Способ получения рибонуклеозид-5"дифосфатов Советский патент 1976 года по МПК C07H21/02 

1

Изобретение относится к области биохимии, конкретно к усовершенствованному ферментативному способу нолучения рибонуклезид-5-дифосфатов, которые находят широкое применение в химии, биохимии, медицине и микробиологии.

Известен прямой ферментативный способ получения рнбонуклеозид-5-дифосфатов фосфоролизом рибосомальных нуклеиновых кислот в присутствии фермента полинуклеотидфосфорилазы при рН 8,0, температуре 37°С и концентрации рибосомальных нуклеиновых кислот 10-12 ммоль, ортофосфата в виде Na2HPO4 15-20 ммоль, MgC 5 ммоль, а отделение рибонуклеозид-5-дифосфатов от полинуклеотидфосфорилазы и оставшихся (непрореагировавших) рибосамальных нуклеиновых кислот осуществляют гель-хроматографией. Недостатком известного способа получения рибонуклеознд-5-дифосфатов являются их низкий выход (35-40%), а также сложность стадии отделения рибонуклеозид-5-дифосфатов от полинуклеотидфосфорилазы, которая при этом теряется безвозвратно.

С целью повышения выхода целевого продукта и упрощения процесса предлагаемый способ, который заключается в том, что фосфоролиз проводят при 40-50°С, концентрации рибосомальных нуклеиновых кислот 6 - 7 ммоль, ортофосфата в виде К2НР04 35-

50 ммоль и водорастворимой соли магния в виде Mg(CH3COO)2 7-8 ммоль, при этом целевой продукт выделяют фильтрацией через ультрапористую мембрану.

Указанная мембрана непроницаема для молекул с молекулярным весом 200000 дальтон и более и проницаема для молекул с молекулярным весом около 10000 дальтон.

Разработанный способ позволяет получать рибонуклеозид-5-дифосфаты с выходом 80- 1007о и упростить стадгпо их отделения от полипуклеотидфосфорплазы, т. к. при этом не требуется сложного хроматографического оборудования и специального контроля, а только визуальный. Кроме того, удержанная на мембране полинуклеотидфосфорилаза может использоваться в фосфоролизе многократно.

Пример. В термостатируемый при 45°С сосуд помешают 50 мл раствора, содержащего 125 мг (325 ммоль) рибосомальных нуклеиновых кислот Е. СоИ (19,8 ед. оп-пл/мг-см., Д28о/д2бо 0,48) в 0,1 М трис-На буфере (рН 8,0), 50 моль ортофосфора в виде К2НРО4, 7,5 ммоль Mg(CH3COO)2 и 0,75 ммоль трилона Б. Затем в реакционной смеси добавляют 260 единиц активности полинуклеотидфосфорилазы (1 единица за 10 мин превращает в полимер 1 ммоль аденозин-5-диофосфата). За превращением рибосомальных нуклеиновых кислот в рибонуклеозид-5-дифосфаты следят по накоплению кислоторастворимой фракции, принимая за 100% превращения кислоторастворимую фракцию пделочного гидролизата реакционной смеси. По окопчанпи фосфоролиза реакционную смесь фильтруют через ультрапорпстую мемо

брану (диаметр пор 15 А, проницаемая для молекул с молекулярным весом до 10000 дальтон) под давлением 1-5 атм сжатого воздуха. В результате фильтрации полинуклеотидфосфорилаза удерживается на мембране, а рибопуклеозид-5-дифосфаты оказываются в фильтре. При необходимости далее рибопуклеозид5-дифосфаты разделяют на индивидуальные известным способом.

Аналогичным образом выполнен фосфоролиз 19 порций (по 50 мл) раствора рибосомальных нуклеиновых кислот. Выход рибопуклеозид5-дифосфатов, определенный по окончании фосфоролиза 1-ой, 2-ой и 18-ой порций был соответственно 82%, 90%, 92%, причем для фосфоролиза всех порций использовалась полинуклеотидфосфорилаза, первоначально добавленная к первой порции и собираемая затем с мембраны после каждой фильтрации. Фермент, использованный в таком числе порций, сохранил свою активность практически полностью.

Целевой продукт идентифицирован хроматографически, испытан в ферментативных реакциях и оказался пригодным для получения синтетических полирибонуклеотидов.

Формула изобретения

Снособ получения рибонуклеозид-5-дифосфатов фосфоролизом рибосомальных нуклеиновых кислот при нагревании и рН 8,0 в присутствии фермента полинуклеотидфосфорилазы, ортофосфата щелочного металла и водорастворимой соли магния, отличающийся

тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта и упрощения процесса, фосфоролиз проводят при 40-50°С, концентрации рибосомальных нуклеиновых кислот 6-7 ммоль, ортофосфата в виде К2НР04 35-50 ммоль

и водорастворимой соли магния в виде Mg(CH3COO)2 7-8 ммоль, при этом целевой продукт выделяют фильтрацией через ультрапористую мембрапу. Источник информации, принятый во -внимание при экспертизе изобретения:

1. Блеслер С. Е., Фирсов А. Е., Чернаенко В. Н. «Прикладная биохимия и микробиология, т. 10, вып. 1, стр. 80--84, 1974.