Способ выделения термостабильной плацентарной щелочной фосфатазы Советский патент 1984 года по МПК C12N9/16 

00

IND

00 Изобретение относится к биохимии и медицине и касается способов вьще ления ферментов, в частности щелочной плацентарной фосфатазы. Известно, что некоторые злокачественные опухоли обладают способнос тью к неосинтезу щелочной фосфатазы Значение, этого фермента весьма вели ко для клинических наблюдений. Известен способ вьщеления термостабильной плацентарной фосфатазы, предусматривающий экстрагирование фермента из сырья 30%-ным бутанолом фракционное осаждение ацетоном, кратковременную термообработку (обы но при ) , фракционирование белков сульфатом аммония (45-62%), хро матографию ферментсодержащего раствора на диэгиламиноэтилсефадексе А-50, гельфильтрацию на сефадексе G-100 и кристаллизацию С JОднако данный способ обеспечивает сохранение активности фермента л/52,3% (органические растворители вызывают денатурацию белка и увеличивают потери активности). Цель изобретения - повышение сохранения активности фермента. Указанная цель достигается тем, что согласно способу вьщеления термостабильной плацентарной щелочной фосфатазы, предусматривающему экстрагирование фермента из сьфья, термо обработку экстракта и фракционирование белков из раствора сульфатом аммония, экстрагирование осуществляют ЗМ раствором КС1 при соотношении 1:(3-4), для фракционирования исполь зуют 1,0-1,5%-ный раствор хлористого цетилпиридиния в 4-5-кратном избытке к обрабатываемому раствору и сульфат аммония в количестве 30-65% от степе ни насыщения. Способ обеспечивает сохранение активности фермента до 72%. Пример 1. Отмытую от крови человеческую плаценту (100,0 г) гомогенизируют при 8000 об/мин 5 мин. Добавляют в соотношении 1:3 раствор 3 М КС1 и перемешивают на магнитной мешалке при 4с в течение 12 ч. Раст вор центрифугируют при 6000 об/мин 30 мин. Осадок опбрасывают, иадосадочную жидкость диализируют против дистиллированной воды в 2 смены по 60 мин и против 0,1 н.раствора NaCl также в 2 смены по 60 мин. Экстракт прогревают при 10 мин.. К объему исходного гжстрпкт/ влятт на магнитной мсчиллко раствор хлористого цетилпи1)ИЛ1)Н11Я в соотношении 1:4 и помещают и- :-:олод (-4°С) на 60 мин. Экстряк центрифугируют при 6000 об/мин 30 мин. Падосадочную жидкость отбрасывают, а осадок растворяют в 3,3%-ном pacTHOpe NaCl. Диализируют против дистиллированной воды 60 мин. На следующем этапе т-ихеления экстракт насыщают сернокислым аммонием (30%). Центрифугируют при 6000 об/мин в течение 30 мин. Осадок отбрасывают, а надоеадочкую жидкость насыщают 65%-нык сернокисл1.1м аммонием. Проводят диализ. Центрифугируют 6000 об/мин 30 мин, надосадочную жидкость отбрасывают, а осадок растворяют в минимальном объеме трис-буфера (рН 8,6). После этих этапов пробы ставят в препаративный электрофорез на 2 ч в полиакриламидном геле. Окрашивают на щелочную фосфатазу: субстрат нафтил Л8-Ол- 1)Осфат, краситель прочный синий ВВ-буфер веронал-мединаловый pf 8,6. Цод визуальным контролем выу резают фракции терм(5стабильной плацентарной щелочной фосфатазы I и II, т.е. получают в раздельном виде фракции изоэнзимов термостабильной плацентарной щелочной фосфатазы I и II в чистом виде. Суммарное количество белка по Лоури 48 мг. Пример 2. Отмытую от крови плаценту (100,0) гомогенизируют 7000 об/мин 5 мин. Добавляют 3 М КС1 в соотношении 1:4 и перемешивают на магнитной мешалке в течение 14 ч. Раствор центрифугируют 5000 об/мин 25 мин. Осадок отбрасывают, а надосадочную жидкость диализируют в 2 смены против дистиллированной воды по 90 мин и в 2 смены по 90 мин против 1 н.раствора NaCl. Экстракт нагревают при 12 мин. Добавляют 1,5%-ный цетшширидиний хлористый в соотношении 1:5 на магнитной мешалке, помещают на холод (-4 С) на 90 мин. Центрифугируют со скоростью 5000 об/мин 20 мин. Недостаточную жидкость отбрасывают, осадок растворят н 4%-ном растворе NaCl. Диализируют против дистиллированной воды 90 мин. На следующем этапе насыщак-.-: сернокислым аммонием и интерпа.ги 3560%. Центрифугируют со скоростью 5000 об/мин 20 мин. ( p;uTiui inют в минимальном объеме трис-буфера (рН 8,6). Пробы ставят в препаративный электрофорез в полиакриламидном геле. В результате осуществления пред латаемого способа получены изоэнзимы термостабильной щелочной фосфатазы I и II в чистом виде. Суммарное коРезультаты выделения те плацентар-ной личество белка по Лоури 40 мг. Полученные фракции могут быть использованы для получения моноспецифических сывороток для использования в медицине . Результаты выделения фермента приведены в табл. 1 и 2. Таблица 1 стабильной щелочной фатазы

СПОСОБ ВЬЩЕЛЕННЯ ТЕРМОСТАБИЛЬНОЙ ПЛАЦЕНТАРНОЙ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ, предусматривающий экстрагирование фермента из сырья, термообработку экстракта и фракционирование белков из раствора сульфатом аммония,отличающийся тем, что, с целью повьшения сохранения активности фермента экстрагирование осуществляют 3 М раствором хлористого калия при соотношении 1:

Начальный Бутанольная 12970 12620 1,43 экстракция КС1-экстракция (п1эедлагаемый способ) 12970 28600 Конечный выход Известный споПриме

Экстракт плаценты после об,работки 3 М хлористым калием

Конечный выход 2,2

100,0

68000

2,17 72,0 23,77 4,5 ча ние. Расчет производился по количеству щелочной фосфатазы (щ.ф.) в растворе бутанолового экстракта с учетом потерь в процессе выделения (прототип) и количеству выхода целевого продукта. Выделение плацентарной термостабильной щелочной 1,2 Таблица 2 фосфатазы

510828116

Предлагаемым способом достигает- ство реактивов, исключается применеся сокращение времени исследованияние высокоскоростных рефрижераторных

на 7-8 сут, увеличение выхода целе-центрифуг и дорогостояшей аппаратуры. вого продукта в чистом виде из состава тканевых мембран в 5-6 раз, а 5 Таким образом, способ обеспечиватакже при осуществпении предлагаемо-ет сохранение активности фермента

го способа требуется меньшее количе-при выделении до 72%.