Способ получения антибиотической смеси Советский патент 1984 года по МПК C12P21/04 C12R1/47 

15

4000 3SOO то 2500 20001800 JSOO то КОО woo SOOWO 1(00250

(CM-f

& 7 В 9 10 21f1S1S202S30 0

(pue.f

Изобретение относится к получению антибиотических А-21978 смесей, главным образом к получению смеси А-21978 е, содержащей микробиологически активные родственные факторы GO , С, Сз, С4 и Су. Смеси А-21978 и А-21978 С погруженной аэробной ферментацией штамма 11379. Индивидуальные А-21978 С факторы разделяют и выделяют хроматографией. А-21978 и А-21978 С смеси, А-21978 С факторы и их фармацевтически применимые соли представляют собой антибактериальные агенты и способствуют росту домашней птицы.

А-21978 С-смеси представляют собой родственные кислотные пептидные антибиотики. К данному классу антибиотиков относятся кристалломицин, амфомицин, заомицин, аспартоцин и глюамицин t1J.

Среди указанных антибиотиков, , как полагают, церексин А, церексин В и бревестин являются антибиотиками наиболее родственными новым А-21978 антибиотиками.

Известен способ получения антибиотической смеси, включающий культивирование штамма 5758 или 8092 в культуральной среде, содержащей источники углерода, азота и неорганические соли, в аэробных условиях до достижения значительной антибиотической активности СЗ.

Однако антибиотики, полученные данным способом,не обладают ростостимулирующей активностью для домашних птиц.

Цель изобретения - расширение ассортимента антибиотиков.

Поставленная цель достигается тем чт5 согласно способу получения антибиотической смеси проводят культивирование штамма Streptomyces roseospo rus NPPLH379 в аэробных условиях н среде,содержащей источники углерода, азота и минеральных солей,с последую щим вьвделением отдельных компонентов смеси.

Пример, Фактор С А-21978 обозначен как смесь А-21978 С. Соли смесей А-21978 и А-21978 С, а также индивидуальные А-21978 .факторы С, С, С, Cj, С и Cf составляют часть изобретения.

В А-21978 С смеси факторы С, Cg и Cj являются основными, а факторы Cjj, 04,и Су - факторами, присутствующими в небольших количествах.

Антибиотические вещества, полученные по предлагаемому способу,произвольно обозначены как А-21978 антибиотики. Термин А-21978 антибиотики применяется в целях сокращения о тем, чтобы обозначить А-2197 и А-21978 С смеси, А-21978 факторы Со, С, С4 и Cg, а также их ф рмацевтически применимые соли.

Предлагаемый способ обеспечивает получение А-21978 антибиотической смеси в результате погруженной аэробной культивации щтамма Streptomyces roseosporus NPPL 11379 или его А-2197В производящего мутанта, а также антибиотической смеси А-21978 С и факторов Сд, С, Cj и С, которые являются ее компонентами.

Изобретение предусматривает также способ получения А-21978 смеси, который заключается в культивировании штамма Streptomyces roseospo rus NPPL 11379 или А-21978-производящего мутанта в культурной среде, содержащей ассимилируемые источники карбогидрата, азота и неорганических солей, в условиях погруженной аэробной ферментации до получения значительного количества антибиотической активности.

После получения достаточного уровня антибиотической активности А-2197 смесь отделяют фильтрацией ферментационного бульона г понижают рН . фильтрата до значения ниже 3, дают смеси осаждаться и полученную смесь отделяют фильтрацией. Вьщеленную смесь можно подвергнуть дополнительной очистке с помощью экстракционной техники. Для вЕвделения индивидуальной А-21978 С и факторов необходимо использовать хроматографическое разделение. А-21978 антибиотики днгибируют рост патогенных организмов, особенно грамположительных бактерий.

На фиг. 1-7 представлены ИК-спектры {таблетки КВ2) следукядих А-21978 антибиотиков (в виде натриевых солей) : фиг. 1 - А-21978 смесь; фиг.2 А-21978 С фактор фиг. 3 А-21978 С фактор С-;фиг.4 - А-21978 фактор Сз; фиг. 5 - А-21978 С фаКЯ тор Ср; Фиг. б - А-21978 фактор фиг. 7 - А-21978 С фактор Су, .

А-21978 С факторы представляют собой родственно связанные ц«птидHbie антибиотики. В результате ферментации регенерируется до шести антибиотических факторов и образуется А-21.978 смесь. Индивидуальные факторы CQ, С, С, Cj, С и Cg выделяются в 0иде индивидуальных соединений .

А-21978 факторы представляют собой родственно связанные кислотные, циклические полипептидные антибиотики, несущие жирно-кислотную ациальную группу при концевой аминогруппе. При гидролизе каждый из факторов образует следующие аминокислоты, моль:Аспартовые кислоты 4

Глицин2

Аланин1

Серин1

Теонии1

Триптофан1 Орнитин Кинуренин 3-Метилглютамовая кислота Одной из них является аспаргин. Может образовываться из 3-метилглютамина. Каждый из А-21978 факторов содер жит жирную кислоту. В табл. 1 суммировано содержание углерода и приведена идентификация жирных кислот, содержащихся в каждом из факторов А-21978 С. Т а б л и ц а 1 8-Метиллекановаякислота 10-Метилундекановая КИСMl. ,

-N-Trp-Asx-Asx-TliP-bBu-OM-Asx-Aeoi-Asx-ue f-Ser-MeGfx-Kyn

..ОН II I С W с; -N -T p-Asx-Ttir- G ev Orn- A3X-A a - Asx - Asx- Ь Eu-Sef - Me К УП Энзимный гидролиз А-21978 факто ра Су при использовании карбоксйпептидазы У подтвердил, что кинуре нин представляет собой С-концевую аминокислоту и С-концевая соон-гру па может этерифицировать гидроксил ную группу треонинового фрагмента. Основываясь на выше приведенных данных, предполагается следующая структура А-21978 С антибиотиков . L-ASPN iL-llaGJu L-ASpD- Ser L-OrnЗИб Gl L;rW (i.-Thr-0 cL-ASp d--ASp f d. - Tlvr в которой 3MG представляет собой L Tpeo-3-метилглютамовую кислоту. Продолжение табл. 1 Реакции деградации Эдмана показывают, что триптофан представляет собой ot-концевую аминокислоту, а фрагмент аспартовой кислоты - следующую соседнюю аминокислоту.. Газово-хроматографическое и массспектральное исследование А-21978 С фактора С2 показывает, что одна из следующих формул может описыв&ть структуру этого фактора (Asx обозначает дспартовую кислоту или аспаргин, а MeGlx - 3-метилглютамовую кислоту Или 3-метилглютамин) а R,- специальный фрагмент жирной кислоты, причем специальные R-rpynпы.А-21978 С факторов имеют следующее значение А-21978 е смеси и факторы (в виде натриевых солей) растворимы вводе и в кислых щелочных растворах за исключением растворов со значениями рИ 3,5,в нижних спиртах, таких как метанол, этанол, пропанол и бутанол, а также в диметнлформамиде, диметилсульфоксиде, диоксане и тетрагидрофуране; но лишь незначительно растворимы или совсем нерастворимы в ацетоне, хлороформе, диэтиловом эфире, бензоле, этилацетате и углеродных растворителях. Солевые формы А-21978 С см1гси и факторов растворимы-в воде, метаноле, диметйлформамиде и диметилсульфоксиде, но не- растворимы в таких растворителях, как этанол, бутанол и диоксан.

