения тилактона используют штамм Streptomyces fradiae NRB 12188 (Agricultural Research Cultur Collectin NBKL). Способ получения тилактона формулыQ . CHfCHj заключается в том, что штамм Stret)tomyces fradiae NRRL 12188 выращивают в питательной среде, содержащей источник углерода, азота и неорганические соли, в аэробных условиях ферментации с последующим выделением целевого продукта и.при не обходимости этерификацией его. В качестве ацилирукяцих средств при получении тилактона применяют ангидриды, хлорангидриды (в сочетании с основанием или другим соедине нием, связывающим кислоту и активны эфиры органических кислот). Ацилиро вание може быть также осуществлено применением смеси органической кислоты и обезвоживающего средства, например N,N -дициклогексилкарбодиимида. Ацилирование может быть также осуществлено энзиматически. Полу ченные ацильные производные могут быть разделены и очищены известными способами. Эти производные могут быть получены известными методами этерификации, например обработкой соединения стехиометрическим количеством (или небольшим избытком) ацилирующего средства, например ангидридом органической кислоты в органическом pac творителе, например пиридине, при 0-24°С в течение 1-24 ч до полного завершения этерификаиии. Полученные эфиры могут быть выделены из реакционной смеси известными способами, например экстракцией, хроматографией и кристаллизацией . К эфирам, имеющим практическое значение, относятся эфиры органичес ких кислот, в том числе алифатическ циклоалифатических,ариловых, аралки ловых, гетероциклических карбоновых сульфоновых и алкоксикарбоновых с 1-18 углеродными атомами, и неорганических кислот, например серной и фосфорной. К числу применяемых эфиров отиосятся эфиры, полученные на основе таких кислот, как муравьиная, уксусная, хлоруксусная, пропионовая, масляная, изовалериановая, глюкуроновая, алкоксикарбоновая, стеариновая., циклопропанкарбоновая, циклогексанкарбоновая, -циклогексилпропионовая, 1-адамантанкарбоновая, бензойная, фенилуксусная, феноксиуксусная, миндальная, 2-тиенилуксусная и алкил-, арил- и аралкилсульфокислоты, которые могут быть заметцены в ароматической части галоидом, нитрогруппой, низшей алкоксигруппой, а также эфиры, полученные на основе таких дикарбоновых кислот, как янтарная, малиновая, фумаровая, малоновая и фталевая. Тилактон получают культивированием штамма Streptomyces fradiae. Штамм Streptomyces fradiae получен химическим мутагенозом штамма Streptomyces fradiae, продуцирующего тилозин. Штамм хранится в коллекции штаммов микроорганизмов Северного регионального исследрвательного центра Agricultural Res earch.North Central Region 1815 North University Strecht Peoria Illionis 61604 под регистрационным номером KRRL 12188. Штамм Streptomyces fradiae растет при 10-4О С. Оптимальное продуцирование тилактона происходит при 28° С. В качестве питательной среды для выращивания Streptomyces fradiae используют различные питательные среды, содержащие в качестве источника углерода такие углеводы, как декстрин, глюкоза, крахмал, зерновую муку и масла, например соевое. В качестве источника азота используют зерновую муку, соевую муку, рыбью муку, амин бкислоты. В питательную среду могут быть введены растворимые соли, сЯ Ьсобные образовывать ионы железа, калия, натрия, магния, кальция аммония, хлор-, карбонат-, сульфат- и нитратионы. Питательная среда может также содержать микроэлементы, необходимые для роста и развития организма.Эти микроэлементы входят в виде примесей в состав других компонентов среды в количестве, необходимом для роста организма. При необходимости добавляют противопенное средство, например полипропиленгликоль с молекулярным весом около 2000. Для получения значительных количеств тилактона проводят аэробное глубинное брожение в цистернах. В небольших количествах тилактон получают в сосуде для выращивания микроорганизмов со встряхиванием. Для выращивания применяют вегетативный инокулят. Вегетативный инокулят
получают засевом небольшого объема питательной среды споровой формой организма или мицелием с получением свежей, активно растущей культуры организма. Вегетативный инокулят затем переносят в резервуар большего размера.
