со со
Изобретение относится к области биотехнологии и касается микробиологического способа получения ингибато- ра фермента превращения ангиотензина, относящегося к гипотоническим средствам. Цель изобретения - разработка способа получения гипотонического средства микробного происхождения и изыскание штамма-продуцента, пригодного для осуществления способа. В качестве продуцента используют штамм Stceptomyces chromofuscus NRRL 15098. Штамм выращивают в жидкой питательной среде, содержащей источники углерода и азота и минеральные соли, в глубинных условиях при аэрации, при 25-30 С и рН 7-8,3. Культуральную жидкость отфильтровывают и жидкую фракцию подвергают ионообменной хроматографии, в результате которой получают чистые факторы А, В и С. Эти факторы можно перевести в соответствунмцие соли и эфиры. Биологическое действие факторов и их производных аналогично. Для повышения выхода факторов А и В в питательную среду можно добавить лизин и/или проЛИН. 2 с. .и 4 з.п. ф-лы. i СО
см
Изобретение относится к биотехнологии и касается микробиологического способа получения препарата медицинского назначения.
Цель изобретения - разработка способа получения гипотонического средства микробного происхождения и изыскание штамма-продуцента, пригодного для осуществления способа.
Родственная культура, из которой аьщелен штамм Str. chromofuscue, ото брана из тпочвенных обра,зцов бразильской коллекции, Южная Америка. Хранится в Коллекции Культур сельскохозяй- ственного исследовательского Центра под номером NRRL 15098 и характеризуется следующими признаками. Культурально-морфологические признаки С. .Среда Характеристика роста ISP № 2 Обильный рост, обильный (Междуна- воздушный мицелий: 2dc. родная при- желтовато-серый (G у),, нятая среда субстратньй мицелий: 69, выращивания глубокий СУ, отсутствие Streptomy- растворимого пигмента сев) ISP № 3 Хороший рост, субстратньй
мицелий: 91d, gy, слабый - рост воздушного мицелия, отсутствие растворимого пигмента
ISP № 4 Обильный рост, субстратный мицелий: 56, глубокий Вг, обильный воздушньШ мицелий: 2fe умеренно серый (G у), отсутствие растворимого пигмента ISP № 5 Хороший рост, субстратньй
мицелий: 94, 1,01, Вг, хорошее развитие воздушного мицелия: 2dc желтовато-серый (G у), светло- желтьй растворимый пиг- мент i
Агар Чапека Хороший рост, субстратньй мицелий: 79.1 gy.y. Вг, хорошее развитие воздушного мицелия: 3ge светложелтовато-серовато корич50
невый (Gy), отсутствие растворимого пигмелта,- Обильньй рост, субстрат- ньй мицелий: 75, глубокий -уВг, обильный воздушньй . мицелий: 3ge светло-серовато-желтовато-коричневый(Су), отсутствие.растворимого пигмента
О
с
д , 5
0
Цифровые и буквенные обозначения, используемые для цветов субстратного мицелия, относятся к цветовым диаграммам стандартного образца центроид- ной цветовой диаграммы 1SCC-NBC, № 2106, США, Коммерческое отделение. Национальное бюро стандартов.
Штамм S. chromofuscus продуцирует хорошо развитьй нефрагмейтированный мицелий, который является моноподи- апьно разветвленным. Спорофоры на . воздушных гифах с образованием спиралей по 4-5 витков. Некоторые спирдли образуют очень плотные шары по концам спорофоры. Эти шары могут быть ошибочно приняты за склероции. Споры продолговатые с заостренной поверх- ностью.
Физиологические характеристики. Анализ полностью гидролизованных клеток штамма S. chromofuscus показывает наличие LL-диаминопимелиновой кислоты. Анализ на сахар полностью гидролизованных клеток показывает присутствие глюкозы, маннозы, рибозы и рамно- зы. Эти результаты показьшают, что стенка клетки данного штамма является стенкой клетки типа 1.
Использойание источников углерода. Использование углерода определяют на основной среде ЙР, в которую вводят стерилизованные источники углерода, до конечной .концентрации 1,0%. Чашки с культурой термостатируют при 30 С и анализируют по прошествии 14 дней (при этом знак минус (-) означает без использования, плюс () использование, (±) сомнительное использование).,
Отсутствие углеродаL-Арабиноза+
D-Фруктоза+
D-Глюкоза+
i-Инозитол+
D-Маннитол+
Раффиноза«(.-Бамноза+
Сахароза± D-Ксилоза . -ID-Арабиноза+
Циллрбиоза+
D-Галактоза.+
Лактоза+
В-Мальтоза
Мельбиоза+
Ацетат.натрияЦитрат натрия+
Сукцинат натрия+
D-Рибоза+
Салицил
Штамм гидролизует крахмал и час- тично снятое молоко. На снятом моло- ке образуется темно-коричневое кольцо. Желатин не гидролизует. В ISP№ 8 бульон органического нитрата не восстанавливает нитраты до нитритов.
