Способ выделения термостабильной плацентарной щелочной фосфатазы Советский патент 1985 года по МПК C12N9/14 

Описание патента на изобретение SU1138410A1

00

эо 4 Изобретение относится к медицине а именно в биохимии, и может быть использовано для выделения термостабильной плацентарной щелочной фосфатазы.. Известен способ вьщеления щелочно фосфатазы, включающий обработку гомо гената ткани бутанолом, фракционирование ацетоном и сульфатом аммония, гельфильтращт и ионообменную хро- . матографию С Недостатками данного способа являются его сложность, длительность И. низкий вь;ход целевого продукта. Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому эффекту является способ вьщеле ния термостабильной плацентарной щелочной фосфатазы, предусматривающий экстрагирование ткани 3 М раствором хлористого натрия, прогревание экстракта в течение 10 мин при фракционирование хлористым цетилпи ридинием и сульфатом аммония, диализ-. и очистку целевого продукта электрофорезом в полиакриламидном геле t Недостатками известного способа являются невысокий выход целевого продукта (72%), а также его сложност заключающа яся в наличии двух стадий фракционирования. Цель изобретения - увеличение выходацелевого продукта и упрощение способа. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу выделения термостабильной плацентарной щелочной фосфатазы, предусматривающему экстрагирование ткани раствором хлористого натрия, прогревание экстракта, диализ и электрофорез в полиакри ламидном геле, перед диализом проводят повторное прогревание в присутствии О,14-0,18%-ного сернокислого кадмия при 62-65 С в течение 1-5 мин. Эффективность очистки при варьировании в предлагаемых интервалах концентраций сернокислого кадмия, температуры и времени практически не изменяется. За пределами этих интервалов или не достигается очистки фермента, например прогревание при 45°С, или происходит его инактивация (табл. 1). Прогревание без добавления сернокислого каДмия приводит к 4,3-кратному увеличению удельной активности целевого продукта. Добавление сернокислого кадмия в концентрации 0,14-0,18% не приводит к значительному увеличению удельной активности: в этом случае выпадает в осадок около 30% балластных белков и удельная активность фермента возрастает в 13,5 раз. Однако одновременное проведение двух обработок сернокислым кадмием и нагреванием, приводит к 15-кратной очистке с очень высоким выходом более 90%. П р им ер 1.1 этап. Приготовление плацентарного тканевого экстракта: гомогенизация при 8000 об./мин в течение 5 мин отмытой от крови плаценты в 3 М растворе хлористого калия (вес-объемное соотнощение 1:3-4); перемешивание на магнитной мешалке при в течение 12 ч; центрифугирование при 6000 об./мин в течение 30 мин. Дальнейшее иссле- дование проводят с надосадочной жид-: костью после диализа против дистиллированной воды (2 смены по 60 .мин) и 0,1 моль раствора хлористого натрия (2 сме.ны по 60 мин) . 2этап. Полученньй плацентарный экстракт прогревают при 65С в течение 10 мин и центрифугируют при 8000 об./мин в.течение 20-30 мин. 3этап. К надосадочной жидкости добавляют сульфат кадмия из расчета 0,14%-ной концентрации в итоговом растворе и проводится повторное прогревание при 65с в течение 3 мин. Осадок отделяют путем центрифугирования при 8000 об./мин в течение 2030 мин. 4этап. Надосадочную жидкость диализуют в течение 10-12 ч против ацетатного буфера (рН 4,5). 5этап. Дрочищение препарата проводится методом препаративного диск-электрофореза в 7%-ном полиак-г риламидном геле с последующим извлечением из геля термостабильной щелочной фосфатазы электрофоретически. Гель, содержащий фермент, вырез-ают под визуальным контролем после окрашивания методом азосочетания (субстрат - нафтол - As - BS - фосфат, краситель - прочный синий соль В). Количество очищенной термостабильной щелочной фосфатазы определяют меГодом Лоури. Результаты очистки термостабильной щелочной фосфатазы плаценты даны в табл. 2. 3 Пример 2. Выделение провод аналогично примеру 1, но используют 0,18%-ный раствор сульфата кадмия. Выход на этой стадии составляет 93% против 93,1% ПОпримеру 1. Зависимость активности щелочной фосфатаэы от условий выделения (тем пературы ц концентрации сульфата кадмия) дана в табл. 1. Прогревание при в течение 1 или 5 мин приводят к тем же результатам (табл. 1). При введении вместо сульфата кадмия 0,28%-ного сульфата натрия 04 при последующем прогревании не наблюдается увеличение выпадания в осадок балластных белков по сравнению с контрольным опытом, в котором не добавляют никаких солей. Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет значительно увеличить выход целевого продукта с 72% до 92,9%, а также значительно упростить выделение фермента за счет замены стадий фракционирования хлористым цетилпиридинием и сульфатом аммония простейшей стадией термообработки. Таблица 1

