1
Изобретение относится к микробиологии и касается получения антибиотиков .
Предложенный антибиотический комплекс новый и способ его получе- НИН в патентной и научно-технической литературе не описан.
Целью -изобретения является получение антибиотического комплекса А-35512.
Эта цель достигается тем, что штамм Streptomyces candidus NRRL 8156 выращивают на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, в аэробных условиях с последующим выделением комплекса и/или разделением его на отдельные компоненты.
Штамм Streptomyces candidus NRRL 8156, который используют для получения антибиотического комплекса, был извлечен из образцов почвы, собранной на атоле Эниветок и хранится в коллекции культур Северного Регионального исследовательского центра США под номером NRRL 8156.
Штамм имеет следующие культурально-морфологические признаки.
Спорофоры удлиненную волнистообразную форму. Споры образуют
цепочку из 10-50 спор, имеют цилиндрическую форму, размеры могут изменяться от 0,7 до 1,05/xj- 1,4 до , 3,5|u. На среде для выращивания образуются сплошные и плотные структуры.
Солодово-дрожжевой агар. Интенсивный рост. Субстратный мицелий-изменяющийся серовато-желтый цвет, обильный воздушный мицелий и образование
10 спор, белый. Пигмент нерастворимый.
Овсяный агар. Умеренный рост, субстратный мицелий - изменяющийсябледно-желто-зеленый, светлый воздушный мицелий и спорообразование.
15 Пигмент нерастворимый. Наблюдается образование сплошных структур.
Агар Эмерсона. Рост хороший. Субстратный мицелий - изменяющийся светло-оливковый воздушный мицелий от20сутствует, пигмент растворимый, светло-коричневый, спорообразование отсутствует.
Агар Беннета. Рост интенсивный. Субстратный мицелий умеренно желтый,
25 обильный воздушный мицелий и спорообразование, белый, пигмент нерастворимый .
Агар Чапека. Рост хороший. Субстратный мицелий бледно-желто-зеленый
30 .хорошо развитый воздушный мицелий
и спорообразовагше, белый, пигмент . нерастворимый, образующийся мицелий окружен ворсинками
Лгар из томатной пасты и овсяной муки. Интенсивный рост, субстратный глицелий серовато-желтый, обильный воздушный мицелий и спорообразование,, белый, пигмент нераствори ф й.
Питательный агар. Рост умеренный, .субстратный мицелий - изменяющийся бледно-желто-зеленый, хорошо развитый воздушный мицелий и спорообразование, белый, растворимый пигмент светло-коричневый,
Тирозиновый агар. Рост хороший, субстратный мицелий белый, хорошо развитый воздушный мицелий и спорообразование, белый, растворимый коричневый пигмент, наблюдается образование сплошных структур.
Физиологические свойства.
Молоко коагулирует в течение 14 дней. Нитраты восстанавливает. Меланин не образует, йселатину разжижает. Хорошо растет и образует споры при 26-30°С. Усваивает глюкозу, инозитол, Д-маннитол, фруктозу, ксилозу. Не усваивает арабинозу, сахарозу, рамнозу, раффинозу.
Среда для выращивания продуцента антибиотика может быть различной. В качестве источника углерода использу рт сахарозу, глюкозу, декстрин, фруктозу, маннитол, мальтозу, лактозу. В качестве источника азота испол зуют мясной пептон, муку соевых бобов, муку, изготовленнуюиз крови свиньи, аминокислоты, такие как глутаминовая. В питательную среду можно вносить неорганические соли, такие как хлориды, карбонаты, сульфаты, нитраты цинка, натрия, магния, кальция, аммония. В среду можно включать микроэлементы, необходимые для роста и развития микроорганизмов,
В процессе ферментации при образовании большого количества пены можно добавить небольшое количество (например, 0,2 мл/л) агента, подавляющего образование пены, такого как полипропиленгликоль,
Выращивание продуцента ведут в аэробных условиях. Вегетативный прививочный материал готовят при помощи прививки в небольшом объеме cpepf для выращивания культуры споровой формы.- Вегетативный прививочный материал затем переносят в резервуар) -больших размеров.
Штамм, продуцирующий антибиотический комплекс, выращивают при 20-40°С, предпочтительно при 30-34с
При погруженном выращивании культуры в аэробных условиях через среду продувают стерильный воздух.Для эффективного роста культуры в резервуа для выращивания подают воздух в предпочтительном варианте около 0,1 объема воздуха на 1 объем среды для выращивания культуры в 1 мин. Для эффективного выращивания культуры в резервуар подают воздух около 0,25 об/мин.