В табл. 2 суммирован приблизительный элементарный состав натриевой соли Кс1ждого из А-21978 С факторов ,

Таблица 2

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИЧЕСКОЙ С14ЕСИ; заключающийся в том, что проводят культивирование штамма Streptomyces roseosporus NPPIi 1137 9 в аэробных условиях на среде, содержащей источники углерода, азота в минеральных солей, с последующим выделением отдельных компонентов смёсл.

ИК-спектры A-2l978 С смеси и факторов (в виде Na солей) в таблетках 45 из представлены на фиг. 1-7. . 3 суммированы наиболее значительные абсорбционные максимумы для каждого из этих веществ. Таблиц а 3

Приблизительные молекулярные веса и молекулярные формулы трех основ- . ньзх А-21978 С факторов суммированы

в . 4,. „ « - ,

Т.а б л и Ц а 4

В табл, 5 суммированы абсорбционные максимумы спектров УФ- абсорбции трех основных А-21978 факторов (в форме Na солей) в нейтральном этаноле. .

ТаблицаЗ

Продолжение табл. 3

Продолжение табл.5

30

Ниже суммированы данные электрометрического титрования, определенные в 66%-ном водном растворе диметил;фор амида, для трех основных

А-21978 С факторов и А-21978 С смеси

5 в форме rja соли), рК значения :

С 5,7; 5,9; 7,2; 7,6 С| 5,8; 5,93; 7,6; 7,63 „

5,73; 5,75; 7,54; 7,58

50

Смесь 5,62; 7,16

Все имейт меньшие группы при 11,5-12.

Два определения55 Ниже приведены вращения $.-21978 С факторов (Na соли), totj при определении в воде:

,9(c.0,7; )

+16,9(с.О,)

0

+18,6°(с. О,)

+20,9°(с 0,4;НдО)

+14,8° (с.0,)

4 С5

+17,9(с.О,7;HjO)

65

А-21978 С факторы могут быть разделены методом жидкостной хроматографии при повышенном давлении (HPLC) с использдванием следующих условий:

колонка: стекло, 1 х 21 см;

набивка: силикагеЛь ( Quanti in LP-1);

растворитель: вода: мгетанол: ацетонитрил (95:30:75), содержащий 0,2% уксусной кислоты и 0,2% пиридина;

детектор УФ при 285 нм;

давление 100 фунт/дюйм.

Времена удерживания для А-21978 С факторов (Na соли) суммированы в табл. 6.

Т а б л и ц а б

А-21978 С смесь может бьАгь отделена от факторов А-21978 А, В.и Е при использовании силикагелевой тонкослойной хрома,тографии. Предпочтительной системой рас творит елей, является смесь ай(етонитрил: вода (3:1), а предпочтительным способом детектирования является биоавтографня.

Приблизительные значения Rл (данные хроматографии указанных А-21978 G факторов (в виде Na солей) приведены ниже:

А0,66

С смесь 0,31

D0,51

Е0,48

Факторы А-21978 С смеси могут быть отделены друг от друга с использованием силикагелевой Т С с обратимой фазой (QuantiOT ), Предпочтительная система растворителей представляет собой систему вода:мета- ;: нол:ацетонитрил (45:15:40), которая содержит 0,2 пиридина и О,2% уксусной кислоты. Для детектирования может использоваться длинноволокновый УФ-свет (365 нм).

Приблизительные значения RP А-21978 С факторов (в виде Na с.олейр

в такой системе можно записать следующим образом:

0,71

-0 0,64 С, 0,56

С2 С, 0,47 0,63

-4

Cs0,53

А-21978 С факторы и А-21978 С смесь устойчивы в растворах, имеющих рН 2-9, при 5° и в течение по крайней мере 7 дн. Они неустойчивы при рН равном 11 через 4 ч (полная дезактивация) как при 5, так и при 25°С.

А-21978 С и А-21978 смеси, а также индивидуальные А-21978 С факторы

0 С

G-.

С4 И Cj

способны к

Z Чз

О

образованию солей. Эти соли использу ются, например, для разделения и очистки смесей и индивидуальных факторов. Кроме того, особенно. цейн%1И являются фармацевтически применимые соли, у которых токсичность соеди нения п6 отношению к теплокровным животным не превышает токсичности несолевой формыА

А-21978 антибиотики содержат до пяти свободных карбоксильньюс групп, которые могут образовывать соли, поэтому изобретение охватывает неполные, смешанные и полные соли таких соединений. При получений указанных солейследует избегать значений рН выше 10 из-за неустойчивости антиби. отиков при таких; значениях рН.

А-21978 антибиотики содержат также две свободные аминогруппы и по- этому могут образовывать моно- и дисоли присоединения кислот. Особенно ценньзми являются фармацевтически применимые соли щелочных и щелочноземельных металлов, аммиака, а также, соли присоединения кислот. Примерами таких солей щелочных и щелочноземельных металлов антибиотиков й-21978 служить соли натрия, калия, лития, цезия, рубидия, бария, кальция и магния. Подходящие аминные соли А-21978 антибиотиков включают соли аммония, первичные, вторичные и третичные соли С|.4 алкиламмония, а также гидрокси - С д-алкиламмониевые соли. В качестве иллюстрации аминных солей можно привести ,; полученные по реакции А-21978 антибиотика с гидроокисью аммония, метиламином, втор, бутилаМином, изопропиламином, диэтиламином, диизопропиламином этаноламином, т иэтиламином, З-амкно-1-пропанолом и.т.п.