Для вегетативного инокулята применяют ту же среду и при ферментации в больших масштабах, но могут быть использованы и другие питательные среды.
При аэробном глубинном выращивании пропускают стерильный воздух.Для эффективного продуцирования антибиотика процент насыщения воздухом должен быть около 30% или выше при 28С и давлении 1 атм.
Полученный тилактон может быть выделен из среды известными способами (экстрагированием иЛи фильтровэнием ферментативного бульона).
При экстрагировании могут быть использованы различные способы. Для очистки отфильтрованного бульона используют способ, согласно которому бульон экстрагируют без установления определенного рН подходящим растворителем, например, амилацетатом, или петролейным эфиром, концентрированием под вакуумом органической фазы с получением кристаллов или масла. В с лучае получения масла,оно йожет быть очищено адсорбционной хроматографией .
Пример 1. Лиофилизованную таблетку Streptomyces fradiae диспергируют в 1-2 мл стерилизованной воды Часть этого раствора (0,5 мл) используют для инокуляции вегетативной среды (150 мл), имеющей следующий состав, вес.%: настой пропитанного водой зерна 1,0 t экстракт дрожжей 0,5- соевая .крупа 0,5) СаСО 0,3j соевое масло 0,45 и деионизированная вода 97,25.
Или же вегетативную Streptomyces fradiae NRRL 12188, хранящуюся по 1 мл в жидком азоте, быстро оттаивают и применяют для инокуляции вегетативной среды. Йнокулированную вегетат11вную среду инкубируют в колбе Эрленмейера на 500 мл при 48 ч в качалке со скоростью . вращения 300 об/мин. I- .
Полученную инкубированную вегетативную среду в количестве 0,5 мл применяют для инокулирования 7 мл питательной Среды следукядего состава, вес..%: свекольная меласса 2,0j зерновая мука l,5j рыбья мука 0,9j клейковина зерна 0,9; NaC, 0,1) (Nti()jHPO Q,04)CaCOj 0,2, соевое масло 3,0 и деионизированная вода 91,36.
Инокулированную питательную ду инкубируют в сосуде на 50 мл при 6 дней в качалке при 300 об/мин
РЛЯ получения инокулята в больком объеме 60 мл инкубированной вегетативной среды, приготовленной описанным способом, применяют для инокулирования 38 л векетативной среды, роста второй стадии, имеющей следующий сост.эв, вес.%: настой пропитанного водой зерна 2,0 соевая мука 0,5; экстракт дрожжей 0,5; СаСО 0,3 { соевое масло 0,5 лецитин 0,015 ивода 97,185.
Добавлением 50%-ного раствора NaOH рН приводят к значению 8,5.
Вегетативную среду второй стадии инкубируют в цистерне на 68 л 47 ч при . 4 л полученной инкубиро- при 29°С .4л прлученной инкубированно среды второй стадии применяют для иноклирования 40л стерильной среды следующего состава, вес.%: рыбья мука 0,9 зерновая мука l,57i клейковина зерна 0,92 CaCOej 0,21} NaCl 0,1/ (NHjj)HFOjij 0,04 свекольная меласса 2,1| соевое масло 3,15- лецитин 0,09 и вода 90,9.
Добавлением 50%--ного раствора NaOH рН доводят до 7,2. Инокулированную питательную среду помещают для брожения в цистерну на 63 л на 5 дней при . Питательную средуаэрируют воздухом таким образом, что уровень растворенного воздуха составлял 30-50%, перемешивание осуществляют мешалками со скоростью 300 об/мин.
Пример 2. Ферментированный бульон (1600 л), полученный способом по примеру 1, фильтруют через фильтрующее устройство. рН фильтрата доводят до 9 добавлением 2%-ного раствора едкого натра.
Фильтрат экстрагируют 400 л амилацетата. Амилацетатный экстракт, имеющий высокую оптическую плотность но не проявляющий противомикробной активности, концентрируют в вакууме с получением масла.