Максимально допустимая концентра- ция хлористого натрия примерно до 7%.
Температурный оптимум примерно от 15 до 40°С.
Образование меланоидного пигмента
Среда Образование пигмента ISP IP 1
Бульон триптон- но-дрожжевого экстракта+
ISP № 6
Скошенный агар пептонно-дрож- жевого экстракта железа + ISP № 7
Тирозиновый
агар+
ISP № 7
Скошенньш агар без тирозина -
Способ иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Продуцирование и выделение А-58365 факторов.
Лиофилизованную гранулу S. сЬгошо- fuseus NRRL 15098 и.спользуют для ино- кулирования 50 мл стерилизованной ве гетативной среды трехпроцентного триптиказного соевого бульона, содержащего 1% глюкозы. Инокулированную среду термостатируют при 30 С в течение 48 ч при одновременном взбалтывании. Вегетативную среду используют для инокулирования второй среды слег, -дующим образом: две колбы емкостыо по 2000 мл, каждая из которых содержит по 400 мл трехпроцентного трипти- казного соевого бульона с введением 1%-ной глюкозы, инокулируют (каждая) 10 мл вегетативной среды, посевы тёр- мостатируют в течение 24 ч при 30 С.
Полученные культуры используют для инокулирования 100 л продуцирующей среды, имеющей следующий состав, г/л
Прртивопенное
средство А
Dow-Corning 0,2
Картофельный
декстрин35
Дрожжи0,25
Пептон ОМ20
COClj CHjO0,01
L-ПроЛИН 4
N-Z Амин А4
Деионизированная
водаДо объема среды
100 л
При этом ОМ пептон представляет - собой растворимый мясной пептон, N-Z Амин А - ферментативный гидролизат казеина.
В еличину рН среды дойодят до 7,0 посредством 5 н. гидрата окиси натрия до стерилизации. После стерилизации данную среду инокулируют упомянутой культурой и осуществляют брожение при 25 С в течение 90 ч. В процессе брожения через среду пропускают стерильный воздух, при одновременном перемешивании со скоростью, достаточной для поддержания содержания растворенного кислорода среды примерно 30-40% от насыщения воздухом.
Величину рН среды увеличивают в процессе брожения до конечного значения 8,3..
В процессе брожения среду анализируют на содержание А-58365 фактора с использованием системы PHLC. Факторы обнаруживают по флюоресценции с использованием спектрофотофлуорометра Schoeffel модели FS 970 длиной волны 327 нм и с фильтром с ограниченной полосой пропускания 370 нм. Анализируемая продуцирующая среда показывает примерно 11,5 мкг/мл фактора после 90 ч брожения.
При осуществлении брожения, как описано выпге, три отдельные среды брожения объемом по 100 л каждая, находящиеся в бродильных чанах, подкисляют концентрированной соляной кислотой до величины рН 2,0. Полностью подкисленные бульоны брожения объединяют и фильтруют с использованием в качестве вспомогательного порошка фильтрования 2%-ного Hyflo, Величину рН отфильтрованного бульона брожения дово- дят до 7,0 посредством 5 н. гидроокиси натрия. Не содержащую функциональных групп смолу Diaion НР-20 доводят в нейтральный питательньш бульон в количестве, соответствующем одной десятой части объема отфильтрованного бульонами смесь смола - бульон перемешивают в течение 2 ч. Бульон отделяют от смолы и подкисляют до величины рН, равной 2,Ojпосредством 5 н. соляной кислоты. ПодкисЛенньй бульон быстро охлаждают и фильтруют с целью удаления неактивных осажденных продуктов. Подкисленный бульон вводит в колонку длиной 20 дюймов и диаметром (внутренним) А дюйма, содержащую 20 л смолы Diaion НР20,и выходящий
Biokex 5 (СГ) 1001403991
полненную смолой 200 меш.
