СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИРИБОГУАНИЛОВОЙ КИСЛОТЫ Советский патент 1995 года по МПК C12P19/34 

Изобретение относится к области прикладной биохимии и может быть использовано для производства в больших количествах полирибогуаниловой кислоты, применяемой как для приготовления интерферогенных средств, например, "Полигуацил", так и для научных целей.

Известен способ получения полинуклеотидов с помощью полинуклеотидфосфорилазы (ПНФ), иммобилизованной различными методами, например, агарозном геле (сефарозе) или силохроме.

Недостатком этих способов является то, что они обеспечивают получение всех высокомолекулярных полинуклеотидов, за исключением высокомолекулярной полигуани- ловой кислоты.

Из всех высокомолекулярных полинуклеотидов только полирибогуаниловую кислоту не удавалось получить гетерогенным синтезом.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту является способ получения полирибогуаниловой кислоты (поли Г) из гуанозиндифосфорной кислоты (ГДФ) в ходе ферментативного синтеза в гомогенных условиях с помощью фермента полинуклеотидфосфорилазы (ПНФ), выделенного из термофильного микроор- ганизма Bacillus stearothermophilus.

Проведение синтеза поли Г осуществляют следующим образом.

Раствор, содержащий фермент ПНФ, выделенный из термофильного микроорганизма Bacillus stearothermophilus, смешивают с субстратом ГДФ, MgCl₂ и ТРИС-буфером при рН= 8,2-8,6, раствор выдерживают определенное время при 60-70^оС.

Однако в процессе выделения полученного продукта из реакционной смеси и очистки его от сопутствующих белковых примесей происходит неизбежная частичная деградация полирибогуаниловой кислоты в результате воздействия различных физико-химических факторов и химических реагентов.

Таким образом, получение полирибогуаниловой кислоты необходимой степени чистоты (например, для использования в медицинских целях) связано с уменьшением молекулярного веса полинуклеотида до 150000-200000 дальтон, что характеризует недостаточно высокое качество продукта, получаемого в гомогенных условиях.

Целью изобретения является улучшение качества полирибогуаниловой кислоты.

Указанная цель достигается описываемым способом получения полирибогуаниловой кислоты из гуанозиндифосфорной кислоты с помощью полинуклеотидфосфорилазы Bacillys stearothermophilus, причем отличительным признаком изобретения является то, что используют полинуклеотидфосфорилазу, иммобилизованную на широкопористом стекле с диаметром пор 2000-10000 .

Выбор ШПС с диаметром пор более 2000 основан на следующем экспериментальном факте. О ходе реакции синтеза поли Г можно судить по появлению в реакционной смеси либо поли Г, либо обpазовавшегося неорганического фосфата.

При синтезе поли Г с помощью ПНФ, иммобилизованной на ШПС с диаметром пор менее 2000 , в реакционной смеси обнаруживается неорганический фосфат, а поли Г практически не обнаружено. Это, по-видимому, обусловлено затруднительным выходом крупных молекул поли Г из пор стекла, когда диаметр пор недостаточен. Выход поли Г наблюдается при диаметре пор ШПС от 2000 до 10000 . При большем диаметре пор резко падает выход целевого продукта.

Способ основан на применении иммобилизованного фермента, получаемого по следующей схеме.

Модификация широкопористого стекла (ШПС) с диаметром пор 2000-10000 кипячением в 4% растворе 3,3-диэтоксипропилтриэтоксисиланом (ДЭПТЭС) в толуоле в течение не менее 20 ч. Затем проводят активирование модифицированного ШПС 1 н. соляной кислотой. Активированное модифицированное ШПС промывают дистиллированной водой.

Иммонбилизация фермента ПНФ, выделенного из термофильного микроорганизма Bacillus stearothermophilus на активированное стекло с диаметром пор более 2000 .

Синтез поли Г осуществляют при 70-80^оС в реакторе, содержащем иммобилизованный на ШПС ПНФ, раствор субстрата ГДФ, MoCl₂ и ТРИС-буфер, рН 8,2 в течение 10 ч.

