Способ выращивания ортомиксовирусов Советский патент 1984 года по МПК C12N7/00 C12N7/00 C12R1/91 

Изобретение относится к вирусологии и касается способа выращивания ор томике овирус о в. Известен способ вьфащивания виру сов в присутствии стимулятора репро дукции вируса, в частности полисахаридов, продуцируёмых Escherichia соП , вьфащениой в условиях лимитирования по лизинуС 1. Известен таклгё способ выращивания рртомиксовирусов в среде куль™ тивирования в присутствии стимулятора репродукции вирусов - липидньпс экстрактов печени и почек крыс 23. Однако известные способы не обеспечивают высокого выхода вирусов. Целью изобретения является повышение выхода вирусов. Указанная цель достигается тем, что согласно способу выращивания ортомиксовирусов в среде культивиро вания в присутствии стимулятора реп родукции вирусов, в качестве стимулятора репродукции вирусов используют 1,4-бис-диазоацетилбутан или нитрозометилмочевину в концентрации 1-25 или 1-20 мкг/мл соответственн ;1ри этом вирусы обрабатьшают стимулятором до внесения в среду культивирования. Способ осуществляют следующим об разом. Пример. Вирусы гриппа, штамм WSN и штамм Вейбридж(ВПЧ ) размножают в хорионаллантоисной полости 10-J1 дневных куриных эмбрионов. Вирус перед заражением обрабатывают 1,4-бис-диазоац тилбутан (ДАВ) в конечной концентрации 25 20, 16, 14, 12, 10 и 1 мкг/мл. Навески ДАБ раств оряют в фосфатном буфере с рН 6,0 соединяют с суспензией вируса и инкубируют при комнатной температуре, периодически встряхивая. Контакт вируса с ДАБ длится 1 и 2 ч. Затем обработанный и необработанный вирус титруют до Id и по 0,2 мл WSN и 0,1 мл ВПЧ каждого разведения вводят в аллантоисную полость 10-11 дневного куриного эмбриона. Через 48 ч WSN и 24 ч ВПЧ инкубации при 37°С эмбрионы вскрывают и по характеру , агглютинации эритроцитов на дне пробирки судят о наличии вируса. Гемагглютинирующую активность учитывают по реакции гемагглютинации на плексигласовых пластинках с куриными эритроцитами. Инфекционные титры вируса рассчитывают по методу Рида и Менча и вьфажают в . О стимуляции репродукции судят по соотношению титров инфекционности обработанного и необработанного вируса. Результаты влияния ДАБ на размножение ортомиксовируссзв в куриных эмбрионах приведены в табл.I. Таблица 1

Продолжение табл. I

Продолжение табл.

СПОСОБ ВЫРАЩИВАНИЯ ОРТОМИК: СОВИРУСОВ в среде культивирования в, ; присутствии стимулятора репродукции вирусов, отличающийся I teM, что, с целью повышения выхода i вирусов, в качестве стимулятора ре; продукции вирусов используют 1,4-бис-диазоацбтш1бутан или нитрозомётилмочевину в концентрации 125 или 1-20 мкг/мл соответственно, при этом вирусы обрабатывают стимулятором до внесения в среду культивирования . (Л С

512 512 512

Наибольший стимуляциойный эффект обнаружен при обработке 10 мкг/мл 1IMM в течение 2 ч, когда выход вируса превьшается в 32 ВПЧ и 25 WSN раз.

Приме р 3. Вирусы штаммов и Вейбридж размножают в культуре клеток куриных фибробластов. Обработку вируса проводят ДАВ в кон- ; центрации 25, 20 и 26 мкг/мп в течение 2 ч при комнатной температуре, периодически встряхивая.

Двухсуточные культуры куриных фибробластов в матрасах объемом

ВПЧ

25 20 16

2 2 2

1,6

7,4 3,2 7,9 7,4

4,0 8,0 7,4

эО мл заражают по 0,5 мл соответст- , вующих разведений обработанного и необработанного вируса, вьщерживают при комнатной температуре 1 ч. Затем инокулянт удаляют, а клеточный пласт промывают раствором Хэнкса и покрывают средой 199 с 1,8% агаром Дифко инкубируют при 37С в течение 3 5 сут и подсчитьшают количество бляшек. Титр вируса выражаеч-ся в единицах бляшкообразования (ВОЕ/мл ),

Результаты влияния ДАВ на репро- дукцию ортомиксовирусов в культуре куриных фибробластов приведены в табл.3.

ТаблицаЗ

6

10

10

12,2 -10

234,6

10® 1,3 10°

92,9 10 2,0 Ш

142,8

; Обработка вируса низкими концентрациями ДАВ повьшает выход вируса и в условиях заражения культуры клеток. Наибольвшй эффект ДАБ оказьшает в концентрации 25 мкг/мл при экспозиции 2ч. Бляшкообразующая способность такого вируса превышает контроль в 234 ВПЧ и 304 WSN раза.

П р и м е р 4. Вирус получают аналогичным образом, обрабатывают

1081208

8,

Продолжение табл« Д

НММ в концентрации 16, 20 и 25 мкг/мл 2 ч при комнатной температ е периодически встряхивая. Дальнейший I ход экспериментов с обработанным и I необработанным вирусом сходен с примером 3.

Результаты влияния НММ иа репродукцию ортомиксовирусов в культуре куриных фибробластов приведены в

|табл.4.

Таблнца4