Способ получения иммобилизованного в геле цитохрома @ Советский патент 1984 года по МПК C12N11/04 

Изобретение относится к получен иммобилизованных ферментных препаратов, а именно к получению иммобилизованного цитохрома Brt, которы используется для определения молоч ной кислоты. Известен способ иммобилизации цитохрома Bj, заключающийся в вклю чении фермента в гелевую структуру 5%-ного желатинового геля Л . Недостатками данного способа яв ляются низкий выход активности фермента при иммобилизации (10,4%) а также низкая стабильность - 50%ная инактивация за 3,83 ч. Наиболее близким к предлагаемом является способ получения иммобилизованного в геле цитохрома В, включакшщй полимеризацию геля из альбумина в присутствии глутар вог альдегида, цитохрома Вл и молочной кислоты zj , Недостатком иммобилизации цитохрома В в альбуминовом геле в при сутствии молочной кислоты является низкая стабильность получаемого фермента, так как последний инакти вируется на 50% в течение 9,2 14,1 ч. Цель изобретения - повышение стабильности целевого продукта. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения иммобилизованного в геле цитохрома Вя t включающему полимеризацию геля из альбумина в присутствии глутарового альдегида, цитохрома В2 и молочной кислоты, при полимеризации геля дополнительно вводят декстраны с мол. мае. от 40 000 до 60 000 дальтон. Использование.высоких концентра ций глутарового альдегида и получение прочного жесткого геля, в ко тором, благодаря добавлению высоко молекулярного декстрана, цитохром В2 обеспечивает высокую стабильность (табл. 1). Пример 1. 75 ед. цитохрома BI, 20 мг декстрана (мол. мае. 40000) и20 мг бычьего сывороточного альбумина растворяют в 0,2 мл О,01 М фосфатном буфере рН 7,2,содержащем 0,1 М КСе и 10 мкм молочной кислоты. В раствор добавляют 0,05 мл 25-ного.глутарового альдегида и на целлофановую мембрану толщиной 35 мкм и площадью 30 см. Мембрану накрывают второй такой же диализной мембраной и вьщерживают в холодильнике при +3-5 в течение 6 ч. Полученный иммобилизованный фермент разрезают на кусочки (2x2 см2) . Пример 2. Иммобилизацию проводят аналогично примеру 1 , но вместо декстрана с мол. мае. 40000 используют декстран с мол.мае. 20000 дальтон. , Пример 3. Иммобилизацию проводят аналогично примеру 1, только вместо декстрана с мол. мае. 40000 используют декстран с мол. мае. 60000 дальтон. Иммобилизованный в присутствии декстранов цитохром BI в течение 6 сут теряет только 70% своей активности (фиг. 2). Наилучшие результаты получают, применяя декстран с мол. мае. 40000 - 60000 дальтон. Предлагаемый ецособ позволяет получить иммобилизованньй цитохром Вя, который инактивируется на 50% только в течение 66,7-79,6 ч. По сравнению с известным способом стабильность возрастает 4,7-8,7 раза, т.е. иммобилизованный согласно предлагаемому способу фермент способен превратить в 5-8 раз больше количество субстрата до полной инактивации цитохрома, количество превращаемого субстрата равно , где А« начальная активность, К - константа инактивации, k 0,69 ( 50). В табл. 1 дан выход по активности стабильность цитохрома В при разных способах иммобилизации.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОГО В ГЕЛЕ ЦИТОХРОМА В вКлючаювщй полимеризацию геля из альбумина в присутствии глутарового альдегида, цитохрома 2 молочной кислоты, отличающийся тем, что, с целью повышения стабильности целевого продукта, при полимеризации геля дополнительно вводят декстраны с мол. мае. от 40 ОрО до 60 000 дальтон.