Процесс производства комплекса, 5 протекающий в течение процесса ферментации, сопровождается отбором тестовых образцов среды или экстрактов частичек мицелия с целью проверки антибиотической активности
против организмов, о которых известно, что они чувствительны к антибиотикам. Одним изОрганизмов, который используют в тестах на антибиотики, является BaciPPus subtiEls АТСС 6633. Биоанализ производят, помещая диск из бумаги,
на котором находится проба, на плоский агар, содержащий среду для выращивания с ограниченным количеством питательных веществ.
0 Максимальное извлечение антибиотического комплекса А-35512 достигается при помощи предварительной фильтрации, чтобы удалить массу мицелия . Отфильтрованную среду для
5 выращивания культуры подвергают очистке известными способами, предпочтительно используют процесс адсорбции отфильтрованного бульона на полиамидной колонне и элюирование
Q колонны водой и смесью воды и спирта. Элюированные фракции, которые проявляют антибиотическую активность, соединяют, в результате получают антибиотический комплекс А-35512.
Дальнейшая очистка отдельных компонентов комплекса включает дополнительные процедуры адсорбции и экстрагирования. Для этого используют такие материалы, как окись алюминия, силикагель, ионообменные смолы.
Компоненты антибиоти ческого комплекса образуются в процессе ферментации в виде дигидрохлоридов. В результате полиамидного разделения
5 образуется компонент В, а оставшаяся часть содержит смесь в виде дигидрохлоридов. Каждый отдельный компонент можно превратить в его свободное основание (не содержащее
Q ионов хлора) известными способами, такими как хроматография над слабо основной ионо-обменной смолой.
Компонент В агликон готовят при помощи гидролиза компонента В в слабой кислоте. Компонент В наиболее легко доступен в виде дегидрохлорида. Можно также использовать компонент В или соль компонента В, образованную присоединением кислоты. Гидролиз в кислоте проводят обычным способом, предпочтительно использование соляной кислоты, при этом компонент В агликон получают в форме соли соляной кислоты, в предпочтительном варианте гидролиз проводят
в воде при температуре дефлегмирования в течение 1-2 ч.
Антибиотический ког/тлекс А-35512 компоненты комплекса А,В,С,Е,Н, компонент В агликон подавляют рост некоторых патогенных микроорганизмов, в частности грамположительных бактерий. Минимальную ингибируюсцую концентрацию, при которой компоненты комплекса подавляют рост бактерий, определяют известным способом.
Число и пропорции различных компонентов, содержащихся в комплексе, могут изменяться в зависимости от условий ферментации. Компонент В является основным в антибиотическом комплексе А-35512.
Компоненты образуются в комплексе А-35512, их извлекают отдельно из смеси в виде солей соляной кислоты. Каждый компонент отдельно можно превратить в его свободное основание, не содержащее ионов хлора, например, при помощи хроматографии на слабощелочной ионо-обменной смоле
Компоненты комплекса растворимы в воде, частично растворяются в спирте, таком как метанол и этанол, и не растворяются в других органических растворителях, таких как бензол, хлороформ, ацетон.
Компонент А антибиотического комплекса.
Компонент А, белое аморфное щелочное соединение, имеет следующий элементарный состав,%: углерод 54,29, водород 5,19, азот 5,58, кислород 33,76, хлор 1,69.
Дигидрохлорид компонента А белое аморфное гигроскопичное соединение, имеет следующий элементарный состав, %: углерод 51,03, водород 5,10, азот 4,75, кислород 34,20, хлор 4,80.
Инфракрасный спектр поглощения имеет максимум на следующих частотах (см-) , КВг: 3405 (интенсивный), 3300 (изгиб), 2950 (слабый), 1750 (слабый 1670 (интенсивный), 1625 (изгиб), 1602 (интенсивный), 1520 (интенсивный), 1470 (слабый), 1440 (слабый), 1405 (слабый), 1345 (изгиб), 1312 (умеренный), 1225 (умеренный), 11801130 (слабый), 1080 (интенсивный) и 1020 (изгиб).
УФ-поглощение показывает в кяслом и нейтральном метаноле максимум поглощения 282 им, а в щелочном метаноле 292 нм.
Дигидрохлорид компонента А имеет следующие специфические вращения ( 1, H20),M5f-400°( 1, Hj,0). .
Молекулярный вес Дигидрохлорида компонента А составляет примерно 2106. Растворим в воде, частично растворяется в спиртах, таких как метанол и этанол, и нерастворим в других органических растворителях, таких как бензол, хлороформ, ацетон и т.д. Стабилен в течение 72 ч в водных растворах, имеющих рН в пределах 3-10.
