Способ иммобилизации белковых молекул Советский патент 1980 года по МПК A61K38/43 

(54) СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЦИИ БЕЛКОВЫХ МОЛЕКУЛ верхности носителя потенциальноактив ные группы за счет наличия в этом агенте ацетальной группировки. Кроме того, ДЭПТЭС - вещество легкодоступное, устойчивое, и для присоединения носителю не требует предваеительных химических преобразований. Использование ДЭПТЭС позволяет легко менять плотность активных групп на поверхности носителя путем варьирования ко личества агента, вносимого в реакиию. Указанное количество ДЭПТЭС, вводимое в реакцию, определяется тем, что данное вещество склонно к образованию полимерных.структур, которые при. их избытке могут закупорить поры носителя. Обработка пористого силикатного носителя после модифицированной обработки его поверхности с помощью ДЭПТЭС 1 н. соляной кислотой необходима для окисления ацетальной группы что приводит к возникновению собственно активных групп пропионового ал дегида, взаимодействующих в дальнейшем с аминогруппами белков. Результаты титрования альдегидных .групп на пористом стекле, обработанном СЗ,З-диэтоксипропил)-триэтоксисиланом, до и после его обработки 1 н. соляйой кислотой показывают, чт в выбранных условиях модификации носителя альдегидные группы на его поверхности возникают только после обработки модифицированного носителя 1 н. соляной кислотой. Это означает, что ацетальная группировка в процесс взаимодействия ДЭПТЭС с поверхностью носителя не вовлекается ни в какие химические превращения. Следовательно, на поверхности носителя образуют ся алифатические альдегиды точно известного строения. Конечным продуктом является силикатный носитель, имеющий на поверхности ацетальные группы, которые в кислой среде 1 н. соляной кислоты пе реходят в пропионовый альдегид, способный взаимодействовать с аминогруп пами белковых молекул с образованием шиффовых оснований. Присоединение бе ковых молекул к поверхности активированного носителя проводят введерживанием носителя в растворе белка с последующей обработкой носителя боргидридом натрия для восстановления образовавшихся лобильных шиффовых ос нований в устойчивый замещенный альдимин. Пример 1. 40г широкопористого стекла (ШПС со средним диаметром пор 2000 , пористостью 0,69 см/г, поверхностью 14 и содержащем гидроксильные группы .в количестве 100 моль/г помещают в круглодонную колбу, снабженную механической мешалкой и обратным холодильником, зал ивают 150 мл , концентрированной соляной кислоты и 15 мл 30% перекиси водорода. Колбу греют 1 ч при с интенсивным перемешиванием содержимого. Затем пористое стекло промывают на стеклянном пористом фильтре последовательно тремя литрами дистиллированной воды и 200 мл ацетона. Далее пористое стекло сушат над вакуумом при 150 С в течение 5 ч. Сухое ШПС помещают в ампулу и заливают смесью, содержащей, мл: (3,3-диэтоксипропил } триэтоксисилана, 3,5; Н-О 0,7; 2 н. НС1 0,2 и абсолютного тетрагидрофурана 60. Ампулу запаивают и оставляют при на 12 ч. Затем ампулу вскрывают и сушат содержимое под вакуумом в течение 3 ч при 100-120 С. Высушенное ШПС заливают 100 мл 1 н. соляной кислоты и выдерживают 2 ч при комнатной температуре при интенсивном перемешивании на роторной мешалке. Затем ШПС промывают последовательно 3 л дистиллированной воды и 150 мл этанола и сушат под вакуумом при 80-100 С. Приготовленное таким образом активированное ШПС по данным титрования солянокислым гидроксиламином содержит 80 мкмоль альдегидных групп на 1 г ШПС. 1 г активированного ШПС промывают на стеклянном фильтре 10 мл 0,1 М глицерофосфатного буфера (рН 7). Затем активированное ШПС заливают тем же буфером так, чтобы буфер только покрывал ШПС, р дезаэрируют под вакуумом. К подготовленному таким образом носителю добавляют 0,2 мл раствора фермента полинуклеотидфосфорилазы (к.Ф. 2.7.7.8) с концентрацией белка 1 мг/мл и удельной активностью 600 ед/мг, предварительно отдиализованного против 0,1 М глицерофосфатного буфера (рН 7J. Реакционную смесь перемешивают 12 ч на роторной мешалке при . После завершения реакции жидкую фазу удаляют и добавляют 2 мп раствора боргидрида натрия Cl мг/мл.) в глицерофосфатном буфере С рН 7). Через 1 ч перемешивания при 4°С ШПС с иммобилизованным ферментом промывают последовательно 10 мл глицерофосфатного буфера, содержащего 1 М. NaCI и 0,1 М трис-НСД буфером, рН 8,2. Во всех промывных растворах н в препарате иммобилизованного на пористом стекле фермента определяют ферментативную активность. За ферментативной реакцией следят по накоплению неорганического фосфата, выделяющегося при синтезе полиадениловой кислоты из аденозиндифосфорной кислоты. За единицу активности принимают такое количество фермента, которое обеспечивает выделение 1 микромоль неорганического фосфата за 15 мин. Ферментативную активность во всех случаях определяли при в реакционной смеси, содержащей в 1 мл: трис-НС1 100 мкм.