Смолу промывают деионизированной водой, при этом промь вку и выходящий из колонки поток удаляют. Колонку элюирушт 400 мл 0,20 М хлористого натрия и затем 2200 мл 0,35 М хлорис-. того натрия. Получают фракции объемом из колонки поток удаляют. Колонну за-ю 20 мл и фракции 106-140,-содержащие тем промывают 60 л 0,3%-ного водного чистьй фактор А, объединяют. Величину раствора муравьиной кислоты и выходящий из колонки поток удаляют. Затем факторы А-58365 элюируйт 100 л порциями элюента с переходом от воды - муравьиной кислоты (99,7:0,3 об.:об.) к ацетонитрилу - воде - муравьиной кислоте (20:79,7:0,3 об.:об.:об.) и собирают фракции объемом 2 л. Фракции
27-48, содержащие фактор А, объединя-2о ленной до рН 2,3, разбавленной соля- ют. и концентрируют в вакууме до объ- ной кислотой, затем 220 мл деионизи- ема 750 мл. Элюирование осуществляют 20 л смеси ацетонитрил-вода-муравьи- ная кислота (20:79,7:0,3). Фракции
рН объединенных фракций доводят до 2,3 путем добавления 1 н. соляной х кислоты и подкисленные объединенные 15 фракции вводят в колонку размерами 2,.8 см 19 см (120 мл), наполненную смолой Diaion НРйО в 0,01 н. .соляной кислоте. Колонку промывают сначала 100 мл деионизированной воды, подкисрованной воды (рН 5,9) и затем злюи- pyioT 340 мл смеси ацетонитрил-вода (15:85, об.:об.). После получения
56-63, содержащие фактор В, объединя- 25 фракций в объеме 180 мл их извлекают.
ют и концентрируют до объема 350 мл.
Концентрат, содержащий фактор А, вводят в колонку размерами 9,3 см« см (5 л), наполненную смолой Dowex 50W X 2 (Н), и эту колонку элюируют примерно 17 л деионизированной воДы. Однолитровые фракции от 9-15-литровых фракций элюированного объема, содержащие фактор А, извлекают, объединяют и концентрируют до юбъема примерно 200 мл.
Концентрат, содержащий фактор А (РН 2-3), фильтруют и подвергают хро- 1атографическому разделению методом HPLG с обратной фазой в колонке размерами 8 см 1 м (Jobin Iron Chroma-:: tospac Fred instrument), наполненной примерно 2,5 кг.(4-4,5 л) октадецил- силанизированного силикагеля Whatman LP-1. Колонку элюируют сначала 2 л смеси муравьиная кислота-вода (0,3: : 99,7 об.:об.) , затем 3 л-смеси аце- тонитрил-муравьиная кислота-вода (1,0; :0,3:98,7, об.:об.:об.) и 20 л смеси ацетонитрил-муравьиная кислота-вода (2,5:0,3:97,2, об.:об.:об.). Собирают фракции объемом 500 мл. Фракции 32- 44, содержащие фактор А, объед иняют и концентрируют путем выпаривания до объема 200 мл.
Содержащий фактор А концентрат, полученный при хроматографическом разделении HPLC, вводят в колонку размерами 2,5 см 30 см (180 мл), нафракции от О до. 180 мл вытекающего потока собирают, объединяют, концентрируют путем выпаривания и лиофилизи- руют, в результате чего получают
30 1,31 г чистого фактора А.
Концентрат объединенных фракций, содержащих фактор В, элюированных из колонки, наполненной смолой Diaion НР-20, как описано вьше, вводят в коде лонку размерами 9,3 см х80 см (5 л), наполненную смолой Dowex 5OW 2 (Н цикл). Эту колонку элюируют 32 л деионизированной воды, и фактор В собиг рают в однолитровых фракциях от 1040 14 л элюата. Активные фракции объеди- няют и концентрируют до объема при- мерно 250 мл.
Затем концентрат, содержащий А- 58365 фактор В, подвергают тому же
45 хроматографическому разделению методом HPLC с обратной фазой, как описи-, но выше, для очистки фактора А. Ко; лонку элюируют сначала 2 л смеси муравьиная кислота - вода (0,3:99,7 об.%),
50 затем смесью ацетонитрил - мураньиная кислота - вода (6,0:0,4:93,7 об.%) и после этого смесью ацетонитрил - муравьиная кислота - вода (15,0:0,3: :84,7, об.%). Извлекают ряд фракций
55 объемом примерно 500 мл. Фракцию 24, содержащую фактор В, концентрируют
( путем выпаривания до объема 100 мл.