Согласно аминокислотному анализу содержит пять аминокислотных остатков, одним из которых является глицин.
Компонент В антибиотического комплекса А-35512.
Компонент В, белое аморфное основное соединение. Э.мпирическая формула имеет вид С„.„Н„,.,„,Мв.,0,С Е и имеет следуняйий процентный состав,%: углерод 53,98, водород 4,75, азот
.5,25, кислород 34,29, хлор 1,59.
УФ-спектр поглощения показывает в кислотном и нейтральном метаноле максимум поглощения 282 нм, а в щелочном метаноле 292 н.
Компонент В. имеет следующие характерные вращения:М -123° ( 1, П,О), Д -44б( 1, Н,,0).
Молекулярный вес, определенный с помощью титрования, составляет около 2143.
Дигидрохлорид компонента В, белое кристаллическое соединение, гигроскопичное и не имеет определенной точки плавления. Имеет следующий элементарный состав,: углерод 52,57,
водород 4,80, азот 5,66, кислород 32,86, хлор 4,51.
УФ-спектр показывает в кислом и нейтральном метаноле максимум поглощения 282 нм, аз основном метаноле 292 нм.
Дигидрохлорид компонента В имеет следующие характерные вращения: М -128( 1, H20),W|| -475°(l, ). Молекулярный вес, определенный методом титрования, составляет около 2027.
Аминокислотный анализ с помощью гидролиза в кислоте показывает наличие пяти аминокислотных остатков, одним из которых является глицин.
Анализ продуктсгв гидролиза в кислоте показывает, что Дигидрохлорид компонента В содержит следующие сахара: глюкозу, фруктозу, маннозу, рамнозу и З-амино-2,3,6-тридеокси-3-С-метил-ксило-гексопиранозу. При гидролизе в слабой кислоте извлека-г ется глюкоза, фруктоза, манноза- и рамноза-группы и получают агликоно-, вое производное соединение.
Дигидрохлорид компонента В имеет одну гидроксильную группу, способную участвовать в эфиризации.
Растворяется в воде, частично растворяется в спиртах, таких как , метанол и этанол, и нерастворим в других менее полярных органических растворителях. Стаби51ен в течение 72 ч в водных растворах имеюсцих рН в пределах 3-10.
Компонент С антибиотического комплекса.
Компонент С, белое аморфное основное соединение, имеет следующий состав, %: углерод 53,93, водород 5,15, азот 5,80, кислород 32,35, хлор 1,0
Компонент С имеет молекулярный вес приблизительно 18б2,
Дигидрохлорид KoivinoHeHTa С, белое аморфное соединение, имеет следующий элементарный состав,%:углерод 51,76, водород 5,07, азот 5,61, кислород 30,29, хлор 4,88.
Эмпирическая формула для дигидрохлорида компонента С находится в области Cg3.35Hgj.|o,Ng037.qCE3
ИК-спектр поглощения дигидрохлорида компонента С в KB г наиболее значительные максимумы поглощения имеет на следующих частотах, 3370 (интенсивный), 3280 (изгиб), 3040 (изгиб), 2980 (изгиб), 2920 (слабый) 1740 (слабый), 1658 (интенсивный), 1620 (слабый), 158-9 (умеренный), 1503 (интенсивный), 1460 (слабый), 1428 (умеренный), 1385 (слабый), 1330 (слабый), 1295 (умеренный), 1210 (интенсивный), 1162 (умеренный) 1120 (слабый), 1060 (интенсивный), 1005 (умеренный).
УФ-спектр поглощения дигидрохло.рида компонента С показывает в кислотном и нейтральном метаноле максимум поглощения 282 нм, а в щелочном метаноле 292 нм, рассчитанные при использовании молекулярного веса 200
Дигидрохлорид компонента С имеет следующие характерные вращения: -16lM 1,05, Н.О), -614° ( 1,05, ).
Молекулярный вес дигидрохлорида компонента С, определенный при помощи титрования, равен 198,2,
Аминокислотный анализ дигидрохлорида компонента С указывает на то, что он содержит пять аглинокислотных остатков, одним из которых является глицин.
Дигидрохлорид компонента С растворяется в воде, диметилсульфоксиде и водном растворе диметилформамиде, плохо растворяется в спиртах, таких как метанол, этанол, и нерастворим в бензоле, хлороформе, ацетоне, ди этиловом эфире, этилацетате, толуоле Дигидрохлорид компонента С стабилен в водных растворах, имеющих рН от 3 до 10 в течение 146 ч.
Компонент Е.