аденоэиндифосфорной кислоты 10мкм, MgClg 5 мкм, рН 8,2. ; в промывных водах ферментативной активности не обнаружено. Препарат ШПС с иммобилизованным ферментом содержит 100 ед. активности, или 80% от внесенной в реакцию. Фермент, иммобилизованный на пористом стекле, активированном СЗ,3-диэтоксипропил)триэтоксисиланом сохраняет практическ без уменьшения свою активность при хранении при 4 С в течение 3-х месяцев.

Пример 2. 2г активированного ШПС, приготовленного, как описано в примере 1, промывают 0,1 М, натрийацетатным буфером (рН 5) с концентрацией 13,2 мг/мл, заливают 10 мл раствора яичного альбумина в том же буфере , дезаэрируют и оставляют на роторной мешалке при на 12 ч. Жидкую фазу удаляют и заливают ШПС 10 мл раствора боргидрида натрия (1 мг/мл) в натрий ацетатном буфере и перемешивают еще 1 ч. Затем пористое стекло промывают последовательно растворами: 10 мл натрий-ацетатного буфера рН 5; 10 мл того же буфера с 1 М NaCl; 10 мл 0,01 н. НС1 и 20 мл 0,1 М натрий-ацетатного буфера. В исходном растворе белка и в промывных растворах содержание белка определяют по поглощению .растворов при 280 нм считая, что весовая экстинция яичного альбумина составляет 0,66 ед. оптической плотности на 1 мг белка.

Обнаружено, что жидкая фаза удаленная изреакционной смеси после инкубации ШПС с раствором белка, и первые два промывных, раствора содержат 102 мг яичного альбумина. Таким образом, к 1 г активированного с помо- щью ДЭПТЭС пористого стекла коваяентно присоединилось 15 мг яичного альбумина.

Использование предлагаемого способа иммобилизации белков на поверхности силикатных носителей обеспечива, ет, по сравнению с существующим способом следующие преимущ,ества: улучшается качество активированной поверхности носителя, несущей альдегидные группы, что выражается в сохранении существенно большей активности иммобилизованных ферментов 80% в известном способе)/упрощение способа за счет исключения дополнительных операций для создания активных групп на поЁерхности носителя.

5

Формула изобретения

Способ иммобилизации белковых моes лекул на поверхности пористых силикатных носителей путем активации поверхности последних производным триэтоксисилана с послед%ющим присоедийениём белковых молекул, отличающийся тем, что, с целью

5 .упрощения способа и улучшения качает ва целевого продукта, в качестве производного триэтоксисилана используют {3,3-диэтоксипропил) триэ-токсисилан ,в количестве не превышающем трехкрат0 вый молярный избыток по отношению к количеству .гидроксильных групп на поверхности носителя, причем перед присоединением белковых молекул носитель дополнительно обрабатывают 1 н. 5 соляной кислотой.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Weetal1 Н. Н., Fi1Ьегt А. М. Methods in enzymoloqy , 3f , p.59-72, 1974 (прототип).