Концентрат фактора В дополнительно очищают с помощью . анионообменной
Biokex 5 (СГ) 100Смолу промывают деионизированной водой, при этом промь вку и выходящий из колонки поток удаляют. Колонку элюирушт 400 мл 0,20 М хлористого натрия и затем 2200 мл 0,35 М хлорис-. того натрия. Получают фракции объемом 20 мл и фракции 106-140,-содержащие чистьй фактор А, объединяют. Величину
ленной до рН 2,3, разбавленной соля- ной кислотой, затем 220 мл деионизи-
рН объединенных фракций доводят до 2,3 путем добавления 1 н. соляной х кислоты и подкисленные объединенные фракции вводят в колонку размерами 2,.8 см 19 см (120 мл), наполненную смолой Diaion НРйО в 0,01 н. .соляной кислоте. Колонку промывают сначала 100 мл деионизированной воды, подкисленной до рН 2,3, разбавленной соля- ной кислотой, затем 220 мл деионизи-
рованной воды (рН 5,9) и затем злюи- pyioT 340 мл смеси ацетонитрил-вода (15:85, об.:об.). После получения
ракции от О до. 180 мл вытекающего потока собирают, объединяют, концентрируют путем выпаривания и лиофилизи- уют, в результате чего получают
1,31 г чистого фактора А.
Концентрат объединенных фракций, содержащих фактор В, элюированных из колонки, наполненной смолой Diaion НР-20, как описано вьше, вводят в колонку размерами 9,3 см х80 см (5 л), наполненную смолой Dowex 5OW 2 (Н цикл). Эту колонку элюируют 32 л деионизированной воды, и фактор В собиг рают в однолитровых фракциях от 1014 л элюата. Активные фракции объеди- няют и концентрируют до объема при- мерно 250 мл.
Затем концентрат, содержащий А- 58365 фактор В, подвергают тому же
хроматографическому разделению методом HPLC с обратной фазой, как описи-, но выше, для очистки фактора А. Колонку элюируют сначала 2 л смеси муравьиная кислота - вода (0,3:99,7 об.%),
затем смесью ацетонитрил - мураньиная кислота - вода (6,0:0,4:93,7 об.%) и после этого смесью ацетонитрил - муравьиная кислота - вода (15,0:0,3: :84,7, об.%). Извлекают ряд фракций
объемом примерно 500 мл. Фракцию 24, содержащую фактор В, концентрируют
путем выпаривания до объема 100 мл.
Концентрат фактора В дополнительно очищают с помощью . анионообменной
смолы следующим образом. В колонку размерами 2,0 см (внутренний диаметр) «25 см, наполненную анионообменной смолой Й1о Rex 5 (Cl) вводят концёнт рат, и эту колонку элюируют сначала 200 мл 0,2 М хлористого натрия, а затем 1600 мл 0,35 М хлористого натрия. Извлекают ряд фракций объемом 10 мл и фракции 192-110 объединяют. Величину рН объединенных фракций доводят до значения 2,3 1 и. соляной кислотой и подкисленные объединенные фракции вводят в колонну размерами 8 мм (внутренний диаметр)«20 ом (10мл) наполненную смолой Diaion НР-20 в 0,01 н. соляной кислоте. Колонку промывают сначала 300 мл деионизирован- ной воды (с величиной рН до 2,3), затем 14 мл деионизированной воды (рН 5,9). Выходящий поток и промьшку удаляют и фактор В элюируют 44 мл смеси ацетонитрил-вода (15:85 об.%). Собирают ряд фракций объемом 2 мл. Фракции 8-11 объединяют и концентри- руют до объема 1 мл. КоЗДентрат дио- филизируют, в результате чего получают 2,9 мл чистого фактора В.
П р и М е р 2. Продуцирование А-58365 факторов А и В в среде выра- щивания, пополняемой пролином и лизином .
S. chromofuscus NRRL 15098 выращивают в вегетативной среде, приготовленной и культивированной, как описано в примере 1, и эту среду выращивания используют для инокулирования продуцирующей среды, имеющей следующий состав, г/л:
Картофельный декстрин
NZ Амин А (ферментативньш гидролизат
казеина)
Дрожжи
L-Пролин
Мясной экстракт
25
cocij eHjO
3
0,25 3 1
0,01
L-Лизин2
Деионизированная До объема обводащего 1000 мл Величину рН среды доводят до 7,0 посредством 5 н.гидрата окиси натри до стерилизации. После стерилизации данную среду йнокулируют и культивируют при 30°С в течение 96 ч.
В процессе брожения культуральную жидкость анализируют на содержание фактора с использованием, описанной системы HPLC.
Q 5 0 5
о
5
0
5
Q
5
Фактор В извлекают из отфильтрованной культуральной жидкости, отделяют и очищают путем хроматографического разделения, как описано в примере 1 .