Экспериментально установлено, что максимальный выход продукта наблюдается при 70-80^оС.

Получаемый продукт выделяют из реакционной смеси либо спиртовым, либо кислотным осаждением с последующим диализом против дистиллированной воды.

Проведение синтеза с помощью широкопористого стекла с диаметром пор 2000- 10000 , на которое иммобилизован ферментполинуклеотидфосфорилаза, позволило осуществить синтез поли Г в гетерогенных условиях. При этом фермент необратимо присоединяется к модифицированному стеклу и не загрязняет конечный продукт (поли Г) белковыми примесями. Поэтому отпадает необходимость в дополнительной обработке реакционной смеси, а следовательно, не происходит и загрязнение и расщепление поли Г. Поли Г получается более высокого качества с большим молекулярным весом: 300000-400000 дальтон, что также очень важно при дальнейшем его использовании.

Кроме того, необходимо отметить, что способ значительно упрощен, т.к. процесс идет в гетерофазной системе, что упрощает выделение продукта. Фермент ПНФ, иммобилизованный на ШПС, остается пригодным для последующих синтезов поли Г.

Из-за возможности многократного использования иммобилизованного фермента, выход конечного продукта на единицу взятого в синтез фермента, существенно увеличивается не менее, чем в 50 раз и практически ограничивается временем жизни иммобилизованного фермента.

На чертеже представлены результаты сравнительного анализа с помощью гельхроматографии препарата поли Г, полученного предлагаемым способом (кривая 1), и фирменного препарата (кривая 2), полученного способом-прототипом (коммерческий препарат фирмы "Gee Lawson" Англия).

П р и м е р 1. Получение ферментного препарата.

1. 2 г сухого, промытого в соляной кислоте стекла ШПС-2000 А, засыпают в круглодонную колбу объемом 100 мл и заливают 10 мл 4% раствором ДЭПТЭС в свежеперегнанном толуоле. Колбу подсоединяют к обратному холодильнику и помещают в масляную баню. Баню нагревают до температуры кипения раствора в колбе. В этих условиях стекло выдерживают не менее 20 ч. Затем стекло собирают на стеклянном фильтре, промывают сначала 10 мл толуола, потом 25 мл ацетона и подсушивают.

2. 100 мг сухого модифицированного стекла заливают 5 мл 1 н. HCl, деаэрируют и оставляют в течение часа на магнитной мешалке. После удаления кислоты стекло отмывают до нейтрального значения рН дистиллированной водой и заливают 0,1 М глицерофосфатным буфером рН=7,0. Активированное в таких условиях ШПС содержит по данным титрования с помощью солянокислого гидроксиламина 15 микромолей альдегидных групп на 1 г сухого веса стекла.

Уравновешенное с буфером стекло после удаления жидкости заливают 0,5 мл раствора ПНФ в 0,1 М глицерофосфатном буфере рН 7,0. Сосуд закрепляют на роторной мешалке и оставляют на ночь при 4^оС. Через 15 ч жидкую фазу отделяют и добавляют 1 мл раствора боргидрида натрия (концентрация 1 мг/мл) в глицерофосфатном буфере рН 7. Через 1 ч перемешивания при 4^оС ШПС с иммобилизованным ферментом промывают последовательно 1 мл глицерофосфатного буфера, содержащего 1 ММ NaCl и 1 мл 0,1 М трисбуфера рН 8,2. Во всех промывных растворах и в препарате иммобилизованного на широкопористом стекле фермента определяют ферментативную активность. За реакцией следят по накоплению в растворе неорганического фосфата. За стандартную единицу активности принимают такое количество фермента, которое обеспечивает выделение 1 микромоля неорганического фосфата за 15 мин при 70^оС в процессе синтеза полирибоадениловой кислоты из аденозиндифосфорной кислоты. Состав реакционной смеси для определения активности ПНФ в расчете на 1 мл трисбуфера-HCl 100 мкм рН 8,2, АДФ 10 мкм, MgCl₂ 5 мкм, ЭДТА 1 мкм. В исходном растворе из 10 ед. ПНФ, находившихся в 0,5 мл буфера, после 15 ч контакта с ШПС найдено 4 ед. В промывных водах ферментативной активности не обнаружено, 5 ед. активности обнаружено на стекле. Таким образом, после иммобилизации на ШПС фермент сохранил 80% своей активности. Фермент, иммобилизованный на стекле, сохранял активность при хранении при 4^оС практически без изменения в течение 4 месяцев. С его помощью было синтезировано несколько десятков мг поли Г.