Соли А-21978 антибиотиков, в которых катионами служат щелочные и щёлочно-земельные металлы,получают согласно общепринятым способам., при меняемым для получения катионных со лей. Так, например, свободно-кислот ную форму А-21978 GJ, растворяют в подходящем растворителе - теплом метаноле или этаноле. К этому раство ру добавляют раствор, содержащий стехиометрическре количество желаемого неорганического основания в вод ном растворе метанола. Полученную таким образом соль можно выделить обычными способами,такими как фильтрация или выпаривание растворителя Соли, полученные с помощью орга нических аминов, могут быть получены аналогичным способом. Так, например газообразный или жидкий амин можно добавлять к раствору А-21978 С факт ра С в подходящем растворителе, таком как ацетон, а растворитель и избыток амина могут быть удалены вьшариванием.. - . Примерами подходящих солей присо динения кислот А-21978 антибиотиков могут служить соли, полученные по стандартной реакции с органической или неорганической кислотой, например соляной, серной, фосфорной, уксусной, янтарной, лимонной, молочной, м.алоиновой, фумаровой, пальмитиновой, холиовой, памовой, слизевой, D-глютамовой, D-камфорной, глю :таровой, гликолевой, фталевой, винной, лауриновой, среариновой, салиц :лов6й, метансульфоновой, бензолсульфоновой, сорбиновой, пикриновой бен войной , коричной и пр. В .вет-еринарной фармацевтии хорош известно, что обычно форма применяе мого антибиотика не имеет решающего значения при лечении животного таки антибиотиком, в большинстве случаев условия, существующие в организме животного, переводят лекарство в фо му, отличную от той, в которой его применяли. Поэтому солевая форма, в которой применяется лекарство, не .имеет существенного значения. Однако солевую форму можно выбирать/ ру ководствуясь соображениями экЪно.мии, удобства и токсичности. ; Идентификация А-21978-производящего штамма. . Морфология культуры А-21978.б, которая образует А-21978 антибиотики, состоит в спорофорах, которые относятся к Rectus Flexibilis классификации. Споровые цепи имеют 10 спор на цепь. Поверхность спор глад кая.. Культура А-21978.б характеризует ся производством главным образом споровой массы красного цвета с красновато-коричневым обратимьол оттенком. Присутствует также светлокоричневый водно-растворимый пигмент. Эти характеристики получены на трех из 14 агаровых сред в чашах (Т5Р#2, ISP#7, ТРО) . Тремя средами являются именно те среды, которые подтверждают обильный воздушный и вегетативный рост. Две .агаровые среды в чащах,15РЙ4 и лглюкоза-испарагйновый агар производят беловато-серую воздушную споровую массу с желтым обратимым оттенком. Водно-растворимого пигмента не наблюдают. Эти две среды демрнстриру-. ют хороший, но не обильный врздушный и вегетативный рост. Используют также девять других агаровых сред, которые ..однако, дают плохой рост или совсем не дают роста и споруляции. Воздушный цвет в том случае, когда он имеется, хртя и является плохим, но ртносится к беловато-серой цветовой серии. Меланоидные пигменты отсутствуют. Основными составляющими клеток стенки являются LL-DAP, глицин, глюкоза и рибоза. Все это указывает на клеточную стенку, относящуюся.к типу 1 и к сахарному образцу типа л C/R (Е. Buchanon,N.E. Gibbons. Бег-, geys Manual of Determinatire Bacteriology The Williams, Wilkins Gom. изд. 8-e, 1974, c. 658. Следующие пять культур сравнив.ают в лабораторных испытаниях с А-21978.6 Streptomyces albovinaceons I Р5136; ATCG.15833 S. candidus I.P5141; ATCC 19891 S. moderatus I P5529; ATCC 23443 S. roseosporus 1 P5122; ATCC 239.58 S. setonii IP5395; ATCC 25497 : Эти культуры принадлежат к белым и красным-цветовым сериям,имеют спорофорную морфологию RF типа/ гладкую поверхность спор и в соответствии с ISP описаниями являются меланин-отрицательными и не имеют отчетливо вы-. . раженного обратимого цвета или воднорастворимых пигментов. Указанные характеристики совместно с образцом для утилизации углерода и другими вторичными отличительными признаками прис.ущи и культуре А-21978.б. При лабораторном испытании этих культур при сравнении с А-21978.б четыре из них дают отрицательные результаты. S. candidus и S. setonii демонстрируют образование желтоватой воздушной споровой массы на многих средах, вследствие чего они отличаются от культуры А-21978.б. S.albo- vinaceons и S. moderatus демонстрируют отчетливый черный обратимый цвет,, образуют водно-растворимые пигменты и производят меланоидные пигменты. Все это отличается от культуры А-21978.б. Согласно предписанию ISP разновидность S. moderatus относит-, ся к красновато-коричневому или темно-коричневому обратимому UBeTyj однако такие характеристики не от сятся к разновидности S. albovlna- ceons. Ни одна из перечисленных цу тур не является меланин-положитель Поэтому культура А-21978.6 бьЗт . классифицирована F lcaode Morias и Dalio Maio в 1961 г Kai гатдмм Streptomyces :ros еовроз цз. Тадая классификация основьшается на срав нении с опубликованными и прямьами лабораторным сравнениями. Следующи культуральные характеристики сумми руют прямые сравнительные исследования. Культуральные характеристики. Морфология. А-21978,6 S, rbseos porus. Спороформы от прямых до гиб ких (RF) без крючков, петлей или спиралей. Цепи из более 10 спор. Поверхность спор гладкая согласно данным, полученным с помощью скани руннцего электронного микроскопа. Споры бт.продолговаты От продолговат овальных; : до цилийдрическ Средний размер 0,85x1,78 М1,01x2,47 Интервал 0,65-0,97x0,97-2,6 М О,97-1,3x1 3,25 М Рост цвет Рост Цвет Возду иный; Серо-морхороший ковная Нет Желто-ic масса ричневы Вегета- Коричне- Хоро- Розовый тивный: вый, ра- ший раствор обильный створимый мый пиг пигмент мент от отсутст- а сутству вует Картофельная масса Воздушный г Серовато- Нет Це: хороший розовый кЬричие Вегетатив Коричне- Сред- то-оран ныйгобиль- вый, тем- ний жевый. но-коричраствормый пиг невый растворимыймент от пигмент сутству ISP 1 (триптон-дрожжевой страктный агар) Воздушный: Белый Плохой Белый (W) а умеренный {W)a ВегетативЖелтова- Плохой Желтов то-зеле- Х10В2) то-зел ный : хороный, ра- ный, ший (10А1) створи- раство мый пиг- римый мент от- пигмен сутст - отсутс вуетвует Рост Цвет Рост Цвет (дрожжево-солодовый экст ракт на агаре J Эоздушный Желтова- Обиль- Оранжев рбильный то-розо- ный желтый (R)5 cb,gy вый (R)Зса Крас нов а-Обиль Вегетативный: обильто-корич-ныйневый, (127)It Оливконый(5DLO) светло- во-кокорич- ричненевыйВЫЙ, пигмент светлокоричневыйрастворимыйпигмент (овсяная мука на агаре) ISP 3 оздушный: Велый Плохой Белый {W)a начителй.ый (W) а ЖелтоегетаЗначи- Бледноивный : ватотельный зеленоррэовый, начивато-сеельный светлорый, (10А2) коричнераствовыйримый раствопигментримый . отсу стпигментвует ISP 4 (неорганические соли крахмал на агаре) оздушный: Белый Хороший Оранжеороишй R)3c2 вато(W) .желтый егетатив- Оранже-Обиль- СероЫЙ1 хоро- вато- ный желтый, ий(10В1) зеле- (1115) раствоный, римый светло- пиплент корич- отсуст . невый вует растворимыйпигмент ISP 5 (глицерин-асцаргиновьй агар) Пурпур- Значи- Белый . но-бе- тельный иачияельый(К):ЗЬа егетатив- ЖелтоХороший Серовато-. (10С2) желтый, ый:хоро- ватоий(ЗВ7) розосветловый, . коричневыйрозовыйрастворимый пиграствориментмый пипчент А-21978.6 ISP#7 (S,roseosporus), (тирозивовый агар) ост Цвет Рост Цвет оздушный: Желтоба- Обиль- Желтовабильный to-розо--ный то-розоR)5fr5«v вый (Н)5св вый егетатив- Краснова-Обйль- Желтоваый: (7Ы2) то-ко- ный то-коричодяфицв- ричневый,(11Е5) невый, ованный телюр-ко- светлоричневый коричйёраство- вый римый раствопигмент римый пигмент Модифицированный агар Беннета 5 Воздушный: Нет Обиль- Желтованетвый то-розо(R)5C8 вый Вегетатив- Желтова- Обиль- Сероватоный:плохой то-ко- ный желтый, п ричневыйI, (110) светлораствори- коричнемый пиг- вый растмент не воримый образует- пигмент ся Кальций-малатннй агар Воздушный: Нет Плохой Белый нет. (W)а Вегетатив- Краснова Плохой Желтованый: зна- то-корич- то-зеле- 20 , чительный невый,ный,желС7Ы2) светло- товатокоричне- зеленый вый раст- раствовОримый римый 25. . . пигмент .шигмент Раствор Чапека на агаре воздушный:.плохой (W) а Белый Нет Вегататив, ный: плохойБелый Нет 30 Растворимый пигмент не образуется Агар Эмерсона Воздушный: плохой Обильный Желто. (R) 5 сЬ ваторозовый 35 Вегетатив- Обильный Желтый, ный:обиль- (1115) светлоный(13Ь6).корич .невый А-21978.6 Рост Цвет РостЦвет Глюкоза-аспаргиновый агар Воздушный: Белый - Значи-Белый 45 хороший тельный (W)b (W)b Вегетатив- Желтый, ХорошийХелтованый: ко- раство-. (12В2)то-зелероший римыйный, 50 (12В2) пигментраствоне обра-римый зуетсяпигмент не образуетсяГлицерин-глициновый, агар Возд1тиный: Обиль-Белый плохой ный(И)Ь Вегета.тив- Зелено- Обиль-Желтый, ный:Обиль- вато- ныйсветло- . ный{8Ы2) коричне- (10ЬЗ)коричне-оО вый,ко-вый ричневыйраствораство-римыйримый пигмент пигмент-65 Воз нет Вег ный хой Рос Воз оби (R) Вег ный ный раство- .. римый , пигмент жи ца Ме IS же (п же IS ISP i Тем вал Питательный агар ушный: Значи- Белый .тельный татив- Желтова- Плохой Желтова:пло- то-серый, то-сераствори- рый, мый пиг- раство мент не римый образу-пигмент етсяне образуетсяЦвет Рост Цвет оматная паста и пшеничная мука на агаре ушный: Желтова-.Обиль- Желтоваьный то-розо- ный то-роэоcb вый (Н)5сЬ ВЫЙ татив- Зеленова-Обиль- Желтова:Обиль- то-ко- нЬй то-корич(8Ы2) ричневый, (12L7) невый, коричне- : коричневый раст- вый воримый растворипигмент мый пигментУтилизация углерода Субстрат А-21978.6 L-Арабиноза -f D-Фруктоза + D-Галактоза, + D-Гдюкоза + 1-Инозит - . Мэннит + D-раффиноза. L-РамнозаСалицин Сахароза D-Ксилоза Примечание, + , полоельное потребление; - - отрн-. ельное потребление. Характеристика А-21978,6 аноидные пигменты: #1(триЬтон-дрожой экстракт) - - нтон-дрожжевой на езистом агаре) - . . 7(тирозиновый агар)-#7 модиф,(13Р#7 минус тирозин) - - Тиразиновая проба - Желатиновоеразжижение + + Действие сня- Незначительный того молока гидролиз Гидролиз крахмала , + + Интервал рН 5-11 5-11 ператур«ыЙ интер, °С25-40. 25-45 Восстановление нитрата - +