П р и М е р 3. Получение сложного диметилового эфира А-58365 фактора А.
А. К раствору 319 мг А-58365 фактора А в 7,5 мл метилового спирта до-,, бавляют 2,5 мл метилового спирта, содержащего 4 вес.% хлористого водорода и раствор перемешивают при комнатной температуре в течение 140 мин. Смесь этерифицирования затем выпаривают досуха и остаток после выпаривания растворяют примерно в 20-25 мл воды. Величину рН раствора доводят до 6,8 и раствор выдерживают при комнатной температуре в течение ночи. После выдержки величину рН водного раствора повышают от 6,2 до 7,1 и затем раствор трехкратно экстрагируют 100 мл порциями хлористого метилена. Соединенные экстракты дают примерно 151мг диметилового сложного эфира фактора А.
Bi Раствор 35 мг фактора А в 4,5 мл раствора трифторида бора в метиловом спирте (14% BF в безводном метиловом спирте) нагревают при перемешивании при температуре 65 С в течение 2,5 ч. В ходе реакции воздух удаляют из реакционного сосуда. После этого реакционную смесь концентрируют путем выпаривания до объема примерно 1,5 мл и концентрат растворяют в 10мл воды. Водный раствор пятикратно, экстрагируют равными объемами хлористого метилена, экстракты объединяют, промывают 5 мл воды, высушивают над сульфатом натрия, фильтруют и выпаривают досуха, в результате чего полу- чают 24,4 мг сложного диметилового эфира фактора А.
П р и М е р 4. Получение сложного диэтилового эфира А-58365 фактора А,
сложных моноэтиловых эфиров. I
Раствор 507 мг фактора А в 15 мл
абсолютного этилового спирта охлаждают в ледяной бане и к раствору добав- ляют 10 мл абсолютного этилового спирта, содержащего 3 вес.% хлористого водорода при одновременном переме- шивании. Реакционную колбу промывают азотом, закрывают пробкой и выдерживают при комнатной температуре.
Процесс этерификации сопровождается анализом HPLC небольших аликвотных проб реакционной смеси, отбираемых
9-U
время от времени. По прошествии 8 ч реакционную смесь разбавляют 50 мл воды и величину рН водного раствора доводят до 6,9 посредством разбавленного гидрата окиси натрия. Раствор выпаривают с целью удаления этилового спирта и водный концентрат разбавляют водой до объема 40 мл и обрабатывают разбавленным гидратом окиси натрия, доводя величину рН до 7,09, Затем раствор четырехкратно экстрагируют 50 мл порциями хлористого метилена и экстракты соединяют, промывают 20) мл воды, высушивают над сульфатом натрия и выпаривают досуха в вакууме, в результате чего получают 222 мг сложного диэтилового эфира фактора А.
Величину рН водной фазы от указанной экстракции сложного диэтилового эфира доводят до 1,95 посредством соляной кислоты и экстрагируют пять раз 50 мл порциями хлористого метилена. Экстракты объединяют, промывают разбавленной кислотой и удаляют. Кис- лотную водную фазу четырехкратно экстрагируют 50 мл порциями этилаце- тата и экстракты объединяют и промывают разбавленной кислотой. Этилаце- татный экстракт и метиленхлоридньм экстракт объединяют, высушивают над сульфатом натрия и выпаривают досуха Получают 257 мг смеси сложных моно-. этиловых эфиров фактора А. Анализы методом НРЕС и ЯМР (360 МГц) показывают, что это смесь 9-: 1 сложных моноэтиловых эфиров,
Физико-химические свойства полученных продуктов.
А-583ь5 фактор А. Фактор А белый аморфный порошок, хорошо растворимый в воде и полярных органических растворителях, таких как метиловый спирт этиловый спирт, диметилформамид и. диметилсульфоксид, ijo плохо растворимьй в ацетоне и нерастворимый в таких углеводородных растворителйх, как бензол и гексан.
Фактор А поглощает излучение в ультрафиолетовой области спектра. Указанный абсорбционный спектр ульт рафиолетовой области фактора А получен с использованием водного раствора фактора А в нейтральных, кислотных и щелочных условиях.
Нейтральные и кислотные условия:
232 (из расчета 325 (из расчета МВт 267)
р-
Q 5
0 5
дс
0
5
0
50
5
10
Щелочные условия: 243 355 нм 7400 Фактор А имеет характерную картину флюоресценции. Приведенный ниже флюоресцентный спектр фактора А получен с использованием спектрофлюорометра Amino - Bovmian в водном растворе фак- тора А в кислотных, нейтральных и щелочных условиях.
