Рекомбинантная плазмидная ДНК pIL-2/21, кодирующая человеческий интерлейкин-2, способ ее конструирования и штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент человеческого интерлейкина-2 Советский патент 1992 года по МПК C12N15/26 C12N1/21 

Изобретение относится к медицине, биотехнологии и генетической инженерии, и может быть использовано для получения человеческого белка интерлейкина-2 в клетках E.coli.

Целью изобретения является создание бактериального штамма-продуцента человеческого IL-2, обеспечивающего высокое содержание целевого белка в биомассе.

Для этого сконструирована рекомбинантная плазмидная ДНК plL-2/21, обеспечивающая экспрессию гена человеческого интерлейкина-2, состоящая из:

-EcoR l-EcoR l-фрагмента ДНКфага Mia rpm с регуляторной областью гена rec A Proteus mirabilis;

-фрагмента ДНК с синтетическим геном IL-2 человека и инициирующим ATG-ко- доном;

- плазмидного вектора, обеспечивающего терминацию транскрипции гена и селективный отбор клонов по устойчивости к ампициллину, Для получения piL-2/21 синтетический ген человеческого IL-2 соединяют последовательно с олигонуклеотидом. содержащим ATG-кодон, и регуляторной по- следовательностью гее А из Proteus mirabilis и интегрируют в векторную плэз- миду pDSt +o.

Рекомбинантную плазмидную ДНК pIL- 2/21 трансформируют в клетки E.coli SG 20050, в которых проводят экспрессию гена человеческого IL-2. Индукцию регуляторной системы Proteus mirabilis осуществляют ми- тогеном типа митомицина С. Синтез белка IL-2 в клетках фиксируют методом электрофореза в ПААГ, а его идентификацию - с

XI

со О (Л

помощью иммуноферментного анализа и биологической активности.

Штамм E.coli SG(plL-2/21) характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Клетки прямые, палочковидной формы 1,5x2,0x6,0 мкм, подвижные, с перитрихиальными жгутиками, грамотрицательные, неспороносные.

Культуральные признаки. Клетки хорошо растут на простых питательных средах. При росте на агаризованных средах образуют колонии гладкие, круглой формы, блестящие, серые, край неровный, мутные. При росте в жидких средах, мясопептонном бульоне, L-бульсне образуют ровную интенсивную муть.

Физиолого-биохимические признаки. Клетки растут в пределах 10-40° С при оптимуме рН 6,8-7,6. В качестве источника углерода используют многие углеводы, спирты,органические кислоты,в частности, глюкозу, фруктозу, лактозу, галактозу. В качестве источника азота используют минеральные соли в аммонийной и нитратной формах и в органической форме - пептон, аминокислоты, нитраты, восстановленные до нитратов.

Желатину не разжижают. Уреазная активность не обнаружена. Индол не образуют.

Устойчивость к антибиотикам. Проявляют устойчивость к ампициллину, обусловленную наличием плазмиды plL-2/21, и растут в при концентрации ампициллина от 20 до 100 мкг-мл,

Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов ВНИИ генетика под номером ВКМ8- 5542.

Уровень синтеза IL-2 в сконструированном штамме составляет при плотности культуры 10 клеток/мл около 50 мг/л или 30-35% от общего количества клеточного белка, что позволяет рассматривать сконструированный штамм как продуцент, потенциально пригодный для получения белка IL-2.

П р и м е р 1. Конструирование реком- бинантной плазмиды pBIL-2.

10 мкг ДНК рекомбинантной плазмиды plL-2 последовательно гидролизуют ре- стриктазами Нае i I и Sale l сначала в 100 мкл буфера 1(50 мМ трис-HCI, рН 7,5, 10 мМ MgCl2, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 50 мМ NaCI), а затем в буфере 2(50 мМ трис-HCI рН 7,5, 10 мМ NgCl2, 120 мМ NaCI, 10 мМ 2-меркаптоэтанол) в течение 3 ч при 37° С. Нае ll-SaIG l-фрагмент (399 п.о.) выделяют в 6% ПААГ.

1 мкг ДНК плазмиды pBR 322 совместно гидролизуют рестриктазами EcoR I (5 ед.) и SaIG I (5 ед.) в буфере 2 1 ч при 37° С. EcoR l-SaIG l-фрагмент (3710 п.о.) выделяют из

0,8% агарозы. Смесь 0,25 пкмоль EcoR I- SalG I- векторной формы pBR 322, 1 пкмоль Нае ll-SaIG 1-фрагмента plL-2 и 20 пкмоль фосфорилированного олигонуклеотида AATTCATGGCGC выдерживают в 30 мкл ли0 газного буфера (20 мМ трис-HCI, рН 7,5, 10 мМ MgCIa, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 1 мМ АТФ)с10едТ4-ДНК-лигазы 16 ч при 10° С. Реакционную смесь нагревают 10 мин при 70° С, добавляют dNTP до 1 мМ концентра5 ции, 5 ед. ДНК-полимеразы (фрагмент Клено- ва) и выдерживают еще 10 мин при 10° С. 10 мкл смеси используют для трансформации компетентных клеток E.coli JM 103. Из колоний, имеющих фенотип Apr, Tcs, выделяют

0 плазмидную ДНК, обозначенную pBIL-2, и проводят Nar I и (EcoR l-SaIG )-рестрикцион- ный ан.злиз. Правильность структуры нуклео- тидов в области сайтов EcoR I и SaIG I подтверждают методом Максама-Гилберта.