Терпимость к действию NaCl рост,до, % 10

- устойчив (зон ингибирования нет). Некоторые характеристики А-21978 производящего S.roseosporus NRRL 11379 штамма- отличаются от карактеристик S.roseosporus. Культура А-21978., б отличается от указанного штамма по размеру спор, росту в мор ковной и картофельной массе, терпимости к NaCl и восстановлению нитрата, Streptomyces roseosporus - культ pa, используемая для получения А-21978 антибиотиков, депонирована составляет часть комплекции сырьево культуры Northern Regional Research Center, U.S. Department of Agriculture. Agricultural Research Serviel Peoria, illinoisi61604, откуда ее б рут для использования под номером 11379. . Как и в случае щ)угих микроорганиэмов, характеристики А-21978-про- изводящей культуры Streptomyces ros osporus NRRL 11379 могут подвергать ся изменениям. Так, например, ис кусственные варианты и мутанты штам NRRL 11379 могут быть получены в;ре зультате обработки различными мутагенами, такими как УФ-обл5таение, рентгеновское облучение, высокочас тотные волны, радиоактивное облучение и обработка химическими веществами. В предлагаемом изобретении можно использовать все природные- и искусственные варианты и мутанты Streptomyces roseosporus NRRL 11379 которые, производят А-21978 антибио Культуральная среда используется для роста Streptomyces roseosporu

Антибиотическая чувствительность антибиотиков представлена в табл. 7,

Таблица7 NHRL 11379 и может выбираться из большого числа сред. Однако в целях экономии производства, получения оптимального выхода и легкости выделения продукта некоторые культуральные среды являются предпйчтительными. Так, например, предпочтительным источником углерода при крупномасштабной ферментации является тапиоковый декстрин, хотя можно использовать также глюкозу, фруктозу, галактозу, мальтозу, маннозу, масло хлопкового семени, метилолеат, глицерин, рафинированное соевое масло и т.п. Предпочтительным источником азота является энзимно-гидролизоваиный казеин, хотя можно применять такж растворимый мясной пептон,, со.евую муку, соевый гидролизат, соевую крупу, дрожжи, аминокислоты, такие как L-аспаргин и DL-лейцин, и т.п. Питательные неорганические соли, которые могут вводиться в культуральную среду, предста вляют собой растворимые соли, способные к образованию ионов калия аммония, хлорида, сульфата, нитрата и т.п. Среди указанных солей особенно полезным для получения антибиотиков является kgSOj,.. Могут использоваться также мелассная золд зольный диализат и синтетические минеральные смеси. Для получения А-21978 антибиотиков предпочитают использовать дистилдировднную или деионизированную воду в ферментационной среде. Некоторые из минералов, содержащихся в водопроводной воде, например, таких как кальций и карбонат, не способствуют получению антибиотиков. В культуральную среду следует так же включать следовые элементы, необходимые для роста и развития организ мов. Такие следовые элементы обычно встречаются в виде примесей в других ингредиентах среды в количествах, достаточных для того., чтобы удовлетворить требованиям роста микроорга-. ниэма. Иногда при крупномасштабной ферментации необходимо добавлять небольшие количества (например 0,2 мл/ антивспенивающего агента такого как полипропиленгликоль, если вспенивание становится проблемой. Для производства значительных количеств А-21978 антибиотиков предпоч тительным способом является погружен ная аэробная ферментация в резерву-аре. Небольшие количества А-21978 ан тибиотиков могут быть получены культурированием в змеевиковой колбе, В связи с запаздыванием времени при получении антибиотика, обычнй связанным с инокулированием больших резервуаров споровой формой микроорганизмов, предпочитают использовать вегетативный прививочный материал, который получают инокулированием He6oJibmoro объема культуральной среды споровой формой мицеллиальных фрагментов микроорганизма с образованием свежей, активно растущей культуры микроорганизма. Затем вегетативный прививочный материал переносят в большой резервуар. А-21978-производящий микроорганизм можно выращивать при температуipax, лежащих в интервале 20-37°С. Оп тимальное получение А-21978 С имеет место в температурном интервале 30-32 С. Kai правило, в процессах аэробной погруженной ферментации культуральной среды через нее диспергируют стериль ный воздух. Для эффективного произ- . водства А-21978 ан-рибиотиков процент насыщения воздухом при. проведении процесса в резе звуаре должен иметь значение выше , предпочтительно выше 30% (при 30°С и давлении равном 1 атм). При ферментации в резервуаре пред ;почитают поддерживать уровень рН в ферментационной среде в интервале 6,5-7,0, Такое регулирование может достигаться в результате добавления соответствующих количеств, например, ГИДРООКИСИ натрия (на ранних стадиях цроцессд) и соляной кислоты (на более поздних стадиях). 3 цолученкем А-21978 антнбиотиков в ходе ферментации можно следить путем испытания образцов бульона или экстрактов твердого мицеллия на антибиотическую активность против микроорганизмов, чувствительных к деист ВИЮ антибиотиков. Одним из микроорганизмов для испытания таких антибиотиков, является Micrococcus luteus. Биологический анализ предпочтительно осуществляют при использовании бумажно-дисковой методики на чашах с агаром. . После получения в условиях погруженной аэробной ферментации А-21978 антибиотики могут быть вьщелены из ферментационной среды известными в области способами.Антибиотическая активность, полученная в ходе ферментации А-21978-производящего, обычно содержится в бульоне. Поэтому максимум регенерации А-21978 антибиотиков достигается в результате первоначальной фильтрации с целью удаления мицелиальной массы. Отфильтрованный бульон может быть очищен различными способами с образованием А-21978 смеси. Предпочтительный способ заключается в экстракции и осаждении с образованием А-21978 смеси. Дальнейшая очистка и разделение А-21978 С смеси и индивидуальных А-21978 С факторов заключаются в дополнительной адсорбции и экстракции. Подходящий адсорбционный материал для очистки А-21978 С смеси и факторов включает анионообменные смолы: сильноосновные (полистирол, Био-РаД AG 1 и 2, Био-Рекс, Дауэкс 1 и 2, Амберлит 1RA 400, 401, 410) умеренноосновные эпоксиполиаминные (БиоРекс 5 и Дуолит АЗОВ) и слабоосновные полистирольные или фонрльные полиамины (Био-Рад AG3, Дуолит А-б, А-7, Амберлит 1RA.68, 1R 45, 1R 4В), силикагель, флоризил, полимерные адсорбенты (XAD 2 и 4), высокопорИстый полимер (Диаион НР-20). Сефадекс G-10, G-25 и G-50, Био-Гель Р-2 и Р-10, обратимо фазовые смолы (сили.кагель С-JQ и Сд), углерод, ДЕАЕ целлюлоза и ДЕАЕ Сефадекс, полиамид, окись алюминия и микроцеллюлоза. Источники: био-Рад и био-Гель смолы - Био-Рад лаборатории. Ричмонд, Калифорния; амберлит и XAD смолы Rohra and Haas Со Филадельфия, Ра.; дуолитные смолы - Diamond Shamrock Chemical, Redwood City, Cal.; ceфадексовые смолы - PharmaciaFine Chem., AB, Uppsala Sweden; дуоксовые СМОЛЫ- - Dow Chemical Co., Midland, Mich.; Диаион - Mitsubishi Chemical Industies Ltd., .Tokyo, Japan. XAD смолы, силикагель и Сд - E Merck. Darrastadt, Germany. С другой стороны, культуральные твердаю вещества, включающие компоненты среди и мицелия, могут-использоваться без экстракции и разделения, но предпочтительно после удаления воды, в качестве источника А-21978 антибиотиков. Так, например, культуральную среду можно сушить лиофилизацией