Компонент Е, белое аморфное основное соединение, имеет следующий элементарный состав,%: углерод 54,84, водород 4,73, азот 5,26, кислород 32,67, хлор 1,72.
Гидрохлорид.компонента Е, белое аморфное соединение, имеет следующи элементарный состав,%: углерод 52,6 водород 4,59, азот 5,55, кислород 33,51, хлор 3,62.
ИК-спектр поглощения гидрохлорида компонента С в KB г наиболее значительные максимумы поглощения име-I.
3360
ет на следующих частотах, см
(интенсивный), 3220 (изгиб), 2900 (слабый), 1725 (слабый), 1650 (интесивный), 1580 (умеренный), 1498 (интенсивный), 1450 (слабый), 1419 (слбый), 1295 (умеренный), 1205 (умеренный), 1172 (умеренный), 1110 (слбый), 1060 (интенсивный) и 1000 (слабый).
УФ-спектр поглощения гидрохлорида компонента Е выявляет максимумы поглощения в нейтральном метаноле 270 нм и 359 нм, в кислом метаноле 286 нм и 310 нм, в основном метанол 270 нм, 300 нм и 354 нм.
Гидрохлорид компонента Е имеет следующее характерное вращение: Ы -108,3(1, ).
Молекулярный вес гидрохлорида компонента Е, определенный при помощи титрования,, равен примерно 201
Гидрохлорид компонента Е растворим в воде, частично растворим вспиртах, таких как метанол, этанол, и не растворим в бензоле, хлороформе, ацетоне, диэтиловом эфире, этилацетатах, толуоле и т.д. Компонент Н.
Компонент Н, белое аморфное основное соединение, имеет следующий состав,%: углерод 53,76, водород 5,32, азот 5,53, кислород 33,48, хлор 1,59.
Компонент Н имеет эмпирическую формулу в области юз-юЛ ОзвчоС Е. молекулярный вес приблизительно равен 1908.
Гидрохлорид компонента Н, белое аморфное гигроскопическое соединени Гидрохлорид компонента Н имеет следующий состав,%: углерод 53,10, водород 5,37, азот 5,35, кислород 30,12, хлор 3,78.
ИК-спектр поглощения гидрохлорида компонента Н в КВг наиболее значительные максимумы поглощения имею на следующих частотах, смЧ 3410 (интенсивный), 3240 (изгиб), 2940 (слабый), 1670 (интенсивный), 1630 (изгиб), 1505 (интенсивный), 1520 (интенсивный), 1470 (слабый), 1442 (слабый), 1400 (слабый), 1345 (изги 1310 (умеренный), 1225 (умеренный), 1180 (слабый), 1135 (слабый), 1080 (интенсивный) и 1020 (изгиб).
УФ-спектр, поглощения гидрохлорида компонента Н проявляет в кислом и нейтральном метаноле максимум поглощения 282 нм, а в основном метаноле максимум поглощения 292 нм.
Гидрохлорид компонента Н имеет следующее характерное вращение: И« -123, 5 (1, HgO).
Молекулярный вес гидрохлорида копонента Н, определенный при помощи титрования,равен 1660.
Аминокислотный анализ гидрохлорида компонента Н указывает на то, что он содержит пять аминокислотных остатков, одним из которых является глицин.
Гидрохлорид компонента Н растворим в воде, частично растворим в метаноле, этаноле и не растворим в органических растворителях, таких как бензол, хлороформ, ацетон, диэтиловый эфир, этилацетат, толуол, гексан
Гидрохлорид компонента Н стабилен в течение 72 ч в водных растворах, имеет на- от 3 до 10.
Компоненты А,В,С,Е,Н, а также менее существенные компоненты F и G можно легко отделить при помощи бумажной хроматографии.
Компонент В агликон. Компонент В агликон гидрохлорид, белое аморфное соединение, имеющее следующий состав,%: углерод 54,29, водород 4,34, азот 7,40, хлор 5,02, кислород 28,95.
ИК-спектр поглощения гидрохлорида компонента В агликона наиболее значительное поглощение имеет на следующих частотах, см: 3440 (кзгиб), 3340 (изгиб), 3515 (интенсив.ный), 2950 (изгиб), 2910 (интенсивный), 2840 (интенсивный), 2640 (изгиб), 1735 (слабый), 1655 (интенсивный), 1590 (умеренный), 1500 (интенсивный), 1460 (интенсивный), 1378 (умеренный), 1365 (изгиб), 1298 (умеренный), 1215 (умеренный), 1155 (умеренный), 1120 (изгиб), 1105 (слабый), 1060 (слабый), 1040 (слабый), 1008 (умеренный), 925 (слабый 875 (слабый), 765 (изгиб) и 718 (слабый).
