ШТАММ БАКТЕРИЙ KLEBSIELLA AZEANAE - ПРОДУЦЕНТ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ KAZ 48 KI Российский патент 1995 года по МПК C12N9/14 C12N9/14 C12R1/22 

Изобретение относится к области биотехнологии и касается нового штамма бактерий Klebsiella azeanae, который может быть и использования для получения эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы), узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5'-PuGGNC!CPy-3' в составе двухцепочечной ДНК. Рестриктаза Kaz48kI, продуцируемая предлагаемым штаммом, является ложным изошизомером известной рестриктазы DraII и может найти применение в генно-инженерных исследованиях как в экспериментах по конструированию рекомбинантных ДНК in vitro, так и при изучении первичной структуры ДНК.

Известны изошизомеры рестриктазы DraII, выделенные из различных штаммов: Deinococcus radiophillus, Vibrio nereis, Escherichia coli H709c.

Наиболее близким к предлагаемому штамму является штамм Escherichia coli H709c, продуцирующий рестриктазу Есо01091, которая является истинным изошизомером рестриктазы DraII, и узнает и расщепляет последовательность нуклеотидов ДНК 5'-PuG!GNCCPy-3' [1] Выход очищенного фермента Есо0109 составляет 3000 ед на 1 г биомассы клеток.

Задачей изобретения является получение штамма, продуцирующего рестриктазу заданной специфичности с более высоким выходом, быстро растущего на стандартных питательных средах.

Предлагаемый штамм Klebsiella azeanae 48k был получен в результате целенаправленного поиска штаммов продуцентов рестриктаз среди клинических изолятов (г. Киев) при помощи разработанного нами метода тестирования активности в экстрактах, полученных из отдельно взятых колоний, выросших на агаризованной среде, с последующим электрофорезом продуктов расщепления ДНК в агарозном геле. Содержание рестриктазы Kaz48кI в предлагаемом штамме 400000-500000 единиц/на грамм сырой биомассы клеток.

Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов при ИБФМ РАН и хранится в ней под номером ВКМ В-2008Д.

Штамм Klebsiella azeanae ВКМ В-2008Д имеет следующие характеристики.

Культурально-морфологические признаки.

Клетки прямые, палочковидные, размером 0,7-0,8 мкм в поперечнике и 2-3, иногда 5 мкм, в длину, неподвижны. Располагаются одиночно, парами или цепочками. Грамотрицательные, каталазоположительные, оксидазоотрицательные.

Штамм хорошо растет на обычных питательных средах (МПА, МПБ, LB-бульон и LB-агар). При росте на мясо-пептонном агаре или LB-агаре колонии гладкие, круглые, прижатые, блестящие, с ровными краями, сероватого цвета, величиной 1-1,5 мм в диаметре. При росте в жидких средах: в МПБ-бульоне или LB-бульоне образуют ровную интенсивную муть. Кроме этого, штамм может расти на синтетических средах, например М9 (в г/л: NaH₂PO₄ 6, KH₂PO₄ 3, NaCl 0,5, NH₄Cl 1, глюкоза 4, казаминовые кислоты 0,2).

Физиолого-биохимические признаки.

Клетки растут в пределах от 4 до 50^оС, оптимальная температура роста 37^оС, оптимум рН 6,8-7,4. Факультативный анаэроб. В качестве источника углерода используют многие углероды. Лактозу, сахарозу, глюкозу и магннит сбраживают с образованием кислоты и газа. Лизин не декарбоксилируют, образуют уреазу, реакция по аргининдигидролазе положительная. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной и нитратной форме, так и в органической форме в виде пептона, аминокислот. Нитраты восстанавливают до нитритов. Индол не образуют. При росте H₂S не выделяют.