Кислотные условия, нм: Максимум возбуждения 327 Максимум излучения 398 Нейтральные условия, нм: Максимум возбуждения 324 Максимум излучения 396 Щелочные условия, нм: Максимум возбувдения 350 Максимум излучения 424 Спектр с ЯМР фактора А получен с помощью спектрометра ЯМР Broker модели WM270. Спектр показывает нижеследующие характеристические сигналы: ЯМР (67,9 МГц, Д.О): S 25,66 (1C, t)-, 26,76 (1C, t); 27,66 (1C, t); 33,19 (1C, t); 63,80 (tC, d); 128,52 (1C S)j 134,72 (1C, d); 135,20 (1C,S); 136,06 (1C, S); 159,86 (1C, S); 174,42 (1C, S); 177,89 (1C, S) (t - триплет,d-1-дублет, S -синглет).
Инфракрасный спектр поглощения имеет следующие адсорбционные пики: ИК (КВг) Частота, Интенсивность 3500-2700 Ьг, S
2960 W
2700-2400 br, m
1719S
1660 Shd
1526S
1440
1410 m-S
1320S
1285m
1210m
1126W
1055 VW
1028W
957 VW
911 W
878 W
836 VW
При этом приняты следующие обозначения: br - широкий, m - средний S - сильный, W - слабый, W - очень слабый, m-S от среднего до сильного, m-W - от среднего до слабого, Shd - размытый.
Ниже приведены характеристические сигналы спектра н ЯМР 1Н ЯМР (360МГц,
Dgp): J 2,30 (1H, M); 2,57 (1H, m)j 2,64 t 2,4 (1H, dt); 2,81 (lH,dt); 3,05 (TH, dd); 3,15 (1H,ddd); 5,01 (1H,dd); 7,33 (1H,S).
Мол. вес фактора A составляет 267, Бомбардировка быстрыми атомами (FAB)m/e 268; десорбционный масс- спектр т/е 267,223 t FAB высокого разрешения: т/е 268,08189.0, рассчитанная 268,08211 для С, (М+Н),
Элементарный анализ, осуществляемый на образце фактора А, показывает следующий состав на основе эмпиричес- кой формулы CiiHfjNOfe ,
ОН
СООС-СНг-СНгД
соон
Рассчитано, %: С 53,93; Н 4,90; N 5,24;
Найдено, %: С 53,72; Н 5,10; N 6,16.
Фактор А имеет следующее значе:Ние удельного вращения плоскости поляризации: И (, ) - 199,5.
Электрометрическое титрование, осуществляемое на образце фактора А в 66%-ном диметилформамиде, показывает наличие трех титруемых групп: рК 3,7, 7,5, 12,3.. ...
А-58365 фактор В. Фактор В имеет характеристики, бл1|зкие к фактору А, отличаясь от него в отношений струкг туры одним метиленовым звеном.
Инфракрасный абсорбционный спектр фактора В содержит следующие хорошо различимые абсорбционные пики: ИК (КВг): Частота, . Интенсивность 3600-2800 Ьг, S
2960 m-W 2700-2400 br, W
Т717 S
1652 S
1538 S
1436 mrW
1412 S
1350 VW
1280 m
1220 m
1157 W
1072 W
1049 W
. 5
fO
t5
20
25
35
зО
40
45
783 m-W 639 br, W
Спектр протонного магнитного резонанса (IH ЯМР) для фактора В содержит следующие сигналы: IH ЯМР (360 МГц, ): J 1,67 (IH, т); 1,86 (IH, т); 2,08 (1Н, т); 2,35 (1Н, т); 2,66 (2Н, t); 2,76 (IH, m); 2,78 2Н, m); 2,93 (IH, m); 5,10 (iH, dd) ;- 7,35 (IH, S) (m - мультиплет).
Спектр углеродного ядерного маг-)1 нитного резонанса фактора В показывает,, следующие сигналы: -С -ЯМР (67, МГц, ДО): § 16,08 (1C,t); 23,43 (1C,t), 26,07 (1C, t); 26,36 (1C, t); 33,44 (1C,.t); 58,03 (1C, d); 126,60 (1C, S); 132,88 (1C, S); 133,06 (1C, d); 137,13 (1C, S); 161,73 (tC, S); 176,97 (1C, S); 178,57 (1C, S).