Гидрохлорид компонента В агликон имеет молекулярный вес около 1282.
Гидрохлорид компонента В агликона имеет следующее характерное вращени СосГо , СНзОН) ,Mls-l 8° (5, СНзОН).
УФ-спектр поглощения гидрохлорид компонента В агликона показывает в кислом, нейтральном метаноле максимум поглощения в 282 им ( 102,62), в щелочном метаноле - в 302 нм ( 182,09)1.
Гидрохлорид компонента В агликон растворим в воде и метаноле, HQ не растворим в бензоле, хлороформе, ацтоне, дизтиловом эфире, этилацетате толуоле, гексане, ацетонитриле и диоксане.
Компоненты антибиотического комплекса А-35512 являются относительно не токсичны. Например, показатель LDjo для гидрохлорида компонента А составляет 8000 мг/кг. Показатель LOjo для гидрохлорида компонента В у тиышей при внутрибрюшинном введени равен 1365 мг/кг, а при внутревенно введении равен ЮОО- 1250 мг/кг. Дигидрохлорид компонента С, как и
гидрохлорид компонента Е имеет сильную токсичность при внутрибрюшинном введении мышам, так LD превышает 300 мг/кг.
Антибиотический комплекс и его компоненты эффективны при применении с целью увеличения выделения пропионатов и тем самым увеличения эффективности использования корма при применении жвачным.животным в дозах от 0,15 мг/кг до 10,0 мг/кг в день.
0 Препарат смешивают с кормом животного, но его можно использовать, например, в виде таблеток, шариков, капсул. Каждая отдельная единичная доза должна содержать количество анSтибиотического комплекса и его компонентов, близкое к ежедневной дозе для животных.
Способ поясняется следующими примерами .
Пример 1. Лиофилизированную
0 таблетку штамма Streptomyces candidus NRRL 8156 растворяют в 1-2 мл стерилизованной воды и используют раствор ДД1Я прививки культуры на скошенном агаре, содержащем экстракт соло5да дрожжей Бакто C1SP № 2.
Привитый агар в течение 7 дней выращивают при . Созревшую на агаре культуру покрывают водой (2 мл) и снимают при помощи стерильной пи0петки с целью разрыхления спор. Порцию в 0,1 МП водной суспензии спор используют для прививки другого скошенного агара ISP № 2, выращивают в течение 7 дней при 30°С. Созревшую
5 культуру заливают 5 мл воды и снимают С помощью стерильной пипетки с целью разрыхления спор. Порцию полученной суспензии спор (2,5 мл) используют в качестве прививочного
0 материала для прививки 50 мл вегетативной среды, имеющей следующий состав: соевый бульон (Trypticase) 30 г, вода (деионизированная) 1 л. Привитую среду для выращивания культуры инкубируют при 30°С в течение
5 ;48 ч в 250 миллилитровой колбе Эрленмейера на вибраторе со скоростью вращения 250 об/мин.
Полученный вегетативный медиум 0,5 мл используют для прививки
0 50 мл среды для выращивания культуры, имекацей следующий состав: декстрин тапиоки 25,0 (г/л), глюкоза 10,0, МНдМОз 2,5; КСЕ 1,5; MgS04 1,1; FeCl2-4H2 0 0,03, tnCl2 0,03, КНгР04
5 0,1; L - глютаминовая кислота 1,0, DL - цитрулин 0,1; CaCO-j 5,0; деионизированная вода 1л.
Привитый медиум выращивают при в течение 8-10 дней в колбе Эрленмейера объемом 250 мл на вибра0торе .
Для обеспечения большого объема прививочного материала готовят 20 мл . привитого вегетативного медиума и используют его для прививки 400 мл
5
среды для выращивания второй стадии вегетативного роста, имеющей тот же состав, что и вегетативный медиум. Выращивание ведут в 2-литровой колбе в течение 24 ч при 32°С на вибраторе. 800 мл полученного вегетативного материала используют для прививки 100 л стерильного медиума. Привитый таким образом медиум используют в процессе ферментации в резервуаре объемом 165 л в течение 8-10 дней при З2с. В процессе ферментации подают стерильный воздух со скоростью 0,25 л/о/мин при постоянном перемешивании со скоростью 200 об/мин.
Пример 2. Выращенный вегетативный медиум, согласно примеру 1, можно хранить для дальнейшего использования в паровой фазе жидкого азота Для этого в небольшую трубку с завиичивающей крышкой помещают 2 мл среды следующего состава, %:
Глицерин 20 Лактоза 10 Вода деионизи70рованная
К этой среде добавляют 2 мл вегетативного медиума, приготовленного по примеру 1, и выращивают в течение 48 ч. Полученную суспензию охлаждают, и содержат в газовой фазе в резервуаре с жидким азотом.
