Способ получения литических ферментов Советский патент 1976 года по МПК C12D13/10 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ

ЗУ против растворителя. Диализат высушивают |При 0° под вакуумом.

Получаемые таким способом литические ферменты характеризуются устойчивостью в широком диапазоие рН среды: 4,5-9,5 (оптимум 7-8), активны при 25-40° С (оптимум 37° С). Длительно сохраняют активность при -1-4° С и при нагревании до 60° С (в течение 30 мин).

Используемый штамм Actinomyces recifensis var. lyticus 2435 выделен из суглинистой почвы Днепропетровского ботанического сада путем культ1 вирования на селективной среде, содержапдей клетки Staphylococcus aureus 142а в качестве единственного источника углеродного и азотн-ого питалия, и имеет следующую характеристику.

Морфология.

Диаметр воздушного мицелия 0,7-0,9 мк, Спороносцы короткие, неспиральные, .почти прямые, у .молодой культуры чуть волнистые, расположены скученно, метелкой. Споры овальные, оболочка гладкая. Воздушный мицелий серо-зеленоватый, окрашиваются колонии, но не среды.

Окраска субстратного мицелия более интенсивная, чем у воздушного.

Культуральные признаки.

Среда Чалека: рост обильный, колонии сеpoiBaTbie, поверхность бархатистая.

Крахлгально-аммиачная среда: рост хороший, колонии зеленовато-серые с желтоватым оттенком.

Среда Гаузе I с минеральным источником азота: рост хороший, колонии бархатистые, воздушный мицелий серо-зеленый, субстратный - серо-коричневый.

Среда Гаузе П с органическим источником азота: рост х.ороший, воздушный ми-целий серо-зеленый, субстратный - красно-коричневый. Бурое веш,ество не образуется.

.МПА. Дрожжевой агар с мальтозой: рост обильный, колонии буро-зеленоватые. Воздушный мицелий серо-желтоватый.

Полусинтетическая среда для глубинного культивирования продуцента, обеспечивающая высокий выход литического комплекса: соевая мугка - 10 г/л, КХОз - 0,5 г/л, глюксза - 5 г/л, К2НРОл-0,1 г, клетки индуктора Stanh. aureus I42a.

Мицелий на данной среде образуется ,в виде спутанных клубков нитей с небольшим коли ч с ст в о м р а зв е ТВ л е н и и.

Физиологические свойства.

Желатина разжижается быстро, молоко лептонизируется. Крахллал гидрол-изуется относительно слабо. Нитраты восстанавливаются, тирозиназа не образуется. На клетчатке рост есть. Хорошо усваиваются практиче-. ски все сахара, но их .присутствие в среде в зна чительных |Количествах снижает синтез литических ферментов. Растет в пределах 14- 45° С (оптимум 28°С). Синтез литических ферментов 1;нгибируется Zn+, Си+, Мп++, Fe++; активируется , Mg++.

Продукция ферментов возможна в диапазоне рН среды от 4,5 до 9,5; оптимум 6,0 и 9,0.

Слаб.ый антагонист. Незначительно пода.вляет рост отдельных грамлоложительных ба|ктерий и дрожжей, совершенно не угнетает грамотрицательные формы.

Продуцируемые ферменты глубоко лизируют клетки организмов, относящихся к родам Staphylococcus, .Diplococcus, Micrococcus, Bacillus, Escherichiae, Salmonellae, Vibrio Corynebacterium, Saccharomyces, Shizosaccharcmyces, Candida.

С помощью данного штамма возможно

5 осуществлять натравленный синтез, т. е. получать ферменты, обладающие определенными заранее заданными литическими свойствами, благодаря введению в среду требуемого индукто.ра.

0 Способ поясняется следующими примерами.

Пример 1. Среду Л 6, содержащую в 1 л дистиллированной воды 0,1 г К2НРО4, 0,5 г KNOs, 5 г глюкозы и 10 г соевой муки,

5 засевают культурой продуцента блоками 7-

10 суточного штамма Actinomyces recifensis

,var. lyficus 2435, выросшего на твердой среде

Чапека. В среду одновременно с лосевным

материалом вносят клетки индуктора - п,ро0 автоклавированную 1взвесь Staphylococcus aureus 142а, содержащую 15 10® кл/мл. Взвесь добавляют в количестве 0,1 мл на 1 мл среды.

Культивирование велось при активной аэ5 ращии и перемеши вании среды .при 27-28° С в течение 3 суток.

После окончания инкубации культуральную жидкость освобождают от мицелия и не1тслользованных остатков питательной среды

0 :дентрифугированием при 6000 об/мин в течение 15-20 мин.

Прозрачную культура.льную жидкость, содержащую сырой литический фермент, насыщают до 0,4 сернистым аммонием; получен5 лый солевой раствор оставляют при 4° С на 16-18 час для формирования осадка. Осадок зыпавшего. белка собирают фильтрованием под ва.куумом (.при пониженной температуре), промывают холодным ацетоном, подсушивают до удаления ацетона и растворяют н ацетатном буфере рН 5,5 (0,1М), взятом в количестве 0,1 от исходного объема культуральной жидкости. Нерастворимый осадок отделяют в ечение 10 мин центрифугированием .при

55 5000 об/мин.

В полученном растворе белка определяют литическую активность.

К 2 жл взвеси живых клеток Staphylococcus aureus добавляют 1 мл ферментного раствора белка. На ФЭК-М при желтом светофильтре измеряют исходную плотность суспензии (не должна превышать 2), затем взвесь термостатируют при 37° С в течение 35 час и снова измеряют ллотность раствора.

65 Эффективность лизиса определяют по глубине лизиса исходной взвеси за 3,5 час, т. е. по соотношению плотностей в исходном и конечном растворе, выраженном в процентах.

Таблица 1

МИ табл. 2 примера 1) литической активности от природы индуктора.

Таблица 3

Глубинализиса. %

Литическую а,ктнвность данного фермент- is ного раствора аналогичным образом исследуют и в отношении ряда других микроорганизмов. Результаты этих исследований представлемы в табл. 2. Глубина лизиса лживых клеток Staph. aureus принята за Ю0%. Т а б л 1 ц а 2

Пример 2. К среде Л 6 в качестве индуктора добавляют прогретую взвесь клеток Bacillus mycoides в количестве 0,1 мл на 1 мл среды.

:Выраш,ивание и обработку культуральной жидкости ведут, как указано в примере 1.

Литическую активность ферментного раствора белка проверяют з отношении живых и прогретых Клеток Staphylococcus aureus и Bacillus mycoides.

Результаты представлены в табл. 3, где показана зазиснмость (в сравнении с данны3.Способ по пп. 1-2, отличающийся тем, что в качестве индуктора используют микроорганизмы, относяш;иеся к виду Staphyiococcus aureus.

5.Cinoco6 по пп. 1-4, отличающийся тем, что в качестве источника углерода и азота в среде используют соответственно глюкозу и соевую , а из солей - азот: скислый каляй и дзузамещенный фосфорнокисTaiKHM образом, применение в качестве индуктора Staph. aureus обеспечивает широкий спектр литической активности ферментдв. Вас. mycoides лизнруется этим ферментом на 80% 7 лый калий, лри этом указанные компоненты введены в следующих количествах, Соевая мука10 Глюкоза55 Азотнокислый калий0,5 8 ДвузамещенНый фос форнокислый калий 0,1 6. Способ по п,п. , отличающийся тем, что при выделении фермента из среды сульфатом аммония, его вводят до 40% насы.щения.