Фактор В поглощает излучение в ультрафиолетовой области спектра и также,как и в случае фактора А, максимумы, наблюдаемые в нейтральных и кислотных условиях, смещаются в сторону большей длины волны при вводе основания. Максимумы, наблюдаемые для водного раствора фактора В, имеют следующие значения:
Нейтральная и кислотная среда: Тумаке и 232 нм (), -АМОЧСС 335 нм (). Д Qj при 232 нм смещен к 244 нм в основании, в то время как смещен к 360 нм, также в основании.
Фактор В также, как и фактор А, флюоресцирует синим цветом при длинноволновом УФ-излучении.
Мол. вес фактора В составляет 28t, как определено методом масс- спектрального анализа.
Десорбционньй масс-спектр: m (е 281 /М).
На основе анализа физических и спектральных характеристик фактора В он имеет следующую эмпирическую фор- . мулу СдН ОеИли структурную формулу
ОН
50
НООС-СН -СНг
О СООН
Сопоставительный анализ спектральных данных факторов А и В показывает, что фактор В является более высокомолекулярным гомоголом фактора А.
Характеристики растворимости фактора В аналогичны характеристикам растворимости фактора А. Фактор В хорошо растворим в воде и полярных органических растворителях, таких как метиловый спирт, этиловый спирт, ди- метилформамид и диметилсульфоксид, но плохо растворим в ацетоне и нерастворим в углеводородных растворителях, таких как бензол и гексан.
А 58365 фактор С. Фактор, обраэуе- мьй в меньшем количестве, чем факторы А и В, получают из культуральной жидкости штамма S. chromofuscus NRRL 15098 и обозначен,как А-58365 фактор С. По своим свойствам фактор С аналогичен как фактору А, так и фактору В. Как и указанные факторы, фактор С флюоресцирует синим цветом при длин- новолновом ультрафиолетовом излуче-
НИИ.
Молекулярный вес фактора С составляет 295, как определено методом ; масс-спектрального анализа
Десорбционный масс-спектр га (е 295 /М.
Фактор С имеет эмпирическую форму- лу СцН„МОб.
Факторы А-58365, хотя и аналогичны, но имеют характерные значения времени удерживания при жидкостной хроматографии высокого разрешения (HPLC). Отдельные факторы/могут быть отделены друг от друга методом HPLC. Системаj используемая для разделения факторов, представляет собой колонку Waters Associates и Bondapak CtB, размерами 4 мм 300 мм, со станци- онарной фазой. Используемая подвижная фаза состоит из.6% ацетонитрила (0,3% муравьиной кислоты), 93,7% воды, скорость потока подвижной фазы составлй- ет 2,5 мл/мин. Для обнаружения наличия факторов в системе используется характерная для них флюоресценция, Флюоресценция определяется с по- г Мощью спектрофотометра Schoeffel .FS 970.
Время удерживан ия факторов в указанной системе HPLC имеет следующие значения, мин: А 4,88; В 12,47; С 18,21.
Биологические свойства. А-58365 факторы формулы
№2)п
{Jf
О COORi
где п 1 или 2,
R, R - одинаковые или различные и означают Н или С -С -алкил, ингибируют действие фермента превращения ангиотензина, что подтверждено исследованиями, проводимыми вне живого организма (в условиях in vitro) с использованием подвздошной кишки, извлеченной из морской свинки. Испытания в условиях in vitro осуществляли следующим образом: сегменты (дли- ной 2-3 сн) подвздошной кишки морской свинки помещают в вытянутом в про,- дольном направлении состояния в Юмл клеточной шанны, содержащей раствор Крзбса, имеющий следующий состав (молярные концентрации): хлористый натрий 118,2, хлористый калий 4,6, дигидрат хлористого кальция 2,5, первичный кислый фосфорно-кислый калий 1,2, сульфат магния 1,2, декстроза 10,0 и бикарбонат натрия 24,8, во всех экспериментах ткани поддерживают при 37 С и осзпцествляют насыщение ванны смесью, состоящей из 95% кислорода и 5% двуокиси углерода. Подвздошную кишку закрепляют между двумя ,i: электродами, состоящими из стержней из нержавеющей стали (основание) и кольцевой платиновой проволоки (верх).
Прямоугольные импульсы (0,1 Гц) сверхмаксимального напряжения (40 В) и продолжительностью 0,7 мс создают посредством стимулирующего устройства Graas S 44. Ткани приводят в равновесие в течение 1 ч при воздействии нагрузки 1 г. Изометрические реакции регистрировались на динографе Бекмана.
Получают кривые концентрация - реакция К 3 или 4 концентрациям ангиотензина 1. Затем ткани вновь приводят в равновесие с А-58365 фактором (10 10 моль) и снова регистрируют кривые концентрация - реакция к ангио- тензину I. Каждая ткань получает лишь одну концентрацию фактора.
