Способ выделения термостабильной плацентарной щелочной фосфатазы Советский патент 1985 года по МПК C12N9/14 

00

эо 4 Изобретение относится к медицине а именно в биохимии, и может быть использовано для выделения термостабильной плацентарной щелочной фосфатазы.. Известен способ вьщеления щелочно фосфатазы, включающий обработку гомо гената ткани бутанолом, фракционирование ацетоном и сульфатом аммония, гельфильтращт и ионообменную хро- . матографию С Недостатками данного способа являются его сложность, длительность И. низкий вь;ход целевого продукта. Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому эффекту является способ вьщеле ния термостабильной плацентарной щелочной фосфатазы, предусматривающий экстрагирование ткани 3 М раствором хлористого натрия, прогревание экстракта в течение 10 мин при фракционирование хлористым цетилпи ридинием и сульфатом аммония, диализ-. и очистку целевого продукта электрофорезом в полиакриламидном геле t Недостатками известного способа являются невысокий выход целевого продукта (72%), а также его сложност заключающа яся в наличии двух стадий фракционирования. Цель изобретения - увеличение выходацелевого продукта и упрощение способа. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу выделения термостабильной плацентарной щелочной фосфатазы, предусматривающему экстрагирование ткани раствором хлористого натрия, прогревание экстракта, диализ и электрофорез в полиакри ламидном геле, перед диализом проводят повторное прогревание в присутствии О,14-0,18%-ного сернокислого кадмия при 62-65 С в течение 1-5 мин. Эффективность очистки при варьировании в предлагаемых интервалах концентраций сернокислого кадмия, температуры и времени практически не изменяется. За пределами этих интервалов или не достигается очистки фермента, например прогревание при 45°С, или происходит его инактивация (табл. 1). Прогревание без добавления сернокислого каДмия приводит к 4,3-кратному увеличению удельной активности целевого продукта. Добавление сернокислого кадмия в концентрации 0,14-0,18% не приводит к значительному увеличению удельной активности: в этом случае выпадает в осадок около 30% балластных белков и удельная активность фермента возрастает в 13,5 раз. Однако одновременное проведение двух обработок сернокислым кадмием и нагреванием, приводит к 15-кратной очистке с очень высоким выходом более 90%. П р им ер 1.1 этап. Приготовление плацентарного тканевого экстракта: гомогенизация при 8000 об./мин в течение 5 мин отмытой от крови плаценты в 3 М растворе хлористого калия (вес-объемное соотнощение 1:3-4); перемешивание на магнитной мешалке при в течение 12 ч; центрифугирование при 6000 об./мин в течение 30 мин. Дальнейшее иссле- дование проводят с надосадочной жид-: костью после диализа против дистиллированной воды (2 смены по 60 .мин) и 0,1 моль раствора хлористого натрия (2 сме.ны по 60 мин) . 2этап. Полученньй плацентарный экстракт прогревают при 65С в течение 10 мин и центрифугируют при 8000 об./мин в.течение 20-30 мин. 3этап. К надосадочной жидкости добавляют сульфат кадмия из расчета 0,14%-ной концентрации в итоговом растворе и проводится повторное прогревание при 65с в течение 3 мин. Осадок отделяют путем центрифугирования при 8000 об./мин в течение 2030 мин. 4этап. Надосадочную жидкость диализуют в течение 10-12 ч против ацетатного буфера (рН 4,5). 5этап. Дрочищение препарата проводится методом препаративного диск-электрофореза в 7%-ном полиак-г риламидном геле с последующим извлечением из геля термостабильной щелочной фосфатазы электрофоретически. Гель, содержащий фермент, вырез-ают под визуальным контролем после окрашивания методом азосочетания (субстрат - нафтол - As - BS - фосфат, краситель - прочный синий соль В). Количество очищенной термостабильной щелочной фосфатазы определяют меГодом Лоури. Результаты очистки термостабильной щелочной фосфатазы плаценты даны в табл. 2. 3 Пример 2. Выделение провод аналогично примеру 1, но используют 0,18%-ный раствор сульфата кадмия. Выход на этой стадии составляет 93% против 93,1% ПОпримеру 1. Зависимость активности щелочной фосфатаэы от условий выделения (тем пературы ц концентрации сульфата кадмия) дана в табл. 1. Прогревание при в течение 1 или 5 мин приводят к тем же результатам (табл. 1). При введении вместо сульфата кадмия 0,28%-ного сульфата натрия 04 при последующем прогревании не наблюдается увеличение выпадания в осадок балластных белков по сравнению с контрольным опытом, в котором не добавляют никаких солей. Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет значительно увеличить выход целевого продукта с 72% до 92,9%, а также значительно упростить выделение фермента за счет замены стадий фракционирования хлористым цетилпиридинием и сульфатом аммония простейшей стадией термообработки. Таблица 1

СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ТЕРМОСТАБИЛЬНОЙ ПЛАЦЕНТАРНОЙ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ, предусма;тривакяций экстрагирование ткани раствором хлористого натрия, прогревание экстракта, диализ и электрофорез в полиакриламидном геле, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода . целевого продукта и упрощения способа, перед диализом проводят повторное прогревание в присутствии 0,14-0,18%-ного сернокислого кадмия iпри 62-65 С в течение 1-5 мин. (О

Прогревание при

Прогревание при

Добавление сульфа кадмия при прогревании

: 0,14% 0,18%

: 0,14% 0,18

80С : 0,14 0,18

0,26%

6850

2,3

100,0 9,8

15-20 93,8

. Экстракт после обрабохки хлористым

Таблица 2