Условия хранения штамма:
Штамм бактерий Klebsiella azeanae ВКМ В-2008Д хранят на чашках и косяках. Пересевы на свежие среды один раз в месяц. Может храниться не менее года в 15% глицерине при -20-70^оС, в лиофильно-высушенном состоянии с сахаро-желатиновым агаром или в полужидкой агаризованной среде LВ (6% агар) под вазелиновым маслом.

П р и м е р 1. Тестирование ферментов рестрикции. Для поиска рестриктазы использовали экспресс-метод, представляющий собой модификацию метода Белавина и соавт. [2] Для этого одну-две большие колонии (около 5 х 10⁶ 1 х 10⁷ клеток) суспендируют в 20 мкл буфера А (20 мМ трис-HCl, рН 7,6, 12,5 мМ ЭДТА, 100 мМ NaCl, 10 мМ 2-меркаптоэтанола), содержащего 10 мг/мл лизоцима, и инкубируют при комнатной температуре (18^оС). Через 30 мин добавляют равный объем буфера В (20 мМ трис-HCl, рН 7,6, 2% тритон Х-100, 10 мМ 2-меркаптоэтанола), и инкубируют еще 60 мин при 4^оС. Клеточную суспензию (1 и 4 мкл) смешивают с 2 мкг ДНК фага диаметр 80 vir в 40 мкл буфера С (10 мМ трис-HCl, рН 7,6, 10 мМ MgCl, 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 50 мМ NaCl). Гидролиз проводят при 37^оС в течение 10 мин. Кроме того, 4 мкл клеточной суспензии дополнительно инкубируют в 40 мкл буфера С без субстрата с целью проверки возможного наличия в растворе экстрахромосомной ДНК. Реакцию останавливают экстракцией равным объемом водонасыщенного фенола. Для электрофоретического анализа используют 20 мкл гидролизата.

П р и м е р 2. Получение и очистка рестриктазы. Культуру клеток Klebsiella azeanae 48k выращивают в 1 л LВ-бульона (5 г дрожжевого экстракта, 10 г NaCl, 10 г бактотриптон на 1 л воды) при 37^оС до титра 2 х 10⁹ кл/мл. Клетки осаждают центрифугированием (6000 об/мин 15 мин). 1 г сырой биомассы суспендируют в 5 мл буфера, содержащего 10 мМ трис-HCl, рН 7,5, 150 мМ NaCl, 10 мМ ЭДТА, 10 мМ 2-меркаптоэтанола. Клетки разрушают ультразвуком, экстракт получают центрифугированием при 2^оС (48000). Для определения активности рестриктазы Kaz48kI готовят серийные разведения супернатанта: 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128 в буфере (10 мМ трис-HCl рН 7,5, 50 мМ NaCl, 10 мМ ЭДТА, 10 мМ 2-меркаптоэтанол). В инкубационную смесь (9 мкл), содержащую 10 мМ трис-HCl, рН 8,0, 50 мМ NaCl, 10 мМ MgCl₂, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ ДТЕ, 1 мкг ДНК фага лямбда, добавляют 1 мкл соответствующего разведения экстракта и инкубируют при 45^оС в течение 1 ч. Результаты гидролиза проверяют с помощью электрофореза в 0,8% агарозном геле.

За единицу активности берут количество фермента, необходимое для полного специфического расщепления 1 мкг ДНК фага лямбда в течение 1 ч. Уровень активности рестриктазы Kaz48kI, определенный в бесклеточном экстракте штамма Klebsiella azeanae, около 400000-500000 ед в пересчете на 1 г сырой биомассы. Рестриктаза Kaz48kI может быть очищена фракционированием клеточного экстракта последовательно на колонках с DEAE целлюлозой (DE-52 Whatman) и фосфоцеллюлозой Р-11 (Whatman) с последующей хроматографией на гидроксилапатите и ДЕ-сферодексе (Рharmacia). Препарат фермента окончательно концентрируют при диализе против буфера: 100 мМ NaCl; 20 мМ трис-HCl (рН 7,6); 7 мМ 2-меркаптоэтанол; 1 мМ ЭДТА, 50% глицерин. Выход очищенного фермента составляет 10000-12000 ед на 1 г сырой биомассы. Очищенный фермент стабилен при -20^оС в течение полугода. При +20^оС рестриктаза Kaz48kI сохраняет 95% своей активности в течение 14 дней, при +37^оС 50% в течение 14 дней, при +65^оС 95% в течение 60 мин. Рестриктаза пригодна для анализа структуры ДНК и для молекулярного клонирования.