5П р и м е р 2. Конструирование рекомбинантной плазмиды pRIL-2.

20 мкг репликативной формы ДНК фага Mia rpm гидролизуют в 10,0 мкл буфера 2 50 ед, рестриктазы EcoR I 1 ч при 37° С. EcoR

0 l-EcoRI-фрагмент (198 п.о.) выделяют в 6% ПААГ.

1 мкг ДНК плазмиды pBIL-2 гидролизуют в 20 мкл буфера 2 рестриктазой Есог I в описанных выше условиях. Смесь 0,25

5 пкмоль линейной формы pBIL-2, I пкмоль (EcoR l-EcoR )-фрагмента Мтз rpm и 10 ед. Т4-ДНК-лигазы выдерживают в 50 мкл ли- газного буфера 16 ч при 10° С. 10 мкл реак- ционной смеси используют для

0 трансформации компетентных клеток E.coli JM 10 . ДНК рекомбинантных клонов анализируют с помощью (Sma 1-ЗаЮ)-гидролиза. Первичную структуру рекомбинантной ДНК pRIL 2 подтверждают методом Максама5 Гилберта.

ПримерЗ. Конструирование рекомбинантной плазмиды plL-2/21.

10 мкг ДНК pRIL-2 гидролизуют последовательно в 50 мкл буфера 1 и буфера 2

0 эндонуклеазы рестрикции Pst I (20 ед.) и SaIG I (20 ед.) Pst l-SaIG l-фрагмент (1359 п.о.) выделяют электрофорезом.

10 мкг плазмиды pDSt +o гидролизуют совместно эндонуклеазами рестрикции Pst

5 I (10 ед.) и Xho I (10 ед.) в 50 мкл буфера I 1 ч при 37° С. (Pst l-Xho 1)-фрагмент выделяют электрофорезом в 4% ПААГ. Смесь 0,25 пкмоль линейной формы pDSt2+o, 0,25 пкмоль Pst 1-SaiG l-фрагмента pRIL-2, и 10 ед. Т4-ДНК-лигазы в 50 мкл лигазного буфеpa выдерживают 16 ч при 10° С 10 мкл используют для трансформации компетентных клеток Б.coli JM 103 Из колоний, имеющих фенотип Apr, выделяют ДНК плазмиды plL-2/21 и анализируют ее эндонулеазами Bsp I и EcorI

П р и м е р 4. Экспрессия гена IL-2 в клетках Е coli SG-20050

Рекомбинантную плазмиду plL-2/21 трансформируют в клетки E.coli SG20050 Бактериальные клетки культивируют в 5 мл LB-среды при 37° С до плотности 05500 0,6-0,7, затем в среду добавляют ми- томицин С до концентрации 1 мМ и культивируют еще 4 часа в тех же условиях 1 мл клеточной суспензии центрифугируют и клетки ресуспендируют в 100 мкл лизирую- щего буфера (0,15 Мтрис-HCI, рН 6,8, ЮмМ 2-меркаптоэтанол, 2% SDS, 5% глицерин, 0,1% бромфеноловый синий) 10 мкл пол- ученного лизата наносят на 15% ПААГ с 1 % SDS и проводят электрофорез. Пластину геля обрабатывают 1 ч 10% ТХУ в20%-водном этаноле, после чего помещают в 0,25% раствор Кумасси R-250 на 30 мин при 56° С, затем выдерживают в 10% уксусной кислоте в этаноле. Содержание IL-2 в клеточном ли- зате составляет 30-35% от общего количества белка

П р и м е р 5 Иммуноферментный ана- лиз клеточных лизатов штамма-продуцента человеческого IL-2