Перед кспользованием для ферментации медиум растопляют. Для этого помещают во флакон, который подвергают водяной бане с температурой 43 С. Порцию растопившегося раствора (1 мл из флакона используют для прививки вегетативного медиума, объемом 50 мл имеющего тот же состав, что и медиум из примера 1. Привитый вегетативный медиум используют для ферментации в колбе, которую периодически взбалтывают, или. используют в качестве прививочного материала, который затем используют в процессе ферментации .
Пример 3. Ферментацию веду согласно примеру 1 с использованием среды следующего состава, г/л:
75 40
тапиоки
ый мясной
15,0 0,5 2,0 Остальное
Пример 4. 950 л культуральной жидкости с продуктами ферментации, полученной по примеру 1, фильтруют с использованием диатомой земли при рН 6,8-7,2. Полученный прозрачный фильтрат пропускают через колонку,- содержащую 10 мл полимерного адсорбента на 100 мл фильтрата, со скоростью 150 мл/мин. Полученные
фракции исследуют на биологическую активность в отношении Sarcina lutea Биологически неактивные фракции выбрасывают. Затем колонку промывают и неактивную промывочную воду отбрасывают. -Затем колонку элюируют 50%ным водным раствором метанола (600 л) со скоростью 200 мл/мин. Элюат, содержащий антибиотический комплекс, концентрируют под вакуумом до объема 15 л, в котором содержится около 200 г антибиотического комплекса на 1 л.
Пример 5. Антибиотический комплекс (около 3000 г растворенного в 15 л метанола), полученный по примеру 4, подвергают хроматографии на полиамидной колонке. Затем колонку элюируют деионизированной водой со скоростью около 80-120 мл/мин.
Фракции исследуют с помощью целлюлозной тонкослойной хроматографии или бумажной хроматографии, а в качестве растворителя используют смесь н-бутаНОЛ:пиридин:уксусная кислота: вода (15:10:3:12) и осуществляют дополнительно биосамозапись. Sarcina Lutea.
Первые 100 л элюата отбрасывают, затем скорость потока изменяют до 1б2 мл/мин при этом отбирают фракции объемом 12 л. Этим способом отбирают двадцать 12-литровых объемов. При этом меняют процентный состав элюирующего растворителя.
На основе результатов биосамозаписи полученные объемы соединяют и выпаривают до сухости под вакуумом. В результате получают дигидрохлорид компонента В и следующую обогащенную смесь компонентов (см. таблицу).
Пример 6. Частично очищенный дигидрохлорид компонента В (400 г), полученный в соответствии с примером 5, растворяют в 1,2 л 50%-ого водного раствора метанола и производят хроматографию на колонке, содержащей окись алюминия, которую приготавливают следующим образом. Кислотообразующий окисел алюМиния (10 кг) перемешивают в 50%-ном водном растворе метанола. После того, как смесь отстоится, образующийся сверху раствор сливают и удаляют. Окись алюминия снова перемешивают с 50%-ным водным раствором метанола, а затем помещают в колонну. Затем колонну, содержащую окись алюминия, промывают 50%-ным водным раствором метанола до тех по пока не появится прозрачный элюат. Колонну элюируют 50%-ным водным рас вором метанола со скоростью 810 мл/мин. При этом отбирают фракции объемом 240-300 мл. Фракции следуют согласно примеру 5. На основании пол ченных данных, фракции объединяют. При этом выход очищенного дигидрохло рида компонента В в зависимости от номера фракции распределяют следующим образом: фракции 17-21 - 9,6 г, 32-20 - 72 г, 30-37 - 117 г. Каждую из этих фракций кристаллизуют из концентрированного 50%-ого водного раствора метанола при 4°С. Очищенный таким образом гидрохлорид компонента В содержит около 4,6% хлора. Раствор дигидрохлорида компонента В в 60%ном водном растворе диметилформамида имеет рН около 6,5. Пример 7. 