и непосредственно смешивать в промиксе.

А-21578 смесь и индивидуальные А-21978 С факторы всегда находятся в виде соли натрия. А-21978 и А-21978 С смеси и индивидуальные А-21978 С антибиотические факторы Со, C-f, Cg/ €4 и С ингибируют

. NT

не испытаны. Минимальные ингибиторные концентрации, при которых А-21978 С смесь „ н ппиппнмв А -Р1Ч7Я С Лятгтоои иирнйи- И основные А-21978 С факторы ингибиОдним из важных аспектов иэобре- в табл. 10 суммированы значения

тения является тот факту что А-21978МИК (разбавлением на агаре)А-21978 С

антибиотики ингибируют рост микроор-факторов Сд, С.|, С2, Cj, С и Cj проганиэмов, являющихся устойчивыми по 60тин некоторых микроорганизмов при исотношению к другим антибио-пользовании методик разбавления на

тикам.агаре (10).

рост некоторых патогенных микроорганизмов, odo6eHHo грамположительных бактерий. Минимальные ингибируювдие концентрации (МИК), при которых А-21978 факторы и А-21978 С смеси ингибируют выбранные бактерии согласно установленному стандартному испытанию разбавлением на агаре, суммированы в табл. 8.

Та-9лица8

Таблица 9 руют некоторые бактерии согласно испытанию разбавлением на агаре, суммированы в табл. 9. попянн п тяйп О А-21978 С антибиотики также ингибируют рост некоторых аэробных бактерий. В табл. И суглмированы активности А-21978 С смеси и А-21978 С

Symbio-

128

necrop 4

A-21978 С факторы демонстрируют in vivo антибактериальную активность против экспериментальных бактериаль-: с ных инфекций. В том.случае, когда две дозы испытуемого соединения применяют на г плшак, иллюстрирз ющих инфекции, наблюдаемую активность измеряют как EDj-0 значение (эффективная

0,220,13 0,0б4 93

21978 С

0,5 21978 Cj

0,160,13 0,032 59

0,13 21978 С,

0,06

0,080,06 0,032. 66

V4

16 32

128

128

.

Наблюдаемые значения EDg-o для . А-21978 С смеси и А-21978 С факторов С, С, Cj, С, и С представлены в табл. 12. ..

Т а б л и %а 12

0,130,3

0,130,14

0,030,09 факторов С, С / и С против различных анаэробных бактерий при использовании стандартного испытания разбавлением на агаре. , . Таблица .11 Й1ЮС, мг/мл, разбавление на ага МИК, подкожное применение, МИК, оральное применение, А-21978 С факторы и А-21978 С смесь являются эффективными агентами для лечения пиелонефритов. Так, напри 4ер, при экспериментальном передаваемом йо наследству заражении пиелонефритом у крыс А-21978 факторы обеспечивают защиту от указанного заболевания, которая превосходит действие ваномицина, В даннсад случае применяют бактериальную кулЬ туру Streptococcus faecal is (G.UIE) , которуй выращивают на Trypticase соевом .агаре (BBL),. суспендируют в сердечно-мозговом бульоне ;1ля влйванИя (BBL)V взятом 0,2 глл порциями и замороженном в жидком азоте. Бактериальные суспензии для инокулирования крыс готовят ежедневно путем засеивания 60 мл колб Trypticase соевым бульоном (BBL) из замороженных ампул и выращиванием культуры в течение ночи при при встряхивании. Культуру разбавляют до кон центрации 5 -10 колоний-образующих единиц на 1 мл. Испытуемые соедине- ния вводят подкожно раз в день в те чение 7 дн. Все соединения суспендируют в О,125%-нЬм растворе карбоксиметилцеллкшозы. Экспериментальное инфицирование крыс проводят по следующей методике Самок случайно подобранных белых крыс (Coxr-wistar) весом 190-210 г анестезируют путем внутрибрющинной инъекции 12т метогекситала натрия. Экспериментальную модель пиелонефрита основывают на исследовании Guz и Buson, согласно которому левый мо

Продолжение табл. 12

четочник закупоривают на 20 мин, после чего в бедренную вену вводят 0,5 мл испытуемого организма, АнтимиКробиальную терапию начинают через 4-5 ч после инфицирования. Через 4 ч после последнего лечения крыс умертвляют и левукз почку удаляют и гомогёнизир5гют в диспергирующем устройстве Dual1, содержащем 9 мл физиологического, раствора. Такая обработка представляет собой 10 разбавление ткани почки, ДополНит ельное десятикратное разбавление основано на ожидаемом количестве бактериалзьных клеток, прНсутствующих в ткани гсдакэгената. Наконец, некоторые образхщ сделанных разбавлений помещают на дублированные чаши с агаром, которые инкубируют в течение ночи при 37°С, Терапевтические результаты выражают двумя путями: (i) процентом крыс, почки которых насчитываю т менее 10 на 1 г почечной ткани, обозначаемые как вылеченные. , и.(ii) процентом крыс с по крайней мер 4-1од д понижением бактериального тнтра по сравнению с инфицированными контрольными почками Контроль ньос крыс обрабатывают 0,125%-ным раствором карбоксиметйглцеллюлозы. Число жизнеспособных клрток почечной ткани у контрольных крыс 3араженных S. faecalis, дежйТ в интервале 1,,6x10 на 1 г гомогенизированной ткани, Результаты данных исследований суммированы в табл. 13.