Клетки штамма Е coli SG 20050, содержащие плазмиду piL-2/21, выращивают в 5 мл LB-среды в присутствии 1 мкм митоми- цина С при 37° С до плотности Суспензию клеток центрифугируют при 20° С 2 мин, 5000 об/мин. Надосадочную жидкость удаляют, а клетки ресуспендируют в 400 мкл ТЕ-буфера. К 10 мкл полученной суспензии клеток добавляют равные объемы воды и лизирующего буфера. Смесь выдерживают 3 мин при 100° С, 10 мкл лизата наносят на 15% ПААГ с 1% SDS и проводят электрофорез по Леммли По окончании электрофоре- за пластину геля накрывают нейлоновым фильтром и проводят электроэлюцию 1 ч при силе тока 70 мА Фильтр переносят в 1,5% раствора ВСА и желатина, приготовленный на буфере 3 (25 мМ трис-HCI, рН 8,0, 150 мМ NaCI, 0,05% твин 20), и выдерживают 1 ч при 20° С Затем добавляют мышиные моноклональные антитела к человеческому интерлейкину-2 до концентрации 10 мкг/мл и выдерживают 12-16 ч при 20° С Фильтр тщательно отмывают буфером 3 и инкубиру- ют при 20° С в течение 2 ч с кроличьими антителами против мышиных IgG, конъюги- рованных с пероксидазой хрена. Фильтр отмывают буфером 3, для окрашивания полос

его помещают в 6 мл 0 05% 2-хлорнафтола в 15% водном этаноле, содержащем 80 мМ трис-HCI (рН 7,5) и добавляют 10 мкл 30% перекиси водорода

П р и м е р 6 Определение биологической активности рекомбинантного IL-2

Клетки штамма Е coli SG 20050, содержащие плазмиду plL-2/21, выращивают в 5 мл LB-среды в присутствии 1 мМ митомици- на С при 37° С до плотности Суспензию клеток центрифугируют при 20° С (2 мин, 5000 об/мин) Надосадочную жидкость удаляют, а клетки ресуспендируют в 2 мл фосфатного буфера и разрушают ультразвуком Осадок собирают центрифугированием и растворяют в 2 мл 6М гуанидинхлорида Раствор центрифугируют (15 мин, 10000 об/мин), супернатант диали- зуют против фосфатного буфера 14-16 ч при 4-6° С. Биологическую активность полученного лизата определяют по методу Гиллиса Содержание человеческого IL-2 в клеточном лизате составляет (3-4) 108 ме/л

Формула изобретения

1Рекомбинантная плазмидчая ДНК plL-2/21, кодирующая человеческий интер- лейкин-2, размером 3 72 тыс пои мол м 2,5 Md и содеожащая

-EcoR l-EcoR I - фрагмент ДНК фага М13 rpm размером 0 2 тыс п о с регулятор- ной областью гена rec A Proteus rmrabiiis

-Pst l-Xhol - фрагмент ДНК плазмиды pDSt2+o размером 2,38 тыс п о с терминатором транскрипции t +о и 3 -концевой частью гена устойчивости к ампициллину

-Pst l-EcoR I -фрагмент ДНК плазмиды pBR 322 размером 0 74 тыс по с 5 -концевой частью гена

-Haell-SalGI -фрагмент ДНК плазмиды plL-2, 0,4 тыс по с синтетический геном человеческого IL-2

-генетический маркер Ыа - ген устойчивости к ампициллину,

-уникальные сайты Psf I Smal и Pvull

2Способ конструирования рекомбинан- тной плазмидной ДНК plL-2/21 кодирующей человеческий интерлейкин-2 заключающийся в том, что последовательно лигируют синтетический ген IL-2 человека с искусственным олигонуклеотидом AATTCATGGOGC регуля- торной областью гена rec A Proteus mirabilis а затем с Rstl-Xhol - фрагментом pDSt2+o и трансформации полученной лигазной смесью клеток Е coli M103 с последующим отбором колоний содержащих целевую плаз- мидную ДНК

3. Штамм бактерий Eschenchia coli BKM В-5542 - продуцент человеческого интер- лейкина-2

Использование: молекулярная биология и генетическая инженерия. Сущность изобретения: полученная рекомбинантная плазмидная ДНК plL-2/21 имеет мол. вес 2,5 Md и содержит Pstl-Xhol фрагмент ДНК плазмиды pDST2+o с терминатором транскрипции ID и 3 - концевой частью /3-лак- тамазы, Pstl-EcoRI фрагмент ДНК плазмиды pBR322 с 5 - концевой частью гена /3-пак- тамазы; EcoRI-EcoRI фрагмента фага М13 грлп с промоторно-операторной областью гена rec A. Proteus mirabilis, а также синтетический Haell-SalGI фрагмент ДНК, кодирующий ген интерлейкина-2 человека, адаптированного для эффективной экспрессии в клетках E.coli. Плазмида plL-2/21 сконструирована путем последовательного клонирования фрагментов в векторах pBR322 и pDSt +o, штамм продуцент интерлейкина-2 получен трансформацией клеток E.coli SG 20050 этой рекомбинантной плаз- мидой. Уровень синтеза белка интерлейкина-2 в сконструированном штамме составляет 30-35% от общего количества клеточного белка, что соответствует 45-50 мг/л (3-4 х 108 МЕ/л), 3 с.п.ф-лы. (/