Похожие патенты SU1138410A1

название год авторы номер документа
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ И ОЧИСТКИ ПЛАЦЕНТАРНОЙ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ 2011
  • Коханов Александр Владимирович
  • Белопасов Владимир Викторович
  • Меснянкин Александр Алексеевич
  • Ямпольская Ирина Сергеевна
  • Луцева Оксана Алексеевна
RU2492868C2
Способ выделения термостабильной плацентарной щелочной фосфатазы 1982
  • Голубев Аркадий Михайлович
  • Морозкин Олег Владимирович
  • Кулагин Павел Павлович
  • Володин Михаил Александрович
SU1082811A1
Способ получения плацентарного лактогена 1981
  • Шевченко Ольга Павловна
  • Петрунин Дмитрий Дмитриевич
  • Цагараева Тамара Михайловна
  • Огольцова Наталья Ивановна
SU983127A1
Способ получения молокосвертывающего ферментного препарата 1986
  • Бойко Михаил Иванович
  • Негруцкий Сергей Федорович
  • Мирошниченко Татьяна Владимировна
SU1395672A1
Способ получения конъюгированного энтеротоксина ЕSснеRIснIа coLI 1989
  • Гнатенко Григорий Вакулович
  • Сухарев Юрий Станиславович
SU1750690A1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТИМИЧЕСКИХ ПЕПТИДОВ 2006
  • Калашников Владимир Васильевич
  • Самсонов Алексей Яковлевич
  • Калашников Дмитрий Владимирович
  • Фалалеева Дина Муратовна
  • Самсонова Елена Александровна
  • Самсонов Павел Алексеевич
RU2332423C2
СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ ПЛАЦЕНТАРНОГО ТИПА 2014
  • Николаев Александр Аркадьевич
  • Плосконос Мария Вячеславовна
  • Ахушкова Лейла Магомедовна
RU2584328C2
Способ очистки поверхностного антигена вируса гепатита В (НВ @ А @ ) 1990
  • Калугин Евгений Олегович
  • Щеголев Александр Семенович
  • Голованова Тамара Валерьевна
  • Абдукаюмов Мелис
SU1776415A1
РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК РТТG КM2, КОДИРУЮЩАЯ СИНТЕЗ РЕКОМБИНАНТНОГО ИММУННОГО ИНТЕРФЕРОНА ЧЕЛОВЕКА, ШТАММ ESCHERICHIA COLI T3G - ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО ИММУННОГО ИНТЕРФЕРОНА ЧЕЛОВЕКА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ИММУННОГО ИНТЕРФЕРОНА ЧЕЛОВЕКА 1996
  • Черепанов П.А.
  • Павлов В.М.
  • Федюкин В.С.
  • Шматченко Н.А.
  • Асташкина Г.Ф.
  • Воротникова И.И.
  • Гавриков В.Г.
  • Байдусь А.Н.
  • Михайлова Т.Г.
  • Денисов Л.А.
  • Ураков Н.Н.
  • Степанов А.В.
RU2097428C1
ШТАММ ГРИБА PENICILLIUM ESTINOGENUM A.KOMATSU ET S. ABE EX G. SM. - ПРОДУЦЕНТ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ P И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ 2002
  • Балабанова Л.А.
  • Пивкин М.В.
  • Гафуров Ю.М.
  • Рассказов В.А.
RU2220198C1

Реферат патента 1985 года Способ выделения термостабильной плацентарной щелочной фосфатазы

СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ТЕРМОСТАБИЛЬНОЙ ПЛАЦЕНТАРНОЙ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ, предусма;тривакяций экстрагирование ткани раствором хлористого натрия, прогревание экстракта, диализ и электрофорез в полиакриламидном геле, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода . целевого продукта и упрощения способа, перед диализом проводят повторное прогревание в присутствии 0,14-0,18%-ного сернокислого кадмия iпри 62-65 С в течение 1-5 мин. (О

Формула изобретения SU 1 138 410 A1

Прогревание при

Прогревание при

Добавление сульфа кадмия при прогревании

: 0,14% 0,18%

: 0,14% 0,18

80С : 0,14 0,18

0,26%

6850

2,3

100,0 9,8

15-20 93,8

. Экстракт после обрабохки хлористым

Таблица 2

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 1985 года SU1138410A1

Печь для непрерывного получения сернистого натрия 1921
  • Настюков А.М.
  • Настюков К.И.
SU1A1
Lehman P.G., Lehman D
Reganisoenzym: Isolierung der alkalishen Prosphatase des menshlicher Placenta und Entwicklung einer emphf indlichen Hethode fur die Fxmrordiagnostick.-Wern
Heutsch
Ger
.iMed
Капельная масленка с постоянным уровнем масла 0
  • Каретников В.В.
SU80A1
Wiesbaden, 1974, p
Металлический ключ для пчеловодов 1924
  • Соколов М.П.
SU1658A1
Аппарат для очищения воды при помощи химических реактивов 1917
  • Гордон И.Д.
SU2A1
Топка с несколькими решетками для твердого топлива 1918
  • Арбатский И.В.
SU8A1
Способ гальванического снятия позолоты с серебряных изделий без заметного изменения их формы 1923
  • Бердников М.И.
SU12A1

SU 1 138 410 A1

Авторы

Володин Михаил Александрович

Даты

1985-02-07Публикация

1982-09-10Подача