Синтез поли Г проводят в течение 10 ч при 70^оС в реакторе, содержащем 100 мг ШПС с пришитой ПНФ (с активностью 50 ед/г), и 4 мл раствора следующего состава в расчете на 1 мл: трис HCl, рН 8,2 100 мкМ, ГДФ 10 мкМ, MgCl₂ 3 мкС, ЭДТА 1 мкМ. За ходом реакции следят по накоплению в растворе неорганического фосфата, его содержание определяют по методу Фиске-Суббароу. После 10 ч инкубации выход неорганического фосфата составляет 50% В этот момент инкубацию прекращают.

После завершения реакции синтеза поли Г фермент ПНФ вместе со стеклом удаляют из реакционной смеси фильтрованием. Затем помещают в свежий раствор субстрата для следующего цикла синтеза поли Г. Для выделения поли Г из реакционной смеси к 4 мл профильтрованного раствора добавляют 8 мл холодного -10^оС этилового спирта. При этом поли Г выпадает в осадок. Выпавший осадок поли Г промывают 70% холодным этиловым спиртом, растворяют в 1 мл дистиллированной воды и диализуют против двух смен дистиллированной воды. После завершения диализа измеряют оптическую плотность раствора поли Г при 252 нм оптическая плотность 170 ед. ОП. Поскольку молярная экстинкция поли Г при 252 нм равна 9,6 ˙ 10³, получено 18 мкМ чистой поли Г. Таким образом, выход поли Г за один цикл синтеза составляет 45% от взятого в реакцию субстрата (40 мкМ). Диализованный раствор поли Г лиофильно высушивают. Молекулярная масса полученного полимера составляет 300000-400000 дальтон против молекулярного веса продукта по прототипу 150-200 тыс. дальтон, что свидетельствует об улучшении качества получаемого полимера.

П р и м е р 2. Приготовляют ПНФ, иммобилизованную на ШПС с диаметром пор 10000 и удельной поверхностью 3,2 м²/г, как описано в примере 1 и определяют активностью иммобилизованной ПНФ. Обнаружили, что 100 мг ШПС с диаметром пор 10000 связалось 0,9 ед. ферментативной активности. Это естественный результат, т.к. удельная поверхность ШПС с ⊘ 10000 в 5 раз меньше, чем у ШПС с ⊘ 2000 .

100 мг ПНФ ШПС ⊘ 10000 заливают 2 мл реакционной смеси, в примере 1, и синтез поли Г ведут в течение 24 ч при 72^оС. К этому времени конверсия ГДФ в поли Г, определенная по выходу неорганического фосфата, составляет около 50% Из реакционной смеси отбирают 0,1 мл раствора и проводят гельхроматографию на сефадексе 0-200. Видно, что в основном поли Г имеет то же молекулярно-весовое распределение, что и в случае синтеза, описанного в примере 1. Молекулярная масса полимера составляет 200000-400000 дальтон. Следователь- но, качество полученного продукта в интервале диаметров пор ШПС 2000-10000 остается неизменным.

Таким образом, описываемый способ получения поли Г обладает следующими преимуществами перед известным:
получаемый конечный продукт является более высокомолекулярным (качественным);
упрощается процесс получения поли Г.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИРИБОГУАНИЛОВОЙ КИСЛОТЫ из гуанозиндифосфорной кислоты с помощью полинуклеотидфосфорилазы Bacillus stearothermophilus, отличающийся тем, что, с целью улучшения качества целевого продукта, используют полинуклеотидфосфорилазу, иммобилизованную на широкопористом стекле с диаметром пор