; vitro восприимчивость S. faecal is Guze штамма. Подкожное применение. Данные по токсичности основных А-21978 С факторов и А-21978 С см суммированы в табл, 14/ Т а б л и ц а 14

Cl 250

479±32д

365

С 150-250 175 204±17

Сз 50

70-75 160

175-190 169+10 150

В том случае, когда в качестве антибактериального агента используется А-21978 С смесь или Д-21978 С фактор, последние можно применять

Контроль А-21978 С

25

Т-а блица 13

новании значения МИК и ED

а также

50

данных по токсичности, рассматриваемых совместно с такими факторами, как пациент или хозяин, а также инфицирующий микроорганизм, А-21978 антибиотики могут использоваться также в качестве агентов, промоти5 рующих рост животных, Так, например, у цыплят А-21978 смесь увеличивает прирост веса и эффективность потребления пищи, В табл 15 суммированы результаты двух испытаний, демон0 стрирующих такую активность,

Таблица 15

1,,773

- 734

1,80 1,741 4,10 750 орально или парентерально.А-21978 С смесь или фактор обычно может применяться совместно с фармацевтически применимым носителем или разбавителем. Дозировка А-21978 С смеси или фактора зависит от большого числа обстоятельств, таких-,например, как природа и тяжесть особого инфицирования, подлежащего лечению. Соответствующие дозированные интервалы и/или дозировочные единицы для применения морут быть определены на ос31примечание. Значение в обработке значение контроля

В данных испытаниях А-21978 С смесь вводят в пищу животных с концентрацией 25 г/т пищи. Антибиотик дают четырьмя повторени:ями восьми птицам, при этом каждой проводя;г дублированное изучение во времени по сериям (всего восемь повторений на восьми птицах или 64 птицы). Пе риод испытаний составляет 21 день от 7 до 28 дня жизни птицы. Данные по повышению эффективности роста (прирост веса, потребление пищи и эффективность питания) сравнивают b данными, полученными при 40 повторениях одновременной контрольной обра,брхки, .

Обычно А-2197S антибиотики эффективны при промотировании роста домашней птицы в том случае, когда, их применяют совместно с пищей животных в количестве 1-100 г А-21978 антибиотика на 1 т пищи животного.

При м е р 1; Ферментация А-21978 С в колбе со встряхиванием Лиофилизированную гранулу Streptormyces rbseosporus NRRL 11379 растворяю:Т в 1-2 мл стерилизованной вoдЫ Полученный раствор используют для инокулиррвания косого агара, имеющего следующий состав ,.%: Глюкоза .0,5

Дрожжевой экстракт 0,2 CaCOj0,3

Овощной сок 20,0 Агар2,0

Неустановленное значение рН равно 6,1; значение рН после автоклавного процесса 5,9.

У/8 ,сок, Campbell Soup Go.. Инокулированный скос инкубируют при в течение 70 дн. Зрелую культуру на косом .агаре заливают стерильной деионизированной водой (10 мл) . и отскабливают стерильной пипеткой для того, чтобы ослабить споры. Часть (1 мл) полученных в результате суспензии спор используют для инокулирования вегетативной среды, имеющей следующий состав, % Trypticase соевый бульон 3,0 . , Декстрин 2,5 Вода (деионизированная)

Baltimore Biological Lab,, Cocheuville, Md.

32

1071226

Продолжение табл. 15

Инокулированную вегетативную, среду инкубируют в 250 мл эрлен мейровской колбе при 30°С в течение 48 ч во встряхивающем устройстве, вращающемся через дугу диаметром 5 см со скоростью 25.0 об/мин.

Такую инкубированную вегетат.ивную среду (0,5 мл) используют для 0, инокулирования 50 мл продукционной среды, имеющей следующий состав,г/л: Глюкоза7,5

Тапиоковый декстрин 30,0 Энзиматический гидролизат 5 казеина.5,0

Энзимно-гидролизованньгй .казеин 5,0

K2SO4.17,4

Аспарагин безводный 1,320 Деионизированная вода- До 1 л Stadex 11, А.Е. S.taley, Со,

Decatur, III. NL Amine А, Sheffild Chemical

Co, N.I.

5 Amber EHC, Amber Lab., luneau, . Wise.

Инокулированную продукционную среду инкубируют в 250 мл эрленмейеровскрй колбе при 30°С в течение

0 ДН, в шейкере, вращающемся через дугу диаметром 5 см со скоростью 250 об/мин.

П р и м е р 2, Ферментация в резервуаре А-21 978 С, с тем, чтобы

с получить больший объем прививочного материала, 10 мл инкубированной вегетативной среды используют для .инокулирования 400 мл среды во 2-й стадии вегетативного роста, имеющей тот же состав, что и вегетативная

0 среда. Такую среду ча 2-й стадии инкубируют в 2 л колбе в течение 48 ч при в шейкере, вращающемся через дугу диаметром 5 см со скоростью 250 об/мин,

5 Инкубированную вегетативную среду на 2-й стадии роста (800 мл), йспользуют для инЬкулирования 100 л .стерильной продукционной среды, имеющей тот же состав, что и в приме0 ре 1. Инокулированную продукционную среду, ферментируют в 165 л ферментационном резервуаре в течение 6-8 дн. при . Ферментационную среду аэрирую.т стерильным . воздухом

5 пйд давлением 1 атм с тем, чтобы улучшения. поддерживать 30%-ное насыщение воэ,духом при перемешивании общепринятыми мешалками со скоростью 200300 об/мин. Разделение А-21978 С антибиотической смеси. Весь ферментационный бульон (1600 галлонов), полученный по при:меру 1, фильтруют на фильтровальном прессе с использованием 3% фильтрующего средства (целит 545, lohns Manville). Осадок на фильтре промывают водой с образованием филь трата в количестве 4100 л, имеющего концентрацию 230 ед./мл, рН фильтра та поддерживают равным 3,5 с помощь НС1 и подкисленный фильтрат вццерживают при комнатной температуре в течение 16 ч с целью осаждения активных факторов. В суспензию добавляют фильтрующее средство (0,75% це лита 545), полученный осадок отделя ют фильтрацией. Осадок на фильтре экстрагируют дважды 410 л метанола, каждый раз перемешивая в течение 1 перед фильтрованием. К объединенным метаМольным экстрактам (720 л) добавляют воду (0,1 объема .или 72 л). рН этого раствора поддерживают равным 6,5-7,0 с помощью NaOH. Получен ный раствор концентрирую в вакууме до 1/20 объема (30 л) с целью удаления метанола, в концентрирования по мере надобности добавляют дистиллированную воду. При перемешивании добавляют н-бутанол (3/4 об ема или 22 л). рН полученного в результате раствора поддерживают равным 3,0 с помощью НС1, фазы разделяют, и и-бутанольную фазу, содержащую активность, концентрируют в вакууме до остатка. Этот остаток раст ряют в минимальном количестве метинoлaf метанольный раствор добавляют в ацетон (30 объемов с целью осаждения основной части А- 21978 С, Осадок отделяют.фильтрацией и сушат с образованием 247 г сьарой А-21978 С смеси (780 ед,/мг). Метанолацетоновый фильтрат, содержащий оставшуюся часть А-21978 смеси (фактор А и В), концентрируют до остатка, который растворяют в трет-бутаноле: (5:1) и сушат на холоде с образованием 169ГА21078 сМеси. Примерз. Очистка А-21978сХ: смеси. Сырую А-21978 смесь (734 г), полученную по примеру 2, суспендируют в воде (25 л), рН суспензии устанавливают равнЕЛЛ 6,5 с помощью 5 н, NaOH с тем, чтобы полностью растворить материал. Этот раствор пропускают через колонку, содержащую 27 л ионообменной среды (ацетат ный цикл смолы (IRA-68, Rohm Haas Со).. Колонку промывают водой (4 объ ема или 108 л) и затем 0,1 н. уксусной кислотой (5 объемов или 135 л) . Активный материал элюируют 0,5 н. уксусной кислотой, собирают приблизительно 120 л фракции и каждую из них испытывают на биологическую активность. Высокоактивные фракции-объединяют и сушат на холоде с образованием 278 г А-21978 смеси, имекяцей коричневую окраску (1100 ед./мг). Фракции, имеющие низкую активность, объединяют с образованием 238 г коричневой А-21978 С смеси (880 ед./мг1 Дальнейшая очистка А-21978 С смеси. Часть более активной А-21978 С смеси (150 г), элюированной с колонки с IRA-68, суспендируют в воде (600 мл), рН поддерживают равным 6,5 с тем, чтобы полностью растворить суспендированный препарат, и добавляют достаточное количество сухого силикагеля (Grace, сорт 62) с тем, чтобы абсорбировать водный раствор. Такой влажный силикагелевый препарат помещают в 30 л.силикагелевую колонку (Grace 62,10x375 см), обработанную ацетрнитрйлом(силикагель предварите.льно промывают водой с целью удаления мелких частиц, затем колонку набивают силикагелем, суспендированным в воде, и силикагелевую колонку промывают 30 л ацетонитрила), После нагрузки колонку промывают ацетонитрилом (15 л), затем проявляют смесью ацетонитрил: вода (4:1) и собирают 4 л фракции, За ходом элюирования следят с помощью биологического анализа, снимая силикагелевую тех (СН ) биоавтограмму. Фракции, содержащие лишь А-21078 С смесь (фракции 43-60), объединяют, концентрируют в вакууме и сушат на холоде с образованием 86,2 г желтоватого очищенного А-21978 С комплекса (1160 ед./мг). Фракции , содержащие факторы D и С, объединяют и сушат на холоде с Ьбразованием 13 г желтоватого порошка, обладающего низкой биологической активностью. Полученную таким образом очищен- ную А-21978 С смесь (30 г) подвергают дополнительному обеспечиванию путем суспендирования 30 г смеси в минимальном количестве воды и .смешивания с небольшим количеством ёиликагеля-(тип Р-1, 10-20 мкм Quantmn Industres, 341, Kaplan Drive, Fairfield, N.I. 07006) с целью абсорбции раствора. Влажную силикагелевую смесь суспендируйт в смеси ацетонитрил: метанол (4:1) и заполняют ею стеклянно-свинцовую колонку{внешний диаметр см), присоединенную к стеклянной колонке (внешний диаметр 4x30 см), содержащей 2,8 л силикагеля. Суспендированный в смеси ацетонитрил: метанол (4:1) силикагель предварительно промывают водой и затем смесь

