ШТАММ БАКТЕРИЙ MICROCOCCUS VARIANS, ПРОДУЦИРУЮЩИЙ ЭНДОНУКЛЕАЗУ РЕСТРИКЦИИ, УЗНАЮЩУЮ И РАСЩЕПЛЯЮЩУЮ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ НУКЛЕОТИДОВ 5′-TTCGAA-3' Российский патент 1994 года по МПК C12N9/14 C12N9/42 C12R1/265 

Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии, в частности к получению штамма продуцента эндонуклеазы рестрикции, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5'-TTCGAA-3'.

Эндонуклеаза такой специфичности может быть использована для работ по клонированию, физическому картированию генов. Данная эндонуклеаза является удобной моделью для изучения специфичности белок-нуклеиновых взаимодействий.

Известен штамм бактерий Micrococcus varians-продуцент эндонуклеазы Mva 1, узнающей сайт 5'-CC(A/T)GG-3' [1]. Основным недостатком штамма является его неспособность продуцировать рестриктазу, узнающую и расщепляющую последовательность нуклеотидов 5'-TTCGAA-3'.

Известен штамм бактерий Nostoc speci- es, продуцирующий эндонуклеазу рестрикции Nsp V, узнающую и расщепляющую последовательность нуклеотидов 5'-TTCGAA-3' [2] . Основной недостаток штамма - наличие в нем еще четырех эндонуклеаз рестрикции, что значительно усложняет процедуры выделения и очистки целевого фермента.

Наиболее близким к изобретению является штамм бактерии Mastigogladus laminosus - продуцент эндонуклеазы Mla 1, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5'-TTCGAA-3' [3]. Основными недостатками штамма являются требование специальных многокомпонентных сред, специального освещения, длительность культивирования (выход биомассы составляет 10 г/л за 3 недели выращивания).

Технической задачей изобретения является выявление штамма- продуцента, синтезирующего эндонуклеазу рестрикции, способную узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5'-TTCGAA-3', растущего на обычных питательных средах, традиционном оборудовании и не требующего длительного культивирования.

Поставленная цель достигается получением штамма Micrococcus varians16 ВКПМ В-5942 - продуцента эндонуклеазы рестрикции Mva16 1.

Новый штамм выделен в результате систематического поиска продуцентов эндонуклеаз рестрикции среди морских микроорганизмов.

Штамм депонирован и хранится во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов ВНИИгенетика под номером ВКПМ В-5942.

Фермент назван Mva16 1 согласно общепринятой номенклатуре.

Штамм Micrococcus varians обладает следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки: клетки сферические, размером 0,5-0,7 мкм в диаметре, расположенные одиночно, в парах или группами. Неподвижны, не образуют эндоспор. Хорошо растут на обычных питательных средах (СПА, МПБ) при температуре 35^оС. Колонии на СПА желтоватые, слегка выпуклые, округлые, края ровные. Физиолого-биохимические свойства: аэроб, отрицателен по оксидазе. Восстанавливает нитраты, не растет на среде Симмонса, растет при наличии в среде 7,5% NaCl. Гидролизует желатин, крахмал, мочевину.

Хранение штамма осуществляют под вазелиновым маслом или в 30%-ном глицерине при -70^оС.

Выход рестриктазы Mva16 1 - 50000 ед/г сырой биомассы. Определяющими отличиями предлагаемого штамма от штамма-прототипа являются возможность роста на обычных питательных средах, не требует специального освещения и длительного культивирования; высокие выход рестриктазы и активность целевого фермента.

В связи с тем, что в известных научно-технических решениях сведений об аналогичном штамме не обнаружено, можно сделать вывод, что предлагаемый штамм отвечает критерию "существенные отличия".

На чертеже представлена электрофореграмма продуктов гидролиза ДНК фага лямбда-ферментами Mva16 1 и Asu 11(5'-TTCGAA-3').

1-я дорожка-гидролиз Pst 1 (контроль),
2 - дорожка - гидролиз Mva16 1,
3-я дорожка - совместный гидролиз Nva16 1 и Asu 11,
4-я дорожка - гидролиз Asu 11,
5-я дорожка - ДНК фага лямбда (контроль).

П р и м е р 1. Получение биомассы и выделение фермента.

Перед началом работы клетки штамма-продуцента пересевают бактериологической петлей на агаризованную среду. Чашки Петри помещают в термостат на 35^оС. После 10-12 инкубации подросшие клетки пересевают в колбы со свежей питательной средой, состоящей из следующих компонентов, г/л: бактотриптон 10, дрожжевой экстракт 5, хлористый натрий 10, и помещают в термостатированную качалку.

Культивируют при 35^оС, 200 об/мин до достижения стационарной фазы роста (4-5 ч). Клетки осаждают центрифугированием при 4^оС. Выход биомассы за это время культивирования составляет 8 г/л. Выделение осуществляют по методике Bickle, Pirotta, Imber. Выход фермента составляет 50000 ед/г сырой биомассы.

Фермент хранится при -20^оС в глицерине.

П р и м е р 2. Определение специфичности и активности фермента.

Специфичность фермента определяют по картине совместного и параллельного гидролиза субстратной ДНК (чертеж). Идентичность картин гидролиза на 2-4-й дорожках говорит о том, что эти ферменты узнают и расщепляют одинаковую последовательность нуклеотидов 5'-TTCGAA-3'.

Выход фермента Mva16 1 определяют по электрофоретической картине гидролиза ДНК фага лямбда. За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДНК фага лямбда в течение 1 ч при температуре 37^оС. Выход фермента составляет 50000 ед/г, активность 50000 ед/мл.

Поскольку эндонуклеаза рестрикции Nva16 1 имеет сайт узнавания, идентичный сайту прототипа, а культивирование штамма по нескольким параметрам проще, то Mva16 1 может заменить прототип во всех генно-инженерных работах.

Внедрение штамма планируется в НИКТИ биологически активных веществ НПО "Вектор" в 1992-1993 г.

Использование: биотехнология и генная инженерия, может быть использован для работ по клонированию, физическому картированию генов. Сущность изобретения: штамм бактерий Micrococcus varians ВКПМ В-5942 - продуцент рестриктазы Mva 16 1, узнающей и расщепляющей нуклеотидную последовательность 5′-TTCGAA-3' , выделен из морской воды в результате поиска продуцентов рестриктаз, прост в культивировании, не требует специальных многокомпонентных сред, специального освещения и длительного культивирования. Выход фермента составляет 50000 ед/г сырой биомассы, удельная активность целевого фермента 50000 ед/мл. Рестриктаза Mva 16 1 является изошизомером рестриктазы Mla 1 и может заменить последнюю во всех генно-инженерных работах. 1 ил.

Штамм бактерий Micrococcus varians ВКПМ В-5942, продуцирующий эндонуклеазу рестрикции, узнающую и расщепляющую последовательность нуклеотидов 5' - ТТС G АА-3'.