1г очищенного дигидрохлорида компонента В по примеру 6 растворяют в 40 мл воды и про пускают через ионообменную колонку размером 2,5- 18 см со скоростью 0,5 мл/мин. Затем элюируют колонку деионизированной водой, 5 мл началь ного элюата отбрасывают. Последующие 50 мл элюата выпаривают до сухости под вакуумом и получают 0,76 г компонента В, не имеющего ионов хлора в виде белого порошка. Содержание хлора 1,59%, Раствор этого компонента в 66%-ном растворе диметилформамида имеет рН 9,13. Пример 8, 1г частично очищенного дигидрохлорида компонента А полученного по примеру 5 (фракции 1-10) , растворяют в 5 мл 50%-ого вод ного раствора метанола. Затем производят хроматографию на колонке разме ром 3 16 см, содержащей кислотообразующую -окись алюминия. Колонку элюируют 50%-ным водным раствором ме танола со скоростью потока 0,5 мл/ми Собирают фракции, имеющие объем 5 мл, и анализируют согласно примеру 5. На основе этих тестов фракции 7-15 смешивают, концентрируют при пониженном давлении до небольшого объема, лиофилизируют и получают 0,3 г дигидрохлорида компонента А с содержанием хлора 4,71%, Пример 9, 200 мл дигидрохлорида компонента А, полученного по примеру 8, растворяют в 10 мл воды. Этот раствор пропускают через ионообменную колонку размером 1,5- 10 см со скоростью 0,5 мл/мин, затем колонку элюируют деионизирован ной водой, 10 мл первоначального элюата отбрасывают, последующие 20 мл элюата концентрируют до неболь шого объема при пониженном давлении, лиофилизируют и получают 115 мг, компонента А, не содержащего ионов хлора. Пример 10. Частично очищенный дигидрохлорид компонента С (15 г), полученный по примеру 5 (фракции 25-31), растворяют в 40 мл деионизированной воды, пропускают через полиамидную колонку размером 4 115 см . Перед использованием колонку в течение 15 ч промывают водой, затем колонку элюируют деионизированной водой со скоростью 3 мл/мин. 250 мл первоначального элюата отбрасывают, затем собирают фракции объемом 24 мл. Полученные фракции исследуют с помощью тонкослойной хроматографии биосамозаписью. При этом используют целлюлозные пластинки для тонкослойной хроматографии и растворитель - вторичный бутанол:пиридин: уксусная кислота:вода в соотношении 10:10:3:8 и бактерии штамма BaciP us subt i Ei s, Ha основе полученных результатов, смешивают фракции 1-33, концентрируют под вакуумом до объема 150 мл и лиофилизируют. Две дополнительные серии частично очищенного дигидрохлорида компонента С исследуют с помощью хроматографии при тех же условиях. При этом каждый раз фракции 1-33 смешивают, концентрируют под вакуумом до объема 150 мл и лиофилизируют. Три лиофилизированных образца, полученных на трех колонках смешивают и получают 12,3 г частично очищенного дигидрохлорида компонента С. Далее его очищают с помощью хроматографии на другой полиамидной колонке, но отбор фракций осуществляют объемом 15 мл, при этом скорость потока 1 мл/мин. Полученные фракции вновь исследуют, как описано выше. Фракции 36-58 смешивают, концентрируют под вакуумом до объема 150 мл и лиофилизируют, получают 5,3 г дигидрохлорида компонента С дополнительно очищенного. Окончательную очистку целевого продукта осуществляют с помощью хроматографии на колонке размером 5 41 см, содержащей кислотообразующую окись алюминия. Подготовленную колонку промывают 50%-ным водным раствором метанола. После промывки через колонку пропускают раствор, содержащий 5,3 г компонента С в 30 мл 50%-дго водного раствора метанола. Затем кйлонку элюируют 50%-ным водным раствором метанола со скоростью 1 мл/мин и отбирают фракции объемом 12 мл, которые затем исследуют, как описано выше. Фракции 22-74 смешива-. ют, концентрируют под вакуумом до объема 250 мл,лиофи 1изируют и получают 3,86 г дигидрохлорида компонента С.
Пример 11. 200 мг дигидрохлорида компонента С,-полученного по примеру 10, обрабатывают с помо ью хроматографии на слабо основной ионообменной смоле, согласно примеру 9. Получают 156 мг компонента С, не содержащего ионов хлора {содержание хлора 1,9%).
Пример 12. 8,1 г частично очищенного компонента Е, полученного по примеру 5 (фракции 32-44), растворяют и 40 мл деиониэированной воды. Полученный раствор пропускают через полиамидную колонку размером 5-НО см, подготовленную согласно примеру 10. Затем колонку промывают в течение 16 ч водой, После прохождения через колонку раствора, содержащего компонент Е, колонку элюируют деионизированной водой со скоростью 20 мл/мин и производят отбор фракций, имеющих объем 20 мл. Во время отбора 118 фракции элюирующий раствор меняют на 50%-ный водный раствор метанола и полученные фракции исследуют согласно примеру 10.