П р и м е р 3. Определение последовательности нуклеотидов, узнаваемой рестриктазой Kaz48kI и места гидролиза ДНК. Для определения последовательности узнавания рестриктазы проводят сравнение величин длин фрагментов, полученных экспериментально при гидролизе ДНК фага лямбда рестриктазой с величинами длин фрагментов, рассчитанных на ЭВМ по соответствующим программам для различных последовательностей нуклеотидов. Была обнаружена только одна последовательность 5'-PuGGNCCPy-3', для которой рассчитанные величины фрагментов совпадали с экспериментальными и были локализованы в следующих районах первичной нуклеотидной последовательности ДНК фага лямбда: 2816, 28798, 48474, 48502. Для подтверждения полученных данных проводят картирование участков узнавания рестриктазой Kaz48kI на ДНК pBR322, используя совместный гидролиз рестриктазами: PstI и Kaz48kI, EcoRI и Kaz48kI, BamHI и Kaz48kI, CfrBI и Laz48kI, EcoRII и Kaz48kI.

Показано, что рестриктаза Kaz48kI гидролизует эту ДНК в позициях: 525σ, 1440, 1482, 44345. Для определения места гидролиза ДНК рестриктазой Kaz48kI была использована ДНК pBR322. После отжига с синтетическим праймером (ccw HindIII-16 mer) и реакции полимеризации матрицу обрабатывают эндонуклеазой рестрикции Kaz48kI. Часть пробы вторично подвергают полимеризации и оба полученных препарата исследуют в условиях, предложенных Simcon с соавторами [3] Четыре стандартные секвенирующие реакции проводят согласно протоколу Sanger с соавторами [4]
Таким образом, проведенные опыты позволяют сделать однозначный вывод, что рестриктаза Kaz48kI является ложным изошизомером рестриктазы DraII и узнает последовательность нуклеотидов: -5'-PuGGNC!CPy-3'
Кроме того, полученная рестриктаза Kaz48kI характеризуется следующими оптимальными условиями реакции: рН 7,8-8,0; 45^оС; 0-50 мМ NaCl.

Таким образом, полученный штамм Klebsiella azeanae ВКМ В-2008В, как продуцент специфической эндонуклеазы Kaz48kI, обеспечивает высокий уровень содержания фермента, не менее 400000 ед на 1 г сырого вещества биомассы клеток, что достаточно для получения рестриктазы в препаративных количествах. Выход очищенного фермента составляет 10000-12000 ед. на г биомассы клеток, что 4 раза превышает выход известной рестриктазы Есо0109, выделенной из штамма E coli Н709с, являющегося прототипом предлагаемого.

Использование: биотехнология для получения эндонуклеазы рестрикции KaZ 48KI, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5′-PuGGNC!CPy-3′ Рестриктаза, продуцируемая предлагаемым штаммом, является ложным изошизомером рестриктазы 2ra II и может найти применение в генно-инженерных исследованиях. Сущность изобретения: предлагаемый штамм Klebsiellaazeanal ВКМ В-2008Д выделен из клинических изолятов (г.Киев) и обеспечивает высокий уровень содержания фермента не менее 400000 ед.на 1 г сырого вещества биомассы клеток. Выход очищенного фермента составляет 10000-12000 ед/г биомассы клеток.

Штамм бактерий Klebsiella azeanae ВКМ В-2008 D продуцент эндонуклеазы рестрикции Kaz 48 К1.