ацетонитрил: метанол (4:1). Колонку заполняют силикагелем в смеси ацетонитрил: метанол (4:1) при давлении 50-60 фунт/дюйм. Свинцовую и основную колонки промывают 3 л смеси ацетонитрил:метанол (4:1) под давлени- 5 ем 50 фунт/дюйм. Активный материал элюируют смесью ацетонитрил:метанол: вода (55:20:25) и отбирают 300 мл фракции. За ходом элюирования еле- , дят по данным биологического анализа Ю (Micrpcoccus luteus). Фракции 14-25, обладающие наивысшей активностью, объединяют, концентрируют и сушат на .холоде с образованием 24 г светложелтой, чистой смеси А-21978 С в ви- «с де натриевой соли (1200 ед./мг). Менее активные фракции 26-32 объединяют, концентрируют и сушат на холоде с образованием 1,6 г менее чистой А-21978 С смеси (780 ед./мг).

Разделение А-21978 С факторов. Очищенную А-21978 С смесь (2 г), полученную по примеру 3, растворяют в воде (40 мл) и прокачиванзт через цасос (FMI, LAB Pump, Fluid Metering,Jnc. 48, Summit, N.I. 11771) под давлениен 60 фунт/дюймов колонку 4,1 X 60 см с обратимой силикагелй вой фазой Quantmn LP -1 силикагель (С д), находящуюся в системе вода:метанол: ацетонитрил (100:15:85), со- 30 держащей 0,15% уксусной кислоты и 0,15% пиридина. Эту колонку проявляют под давлением 65 фунт/дюйм растворителем, отбирая при этом 25 мл фракции. За злюированием фак- 35 торов следят по данным УФ-спектрОскопии при длине волны 280 нм и с помощью биологического анализа. ,Инди- 1 видуальные фракции анализируют на аналитической колонке на чистоту фак-ДО тора.

Данные типичного, разделения следующие: фракции содержат фактор С, фракции 45-53 - фактор С, : 45 фракции 75-92 - фактор €, фракцш 112-134 - фактор Cj, фракции 54-74 - . факторы С, С2 и Cj, а фракции 93111 - факторы С2, Cj и Су. Фракций, содержащие смешанные факторы, повтор-,/, но пропускают через колонку с целью получения дополнительных количеств факторов . Фракции, содержащие единственный фактор, объединяют, . концентрируют в вакууме и сушат н-а .. холоде с образованием светло-желтых порошков каждого из факторов (в ни- . де Na солей). Из 60г смеси получают следующие выходы: фактор С 5,55 г; фактор С2 10 г г Фактор С 6,61 г. Фракций, содержащие смешанные фак- 60 торы, рециркулируют через колонку с ионообменной смолой с обратимой фазой и образованием дополнительных выходов: фактор Со 550 Мг; фактор С-, .1,29 г; фактор С 1,99 г; фактор 65

С, 443 мг; фактор С4, 512 мг; фактор Cj 384 мг.

Крупномасштабная очистка и разделение А-21978 С факторов.В более крупном масштабе факторы разделяют обратимофазной ко.лончатой хроматографией. Чистую А-21978 С смесь (6 г), полученную по примеру 3, растворяют в воде (80 мл), рН раствора устанавливают равным 4,4 с помощью уксусной кислоты и добавляют тетрагидрофуран (20 мл). Полученный раствор прокачивают при пониженном давлении (Lapp Pump) через стальную колонку (4,8 X 100 см), содержащую 1,77 л силикагеля (C gtQuantxom LP-1, 10-20 мкм, силилированный с помощью октадецилтрихлорсилана) в систетле вода:тетрагидрофуран (ТГФ) (4:1) . Такую колонку проМывают под давлением около 100 фунт/дюйм на 150 мл Н ОгТГФ (4:1).. Колонку элюируют смесью вода:метанол:ацетонитрил (47,5:15:37,5), содержащей 0,2% пиридина и 0,2% уксусной кислоты под давлением около 100 фунт/дюйм, при скорости потока равной 35 мл/ми отбирая при этом 175 мл фракции. Элюирование непрерывно регистрируют на записывающем устройстве с помощью УФ-детектора при длине волны; 280 нм. Фракции, содержащие индивидуальные факторы согласно пикам на графике, дополнительно анализируют на аналитической колонке с обратимой фазой. Фракции, содержащие один фактор, объединяют и сушат на холоде. Типичный опыт имеют следующие результаты: фракции 12-16 содержат фактор Со, фракции 20-26 - фактор С фракции 38-50 - фактор С2, а фракции 63-78 - фактор Cj. Фракции 2737, содержащие факторы С и С, и фракции 51-62, содержащие факторы С и Cj, рециркулируют и через колонку с целью получения чистых факторов С4 и С. нагрузки составляют 612 г. Из А-21978 С смеси получены .следующие выхода1,г: С 1,9;С 3,27; С2 4,97; Сд 1,94. Повышенные выходы индивидуальных факторов получают рециркуляцией фракций, содержащих смешанные факторы, при использовании соответствующих HPL С растворительных систем. Выбор.систе изменяется к зависит от индивидуальных групп, а также от природы обратмофазной смолы и колонок.

Ниже представлены системы, исползуемые для разделения А-21978 С факторов.

