Способ очистки аспартат-трансаминазы из цитозоля куриных сердец Советский патент 1992 года по МПК C12N9/10 

со

с

Использование: в прикладной биохимии выделения ферментов, чувствительных к окислению. Сущность изобретения: на стадии фракционирования сульфатом аммония гомогената в качестве сульфата аммония используют препарат квалификации для спектрального анализа ТУ 6-09-4087-75 2 ил,, 1 табл.

Изобретение относится к медицине, в частности к прикладной биохимии.

Известен способ очистки аспартат- трансаминэзы из цитозоля куриных сердец путем фракционирования сульфатом аммония и этанолом с последующей кристаллизацией

Недостатком известного способа является невысокий выход целевого продукта, так как на стадии фракционирования сульфатом аммония примеси ионов металлов приводят к частичной инактивации фермента, в результате которой имеет место недостаточно полный выход получаемого белка.

Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта при сохранении наивысшей для данного белка удельной активации.

Поставленная цель достигается тем, что содержание ионов металлов в препарате сульфата аммония, используемого для фракционирования, составляет, мас.%, не более:

Алюминий0,0005

Кальций0,0005

Кремний0,0005

Магний0,0005

Железо0.00001

Кобальт0,00001

Никель0,00001

Медь0,00002

Мышьяк, олово, свинец, сурьмаОтсутствие

спектральных линий

На фиг. 1 приведены данные гельэлект- рофореза; на фиг. 2 - диаграмма.

Пример. Сердца измельчают на мясорубке, заливают 1,5 об. холодной дистиллированной воды, содержащей 1 мМ ЭДТА, и оставляют для экстракции на ночь при 4°С После экстракции фарш отделяют центрифугированием (2500 об/мин, 20 мин). К над- осадочной жидкости добавляют сульфат аммония до 40% насыщения (степень насыVI

СП

К)

VI

о

00

щения указана для 25°С), через 30-40 мин образовавшийся осадок отделяют центрифугированием (300 об/мин, 30 мин). К супер- натанту добавляют пиридоксаль-51 -фосфат (10 мкг/мл) и сульфат аммония (до 70% насыщения). После добавления сульфата аммония раствор оставляют на ночь при 4°С. Выпавший осадок собирают центрифугированием (3000 об/мин, 40 мин), растворяют в 0,005 М калий-фосфатном буфере рН 7,5 и диализируют против такого же буфера от солей в течение 24 ч при 4°С. После диализа к раствору добавляют пиридоксаль-5 -фос- фат(10 мкг/мл), предварительно растворенный в буфере рН 6,0, и а -кетоглутарат (до 10 мМ конечной концентрации), приготовленный на 0,125 М калий-фосфатном буфере так, чтобы конечное значение рН раствора было равно 5,0-5,1. и начинают осаждение этанолом.

Для осаждения берут небольшие порции (лучше по 100 мл) ферментного раствора, к ним приливают сразу всю порцию охлажденного до -50°С этанола (к 100 мл ферментного раствора необходимо прилить 120 мл этанола) до конечной концентрации 52 %. В ы павший осадок отделяют центрифугированием (3000 об/мин, 20 мин) и отбрасывают, а затем концентрацию этанола в супернатанте повышают до 70,5%. Для этого осаждения нет необходимости делить ферментный раствор на небольшие порции, поэтому этанол (охлажденный до -15°С), приливают сразу ко всему объему ферментного раствора. Осадок собирают центрифугированием (3000 об/мин, 5 мин), заливают небольшим объемом 0,005 М калий-фосфатного буфера рН 7,5 и оставляют на ночь при 4°С для экстракции фермента. От нерастворившегося осадка экстракт отделяют центрифугированием (15000 об/мин, 30 мин) и диализируют от этанола против 0,005 М калий-фосфатного буфера рН 7,5. Отдиализо- ванный раствор концентрируют, высаливая его сульфатом аммония (500 мг к 1 мл раствора), а затем высоленный осадок фермента растворяют в 0,005 М калий-фосфатном буфере рН 7,5 таким образом, чтобы концентрация белка в растворе была не менее 30 мг/мл.

Далее кристаллизуют фермент, для чего к холодному раствору небольшими порция- ими в течение 1 ч добавляют сульфат аммония до насыщения 42% После добавления всей навески сульфата аммония пробирку с

ферментным раствором оставляют в холодной бане на 10-15 мин, затем центрифугируют (6000 об/мин, 15 мин) для удаления механических примесей, а в прозрачный

раствор вносят затравочные кристаллы. Пробирку с раствором плотно закрывают и помещают в холодильник. На следующий день выпадают кристаллы фермента, их отделяют от маточника центрифугированием

(6000 об/мин, 15 мин) и растворяют в 0,1 М калий-фосфатном буфере рН 7,5.

По данным горизонтального гельэлект- рофореза на пластинке в полиакриламид- ном геле (фиг. 1) и последующего

сканирования геля на ULTROScan x L (фиг. 2) чистота фермента составляет 99% при наивысшей для данного фермента удельной активности, равной 70000 ед/мг.

Выход чистого цитозольного фермента

составляет 78% от общего количества указанной трансаминазы в экстракте и 70% от общего - .оличества суммарной активности двух трансаминаз - цитозольной и митохон- дриальной. Митохондриальная трансаминаза, обладающая отличающимися от цитозольной физико-химическими свойствами и являющаяся в данном случае примесным белком, отделяется на 1-й стадии очистки.

Схема очистки аспартат-трансаминазы из цитозоля куриных сердец (данные на 1 кг сердец) представлена в таблице. Формула изобретения Способ очистки аспартат-трансаминазы из цитозоля куриных сердец, включающий фракционирование сульфатом аммония, фракционирование этанолом и кристаллизацию, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого

продукта, фракционирование проводят сульфатом аммония, содержащим ионы металлов в количестве, мас.%, не более:

5

0

Алюминий

Кальций

Кремний

Магний

Железо

Кобальт

Никель

Мед

Мышьяк, олово, свинец,

сурьма

5

0,0005 0,0005 0.0005 0,0005

0,00001

0,00001 0,00001

0,00002

Отсутствие спектральных линий

SQQMxr 250mr 150мкг 50мкг 12мхг Бмхг

Фиг.1

U 1,6 1,5 W 1.3 1,2 1,1 tf.