Во всех случаях происходит значительное смещение кривой сокращения
151403991
реакции на ангиотенэин I. Ингибирова- ние АСЕ в подвздошной кишке морской свинки было конкурирующим. Данные, полученные с факторами А и В в опит санном испытании, демонстрируют также, что факторы А и В не ингибируют выделение ацетилхолина и не блокируют хоЛИНэргические рецепторы. В системе in vitro А-58365 факторы А и В монстрйруют фармакологическую способность ингибировать АСЕ.
А-58365 факторы являются гипотоническими средствами, которые благодаря
16
заболевания и переносимость лекарств отдельным пациентам, а также от друг гих факторов.
Сложные эфиры А-58365 фактора так же обладают свойствами ингибировать АСЕ. Ацилоксиметиловые сложные эфиры также как и инданиловые и фталидило- вые сложные эфиры данных факторов, являются лекарственными формами факторов, используемых для приготовления рецептур данных факторов для вво да в организм через рот. Кроме того, сложные алкиловые диэфиры (с содержаих способности ингибировать фермента- нием 1-6 атомов С) используются для
20
30
тивное расщепление ангиотензина I до. прессоагента ангиотензина II в клетках млекопитающих животных являются ценными гипотоническими средствами. Способность факторов, ингибирующих АСЕ, понижать кровяное давление продемонстрирована с фактором А на крысах с очищенным желудком.
Полученные по предлагаемому способу соединения могут быть использованы25 для понижения кровяного давления i а- страдающим гипертонией млекопитающим животным. Данные факторы или их фар мацевтически пригодные соли могут вводиться в организм индивидуально или в комбинации с фактором В. При практическом осуществлении данного способа А-58365 фактор или его фармацевтически пригодная соль вводится в организм через рот, путем внутри- мьшечной, внутривенной или подкожной инъекций. Для парэнтерального ввода А-58365 фактор или его фармацевтически пригодную соль растворяют в физиологически пригодном растворе, предназначенном для инъекции. Для данной цели могут быть использованы соответствующие физиологические разбавители, такие как вода для инъек ции, 0}9%-ный солевой раствор, 5%-ная- глюкоза и другие общеизвестные разбавители. Для ввода через рот А-58365 фактор или его фармацевтически пригодная соль могут вводиться в организм.
35
40
извлечения и очистки факторов метода ми хроматографии.
Формула изобретения
ЕООС
(саг)п
COOR,
где п 1 или 2; .
R иЯ,- одинаковые или различные,
означают Н или С, -С -алкил, о тлич ающ и и с я тем, что штамм Streptomyces chromofuscus NRRL 150У8 культивируют при 25-30 С и рН 7-8,3 в жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные cojm, в глубинных аэробных условиях с последующим разделением целевого продукта на отдельны факторы и при необходимости полученный фактор А этерифицируют.
ОН
в виде капсул, таблеток или жидких
50
суспензий. А-58365 фактор или его фармацевтически пригодная соль могут быть введены в организм в виде нетоксичной единичной дневной дозы, тавляющей примерно от 100 до 2000 мг/ /кг веса пациента, или в виде не- : скольких дневных доз. Точньй режим ввода препарата зависит от таких факторов, как степень гипертонического
1
16
заболевания и переносимость лекарства отдельным пациентам, а также от друг гих факторов.
Сложные эфиры А-58365 фактора также обладают свойствами ингибировать АСЕ. Ацилоксиметиловые сложные эфиры, также как и инданиловые и фталидило- вые сложные эфиры данных факторов, являются лекарственными формами фак торов, используемых для приготовления рецептур данных факторов для ввода в организм через рот. Кроме того, сложные алкиловые диэфиры (с содержанием 1-6 атомов С) используются для
извлечения и очистки факторов методами хроматографии.
Формула изобретения
ЕООС
(саг)п
COOR,
где п 1 или 2; .
R иЯ,- одинаковые или различные,
означают Н или С, -С -алкил, о тлич ающ и и с я тем, что штамм Streptomyces chromofuscus NRRL 150У8 культивируют при 25-30 С и рН 7-8,3 в жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные cojm, в глубинных аэробных условиях с последующим разделением целевого продукта на отдельные факторы и при необходимости полученный фактор А этерифицируют.
ОН
соос
соон
ч а ю 3. Способ по п.1, о т л и щ и и с я тем, что выделяют А-58365 фактор В формулы
HOOC-CHt-CHj
О СООН
и 2, о т