Фракции 148-195, содержащие компонент Е, смешивают, концентрируют при пониженном давлении до объема 150 мл, лиофилизируют и получают 2,7 г гидрохлорида компонента Е.
615 мг частично очищенного препарата растворяют в 50%-ном водном растворе метанола (5 мл) и пропускают через колонку размером 1,5-50 см содержащую кислотообразующую окись алюминия, и промывают 50%-ным вод- , ным раствором метанола до получения прозрачного элюата. Затем колонку элюируют 50%-ным водным раствором метанола со скоростью 1 мл/мин и производят отбор фракций объемом 10 мл.
Фракции исследуют, как описано ВЕзПие, смешивают фракции 5-8, концентрируют при пониженном давлении до объема 10 мл, затем добавляют 50 мл деионизированной воды и полученный раствор лиефилизируют. Получают 480 мг гидрохлорида компонента Е.
Пример 13. Гидрохлорид компонента Е (200 мг, полученный в соответствии с примером 12, подвергают хроматографии над слабоосновной ионообменной смолой, согласно примеру 9. Получают 170 мг компонента Е, не содержащего ионов хлора ( содержание ионов хлора 1,72%).
Пример 14. Частично очищенный гидрохлорид компонента Н (30 г), полученный в соответствии с примером 5 (фракции 1-10} , растворяют в ivwнимальном количестве раствора метанол:вода (7:3). Полученный раствор адсорбируют на колонке размером 3 ёО см, содержа аий кислотообразугощую окись алюминия, колонку наполняют метанолом и элюируют до тех
пор, пока элюат не станет прозрачным. Далее колонку элюируют метанолом со скоростью 4 }лл/мнн и отбирают фракции объемом 24 мл. При отборе 59 фракций элюирующий растворитель изменяют на раствор метанолвода (1:1). Далее фракции подвергают тонкослойной хроматографии с использованием растворителя хлороформ метанол:гидроокись аммония (2:3:1) и исследуют в отношении BaciPJus subtiEis с помощью биозаписи при щелочных условиях. Фракции 51-118 смешивают и выпаривают под вакуумом получают 6,4 г очищенного гидрохлорида компонента Н.
Пример 15. 200 мг гидрохлорида компонента Н, полученного по примеру 14, хроматографируют на слабо основной ионообменной смоле по примеру 9. Получают 143 мг компонента Н, не содержащего ионов хлора (концентрация хлора 1,59%).
Пример 16. 5 дигидрохлорида компонента в, полученного по примеру 6, растворяют в 200 мл воды. Полученный раствор подкисляют 14 мл 4Н раствора НСЕ и подвергают его дефлегмированию в течение 2 ч. Затем раствор охлаждают, выпаривают под вакуумом до 3/4 первоначального объема. Затем полученный раствор покапельно добавляют в бН соляную кислоту до тех пор, пока не закончится образование осадка. Полученный осадок отделяют и сушат. Получают 3,56 г неочищенного гидрохлорида А-35512 агиклона В. Фильтрат концентрируют и анализируют. Он содержит глюкозу, фруктозу, маннозу и рамнозу.
Неочищенный агликон дополнительно очищают с помощью хроматографии на окиси алюминия, промытый кислото с использованием в качестве растворителя раствора вода:метанол (1:9). Элюированные фракции, содержащие агликон, смешивают и выпаривают под вакуумом, получают 398 мг частично очищенного препарата. 100 мг частично очищенного препарата подвергают хроматографии на полиамиде и элюируют водой. После проведения анализа Элюированные фракции смешивают и лиофилизируют. Получают 64 мг очищенного гидрохлорида агликона общий выход 5,08% от исходного компонента В.
пример 17. 9,0мг гидрохлорида компонента В агликона, полученного по примеру 16, растворяют в 30 мл смеси метанол:вода (1:1). Полченный раствор нейтрализуют при помощи ионообменной смолы. Полученный раствор перемешивают в течение 15 мин при комнатной температуре. Затем смолу удаляют фильтрацией. Фильтрат кс: ттентрируют под вакуумом при температуре по крайней мере до объема, составляющего по-. ловину исходного, затем лиофилизируют, получают 68 мг компонента В агликона в форме свободного основания. Предлагаемый способ позволяет по лучить антибиотический комплекс, использование которого позволит повысить эффективность усвоения пищи у жвачных животных и домашних птиц 18 Формула изобретения Способ получения антибиотического комплекса, отличающийся тем, что штамм Streptomyces candidus NRRL 8156 выращивсоот на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, в аэробных условиях с последующим выделением комплекса и/или разделением его на отдельные компоненты.
