Способ получения плацентарного лактогена Советский патент 1982 года по МПК C07G7/26 A61K35/50 

1

Изобретение относится к биохимии, в частности к препаративной и технологической биохимии, и может быть использовано для.,получения очищенных биологически активных препаратов, применяемых в медицине с целью контроля за развитием беременности, оценки функционального состояния фето-плацеягарной системы и диагностики осложнений беременности.

Известен способ получения плацентарного лактогена из плаценты путем экстракции д

трио-глициновым буфером, последовательного осаждения при рН 6,5 и,4,5 сернокислым аммонием, колоночной хроматографии на амберлите С G-50, повторного осаждения сернокислым аммонием, диализа, лиофшшзации, изю- ,5 электрического осаждения я фракционирования этанолом 11.

Однако этот способ трудоемок и не обеспечивает высокого выхода белка.

Известен также способ получения плацентар- 20 ного лактогена, включающий измельчение плаценты человека, экстракцию физиологическим раствором, обработку раствором риванола и последующее выделение целевого продукта 2.

Известный способ также не обеспечивает достаточно высокого выхода белка, является длительным и сложным из-за необходимости использования дорогостоящих реактивов и оборудования.

Целью изобретения является увеличение выхода целевого продукта.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения плацентарного лактогена, включающему измельчение плаценты человека, экстракцию физиологическим раствором, обработку раствором риванола и последующее вьщеление целевого продукта, экстракт плаценты обрабатывают равным объемом окиси алюминия, полученный осадок последовательно отмывают дистиллнрованнЪй водой, раствором хлористого натрия и вновь дистиллированной водой, затем элюиру|рт насыщенным раствором двузамещенного гидрофосфата натрия, полученный элюат обрабатывают раствором риванола, осадок раствортот в растворе хлористого иатрия, фильтруют , полученную фракцию обрабатывают силикагелем, полученный осадок отмывают последовательно дистиллированной водой. раствором сернокислого аммотш и вновь дистиллированной водой, после чего элюируют раствором углекислого натрия, элюат диализуют против л 1стиллиропатюй подм и лиофили:эир та .Пример 1. Зрелую плаценту, отмытую от крови, измельчают, добавляя равный объем физиологического раствора, полученную смесь растирают до получения гомогенной массы и замораживают. После 3-кратного замораживания И оттаивания гомогенат центрифугируют в течеиие 30 мин при 8000 д. К 500 мл полз енной в результате центрифугирования надосадочной жидкости добавляют 500 г влажной окиси алюминия,, смесь инкубируют при постоянном помешивании 20 мин, затем центрифугируют 20 мин при 8000 д, надосадочную жидкость удаляют, а осадс к отмывают 10-кратным о&ьемом дистиллированной водь(, трижды отмы вают равным объемом 10%-ного раствора хлористого натрия и вновь отмывают 10-кратным объемом дистиллированной воды, каждый раз удаляя осадок с помощью центрифугирования. К отмытому таким образом Сорбенту добавляют 500 мл насыщенного раствора двузамещенного гидрофосфата натрия, инкубируют 20 мин при постоянном помешивании, цеитрифугируют. К получегашй надосадоч1юй жидкости добавляю 500 мл 0 5%-ного раствора риванола и оставляют на сутки при 4° С. Образовавшийся осадок отделяют центрифугированием, растворяют в 400 мл 10%-ного раствора хлористого натрия, фильтруют через бумажный фильтр. Полученный фильтрат обрабатывают равным объемом влажгюго силикагеля, инкубируют при постоянном помешивании в течение 20 мин, центрифугирую 20 мин при 8000 д. Осадок отмывают 10-крат ным обьемом дистиллированной воды, 3-кратным объемом 30%-ного раствора сернокислого аммония и вновь 10-кратным объемом дистиллированной воды. К полученному при помоши центрифугирования сорбенту добавляют 300 мл 10%-иого раствора углекислого натрия, инкубируют 20 мин, осадок отделяют центрифугиро ванием, надосадочную жидкость диализуют прО тив дистиллированной воды и лиофилизируют. Таким образом, из 1 кг плаценты получают 35-40 мг препарата плацентарного лактогена с чистотой 95%. Пример 2. Зрелую плаценту зкстрагируют физиологическим раствором и адсорбируют на окиси алюминия, как описано в примере 1. Сорбент отмывают 10-кратным объемом дистшипфованной воды, 3-кратньтм обьемом . 8%-ного раствора хлористого натрия и вновь }0-кратным объемсям воды. К отмытому адсорбенту добавляют 400 мл насыщенного раствора двузамещенного гидрофосфата натрия, инкубируют 20 мин, центрифугируют при 8000 g (20 мин. Надосадочную жидкость о ждают риванолом, как описано в примере 1. Образовавшийся осадок отделяют центрифугированием, растворяют в 300 мл физиологического раствора, фильтруют, получётгый фильтрат адсорбируют на силикагеле, как описано в примере 1, сорбент отмывают 10-кратным объемом дистиллированной воды, 3-кратным объемом 35%-rioro раствора сернокислого аммония и вновь 10кратным объемом воды. К отмытому адсорбенту добавляют 150 мл 8%-ногр раствор, уг-, лекислого натрия, инкубируют 20 мин, осадок удаляют центрифугированием, а надосадочную жидкость диализуют против дистиллированной воды и лиофилизируют. Получают 40-45 мг препарата плацентарного лактогена, с чистотой 90-95%. Пример 3. Плаценту обрабатывают, . как описано в примере 1. Полученный препарат плацентарного лактогена растворяют в физиологическом растворе (1 мг препарата в 1 мл раствора) , добавляют I мл 2%-ногр раствора алюмокалиевых квасцов в качестве альюванта и используют для получения антисывороток. Таким образом, используя предлагаемый, способ, из 1 кг сьфья (плаценты) можно получить 40 мг препарата плацентарного лактогена с чистотой 95%, обладающего хорошей иммуногенностью для кроликов, в то время, как по известному способу 10-15 мг из 1 кг сырья, т. е. прехшагаемый способ позволяет получить препарат не уступающий по качеству известному, втрое увеличив при этом его выход. Способ также отличается технической простотой и непродолжительностью, не требует применения дорогостоящих реактивов и оборудования. Формула изобретения:. Способ получения плацентарного лактогена, включающий измельчение плаценты человека, зкстракцию физиологическим раствором, обработку раствором риванола и последующее выделение целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода целевого продукта, экстракт плаценты обрабатывают равным объемом окиси алюминия, полученный осадок последовательно отмывают диcтил лированной водой, раствором хлористого натрия и вновь дистиллированной водой, затем злюируют насьпценным раствором двузамещенного гиДрофосфата натрия, полученный элюат обрабатывают раствором риванола, осадок растворяют в растворе хлористого натрия, фильтруют, полученную фракцию обрабатьшают сшшкагелем, полученный осадок отмывают последовательно дистиллированной водой, раствором сернокислого аммония и вновь дистиллированной водой, после чего элюируют раствором углекислого натрия.

5985127

элюат диализуют против дистиллированнойctan«e . Immunplogically related to pituitary

воды и лиофилйзируют.growth hormone,- Endocrinoloay, v. 71,

Источники информации,pp.- 209-220,- 1962.

принятые во внимание при экспертизе2. Bohn Н. Kristaltisation and Hochgerei-

1. Josimovich J. В. и Maclaren J. A. Pre- 5nigung des Human Placenta lactogens.sence in the htmian of a highly lactogenic sub- Eperimentia, 1971, v. 27, p. 1223.