Аналитические системы.

Вода: метанол: ацеТонитрил (50 : 15 : 35), содержащая 0,2% уксусной -кислоты (НОАс), поддерживаемая на значении рН 5,5 с помощью пиридина. Вода: метанол: ацетонитрил (50 : 15 : 35), содержащая 0,2% НОАс и 0,20% пиридина. Вола: метанол: ацетонитрил (50 : 15 : 35), содержащая 0,55% формиата аммония. Вода: метанол: ацетонитрил (95 : 30 J 75), содержащая 0,2% НОА и 0,2% пиридина; . Вода: метанол: ацетонитрил (105: 15: 80), содержащая 0,2% НОА и 0,2% пиридина а Вода: Метанол: ТГФ (99: 15: 25) содержащая 0,5% НОАс и 0,5% пириди Вода: метанол: ТГФ (60: 15г 25) содержащая 0,5% формиата аммония, Препаративные системы. Вода: метанол: ацетонитрил (95: 20:85), содержащая 0,15% НОАс и 0,15% пиридина. Вода; метанол: ацетонитрил (100: 15: 85), содержащая 0,15% НОАс и 0,15% пиридина.Вода: метанол: ацетонитрил (50: 10: 40), содержащая 0,1% НОАс и Оf1% пиридина. Вода: метанол: ацетонитрил (50: 15: 35), содержащая 0,75% формиата аммония. Вода: метанол: ацетонитрил (55; 10; 35) , содержащая. 0,2% НОАс и 0,8% пиридина. Вода: метанол:ТГФ(52,5:15:32,5) содержащая 0,6% формиата аммония. Вода: метанол: ТГФ(50: 15: 35), содержащая 0,6% формиата аммония. Преимущество системы уксусная кислота (пиридин по сравнению с фор . миатом аммония) заключается в том, -,что первая может быть удалена в хо де сушки вЕлмораживанием, тогда как формиат аммония следует удалять ксРлонной хроматографией (Сефадекс С-25). . Переменное удаление А-21978-С смеси. Весь ферментационный бульон (97 л), полученный по примеру 1, фильтруют с помощью фильтрующего средства (Гифло Супер-гель). Полу ченный в результате фильтрата раст вор (80 л) перемешивают с 2 л неион ного .макропористого сополимера сти рола, поперечно сшитого с дивинилбензолом НР-20 (ионообменная смола. Mitsubishi Chem. Ind, Lim, (Токио, Япония) в течение 2 ч. Верхний слей декантируют, полученную смолу промывают водой (8 л) ,, а воду также де каптируют. Затем смолу перемешивают с 8 л смеси ацетонитрил: вода (15:8 в течение 15 мин, а растворитель удаляют фильтрацией. Затем А-21978 смесь элюируют со смолы путем перемешивания с 8 л смеси ацетонитрил: вода (2:3) в течение 1 ч и фильтруют. Такую методику повторяют до пол ного удаления А-21978 С смеси. Указанные два фильтрата объединяют и концеггтрируют в вакууме до образования масла. Полученное масло растворяют в минимальном объеме воды, добавляют метанол (2 объема) при назревании, а затем - ацетон (30 объемов) для осаждения А-21978 С смеси.Осадок отделяют фильтрацией и сушат в ваккуме с образованием 13,6 г сырья А-21978 С смеси (570 ед./мг). Сырую А-21978 С смесь очищают силикагелевой колонной хроматографией. Полученную смесь (1 г) растворяют в минимальном количестве воды, силикагель (Grace-62) добавляют для абсорбцииводы, абсорбент шламуют в ацетонитриле. Полученный шлам пропускают через колонку 1,5x40 см с силикагелем (Grace-62) в ацетонитриле. Затем колонку промывают ацетонитрилом. Активность- элюируют смесью ацетонитрил: вода (4:1), отбирая 25 мл фракции. Фракции анализирунзт аналогично примеру 3. Фракции 21-46f содержащие большую часть А-21978 С смеси, объединяют, концентрируют до небольшого объема в вакууме и сушат на холоде с образованием 605 мг очищенной А-21978 С смеси (Na соль) (900 ед./мг). Получение А-21978 С смеси (кислотная .форма) . А-21978 С смесь в виде соли натрия (7 г) растворяют в воде (150 мл) и добавляют н-бутанол (150 мл). рН раствора поддерживают равным 3,4 с помощью 2 СН2 при перемешивании в течение 1 ч. н-Бута-нольную фазу отделяют и концентрируют до получения остатка в BaKys Me Полученный остаток растворяют в воде и сушат на холоде, с образованием б г А-21978 С смеси (кислотная форма) , Индивидуальный А-21978 С фактор в виде соли пр евращают в соответствующие кислотные формы по такой же методике. ; Получение А-21978 С смеси в виде натриевой соли из А-21978 С смеси в кислотной форме. А-21978 с смесь в кислотнойформе (50 мг). растворяют в теплом абсолютном этаноле (5 мл), по каплям доба вляют 1 н. раствор NaOH до достижения раствором рН равного 9,4. Полученный в результате раствор выдерживают при комнатной температуре в течение ночи. Затей осадок фильтруют и сушат в вакууме с образованием 32 мг А-21978 С смеси (натриевая фо.рма) . Полученная соль содержит 8% натрия согласно атомнобсорбционному анализу. Используя методику, указанную ыше, А-21978 С смесь в виде соли альция получают добавлением CaCljj этаноле к этанольному раствору -21978 С смеси в кислотной форме. Микробиологический анализ А-21978 ерментационных и вьщеленных образов. Для количественного определения активности А-21978 в ферментационном бульоне и в выделенных образцах используют систему бумажных дисков для определения диффузии на агаре при применении Micrococcus tu teu5.

Засеянные агар-диффузионные чаши готовят путем инокупирования питательной агаровой среды соответствующей концентрацией испытуемой культуры, переливая 8 мл агара в каждую из пластмассовых чаш Петри (20 х X 100 мм).

Ссылочным стандартом этого анализа служит получение А-21978 .5

100 W SB W 20

то 3500 то 25оо 2ооо im шо то IIQQ юоо 900 soofoozso

5 6 7 81910 izmeismsmo

100 80

SO 40 20

3500 3000 2500 20001800 тОШО WO WOO 800 600 t00250

си, которое используют в расчете на единицу активности. Высокоочищенная А-2197 В смесь содержит около 1250 ед,/м. В результате получают кривую отклику стандартной дозы, содержащей 150-75-40-20-10 ед./мл. В качестве разбавителя для стандарта и образцов прИМбняют 0,1 М Фосфатный буфер, имеющий рН равный 6,0.

Растворы образца и стандарта переносят на 12,7 NIM бумажные диски с помощью автоматической пипетуи. Инкубирование проводят при в течение 16-18 ч.

S 7 8 3 1012 п ismmmo

(

(pUf: 2

фие.З (CM-t)

100 80

SB

w

20

o 3500 3000 2SOO 2000 mo 1SO014001100 1000 800 SOO 400250 . IPU{. 4

- t

(cM-f}

3f 5 6 7 8 3 10 1г 1lHSm0253010

1 I r I I 1 I ;

ШО 3500 woo 2500 20001800160014001200.1000 fpus. 5

100 80 SO 2Q

mo 3500 mo 2500 20001500 tm mo im woo soo soo 400250

Фиг.е.

800 f 00

(CM-}

ff 7 8 ff Ю12 n 1Sl8202Sm5

(CMf)

ч 5

г.5 3

юо

80

so w

20

s 7 8 9 JO 12 n кпго25зо о

-1111-т111 II I J

0.

woo 3500 3000 2500 20001800 mO W012001000 SOO f 00100250

фиг. 7