Масло растворяют в 5 л бензола, бензольный раствор хроматографируют на колонке, заполненной силикагелем и промытой бензолом. Элюирование контролируют тонкослойной хроматографией, применяя смесь бензол-этилацетат (3:2) в качестве системы растворителей и распыленную серную кислоту для проявления. Сначала колонку прюмывают бензолом для удаления метедных соединений, а затем смесью бензол-этилаиетат (9:1)-для удаления и выделения тилэктона.Фракции, содержащие тилактон, объединяю и испаряют под вакуумом. Тилэктон кристаллизуют из смеси бензол-гексан или горячего гексана с выходом 2г..
Тилактон представляет собой Оелое твердое вещество, кристаллиэу1шяееся из гексана или смеси гексана
С этилацетатом, плавящееся при 162163 С,
Элементный состав, %;углерод 70, водород 9,7 и кислород 20,3. Эмпирическая формула тилактона CgiHjjOg , молекулярный вес 394.
Инфракрасньпй спектр тилактона в хлороформе. Отмечены частоты, при которых обнаруживаются заметные абсорбционные максимумы: 3534 ( дний) 2924 (сильный), 2398 (слабый) 2353 (слабый), 1709 (очень сильный), 1678 (очень сильный): 1626 (небольшой), 1592 (очень сильный), 1458 (сильный), 1441 (плечо), 1379 (небольшой), 1404 (сильный), 1316 ( сильный), 1284 (средний), 1181 . (очень сильный), 1143 (сильный), 1103 (средний), 1078 (средний), 1049 (очень небольшой), 1025 (средний), 984 (очень сильный), 958 (сильный), 923 (средний), 911 (плечо), 859 (небольшой), 868 (средний), 840 (средний), 820 (очень небольшой) и 661 см (небольшой).
Абсорбционный спектр в ультрафиолетовой области в нейтральном этаноле имеет абсорбиионный максимум при 282 нм ( , 560).
-55,23°(С1 ).
Электрометрическое титрование тилактона в 66%-ном водном растворе диметилформамида показывает, что в нем нет титруемых групп.
Тилактон почти не растворим в воде, но растворим в органических растворителях (ацетон, метанол, этанол диметилформамид, хлороформ, диэтиловый эфир, бензол и диметилсульфоксид).
Тилоктон может быть разделен с тилозином с помощью тонкослойной хроматографии на силикагеле. Для
проявления применяют распыленную серную кислоту, концентрированную или разбавленную (50%), в этом случае тилактон проявляется вначале в виде пятна с желтой, переходящей в коричневую окраской.
Пример 3. 3,5-Ди-О-аиетилтиллктон.
200 мг тилактона, полученного по 0 примеру 2, растворяют в 4 мл пиридина, добавляют 4 мл уксусного ангидрида, смесь оставляют на 16 ч при комнатной температуре, после чего упаривают досуха в вакууме. К полу5 ченному остатку прибавляют 5 мл метанола, раствор нагревают при 30 мин, nocfie чего концентрируют в вакууме с получением 3,5-ди-О-ацетилтилактона, имеющего значение IW в тонкослойной хроматографии с системой растворителей бензол-этилацетат (4:1) на силикагеле 0,59. Тилактон в той же системе растворителей имеет значение Пу 0,3.
Примеры 4-7. Получают 3,5-ди-О-пропионилтилактон согласно примену 3, но с применением протонового ангидрида.
Получают 3,5-ди-О-изовалерилтилактон согласно примеру 3, но с применением изова;.зрианового ангидрида.
Получают 3,5-ди-О-н-бутирилтилактон согласно примеру 3, но.с применением масляного ангидрида.
Получают 3,5-ди-О-н-бутирилтилактон согласно способу, приведенному в примере3, но с применением масляного ангидрида.
Следовательно, предлагаемый способ и штамм Streptomyces fradlae NRRL 12188 позволяют получить новый антибиотик тилактон.
1. Способ получения тилактон формулы Q эаключакяцийся в том, что штакм Streptomyces fradiae NRRL 12188 выращивают в питательной среде, содержащей источник углерода, азота и (Л неорганические соли, в аэробных тлубинных условиях ферментации с последующим выделением целевого продукта и при необходимости этерификацией его. 2. Штамм Streptomyces fradiae NRRL 12188 (Agricultural Research Culture Collectin NFRL), используемый для получения тилактона. со О) 00
